一种小分子偶联物及其用途

文档序号：1823254 发布日期：2021-11-12 浏览：26次 >En<

阅读说明：本技术 一种小分子偶联物及其用途 (Small molecule conjugate and application thereof ) 是由王娟于 2021-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种小分子偶联物或其药用盐,结构如通式I所示：A为间隔连接基团；B为可释放连接基团；Y为药物；本发明还提供了一种所述小分子偶联物或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用。(The invention discloses a micromolecule conjugate or medicinal salt thereof, which has a structure shown as a general formula I:)

一种小分子偶联物及其用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种小分子偶联物、其药物组合物及用途。

背景技术

p53基因是研究最广泛的肿瘤抑制基因之一，约50％的人肿瘤细胞中p53因为变异而导致p53蛋白失活，而人体内一些蛋白与p53蛋白的相互作用，也会导致p53蛋白的正常生物功能丧失。其中MDM2(murine double mimute 2，双微体2)是p53的一个最重要的调节蛋白，当两者结合的时候，会使p53蛋白降解。以p53-MDM2蛋白蛋白相互作用为靶点设计全新机制的抗肿瘤药物，是抗肿瘤药物研发领域的热点(Duffy M.J.,et al.Semin CancerBiol.2020,S1044-579X,30160.)。

自首个小分子p53-MDM2抑制剂被报道以来，研究者发现多个骨架的小分子抑制剂，其中RG7112、Idasanutlin、AMG-232、SAR405838、NVP-CGM097、DS-3032b、APG115、HDM201等先后进行临床试验研究(LiuY.,et al.Eur J Med Chem.2019,176,92.)。基于蛋白蛋白相互作用进行小分子抑制剂的设计具有很大的难点，迄今为止，仍未有p53-MDM2小分子抑制剂上市。进展最快的是罗氏公司研发的口服MDM2蛋白抑制剂Idasanutlin，已进入III期临床研究，但遗憾的是Idasanutlin联合化疗药物阿糖胞苷的III期临床试验方案于2020年4月被罗氏公司宣布终止。

尽管针对p53-MDM2靶标的抗肿瘤药物研发存在较大困难，但研究者一直不断努力发现高活性的小分子抑制剂，设计与化疗药物、免疫检查点抑制剂等联合用药的治疗方案。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种小分子偶联物，其结构包含MDM2抑制剂、连接基团和化学治疗药物的偶联物。

本发明的第二目的是提供一种所述小分子偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供了一种小分子偶联物或其药用盐，结构如通式I所示：

A为间隔连接基团；

B为可释放连接基团；

Y为药物，优选为化学治疗药物；

A选自：(n为1～10)、(n为1～10)、糖(如葡萄糖)、亚烷基(如-(CH₂)_n-，n为1～10)、1-亚烷基琥珀酰亚胺-3-基(如n为1～10)、1-(羰基烷基)琥珀酰亚胺-3-基(如n为0～10)或其组合；其中A可以被至少一个取代基取代，所述取代基选自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、羟烷基、氨基、氨烷基、烷基氨烷基、二烷基氨烷基、巯基烷基、烷基硫代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳基、取代的杂芳基、羧基、羧基烷基、羧酸烷基酯、胍基烷基、或由氨基酸及其衍生物和肽取代的羰基或酰胺基或酰胺基烷基；

B包含至少一个由氨基酸形成的连接基团，所述氨基酸选自天然氨基酸或非天然α氨基酸；优选包含有1-20个氨基酸形成的肽连接基团；更优选的，B包括至少一个由天冬氨酸、精氨酸、半胱氨酸、瓜氨酸、缬氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸及其组合的氨基酸形成的二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽、十二肽的连接基团；

或B为生理条件下可断裂的键(pH不稳定键、酸不稳定键、氧化不稳定键或酶不稳定键)的连接基团。如本发明所述，可断裂的键可连接可释放连接基团内的两个相邻原子，和/或在所述可释放连接基团的任一端或两端连接其他连接基团和/或药物Y。在这种可裂解的键连接可释放连接基团内的两个相邻原子的情况下，该键断裂后，所述可释放连接基团断裂为两个或更多个片段。可裂解键的不稳定可进行调整，例如通过在可裂解位置或其附件的取代改变，例如包括毗邻可裂解二硫键的α分支化，同系化形成可水解的部分缩酮或缩醛的烷氧基等。

优选的，所述B选自以下结构的一种或其组合：

其中，n为0、1、2、3或4；R为-(CH₂)n-、-OOCCH₂-，n为1～10；

Z为-O-、-CH₂-或-NH-；W为O或S；

R₁为氢、C₁～C₁₀烷基、任选地取代的酰基或氨基保护基(如Boc、Fmoc、Cbz、苄基、三苯甲基等)。

所述Y为化学治疗药物，包括药物活性化合物，这些药物可通过活性基团如羟基、氨基等与B连接。所述药物活性化合物可为本领域已知药物或其衍生形式，所述药物为细胞毒性、提高肿瘤通透性、抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡、降低细胞中抗凋亡活性、增强细胞坏死的药物。适用本发明的药物包括但不限于激素、抗生素、抗微生物药、抗病毒药、抗癌药。所述细胞毒性的药物例如：环丙基苯并[e]吲哚酮类似物或其衍生物、开环-环丙基苯并[e]吲哚酮类似物、O-Ac-开环-环丙基苯并[e]吲哚酮类似物或其衍生物、Dolastatins类、Auristatin类、Tubulysin类、Combretastatin类、美登素类、DM1、埃博霉素类、紫杉醇及其衍生物、长春碱及其类似物、喜树碱及其类似物、秋水仙碱及其类似物、Daunorubicin类、Rhizomycin类、环磷酰胺、甲氨喋呤、博来霉素类、Temsirolimus类、丝裂霉素类、微管抑制剂、吡咯并苯二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepines，PBD)二聚体类、环丙基苯并[e]吲哚酮类、Calicheamicin类、沙蟾毒精及其衍生物、蟾毒灵及其衍生物。其他可适用于本发明的药物包括大环内酯类抗肿瘤药物，化疗药如烷化剂氮芥、亚硝基脲、白消安、苯丙酸氮芥、卡铂、顺铂和其他铂类化合物，抗代谢药如阿糖胞苷、嘌呤类似物、嘧啶类似物及青霉素、头孢菌素、万古霉素、红霉素、克林霉素、利福平、氯霉素、氨基糖苷类抗生素和阿昔洛韦、三氟尿苷、更昔洛韦、齐多夫定、金刚烷胺、利巴韦林、吉西他滨和任何本领域认可的抗微生物化合物。

进一步的，本发明所述Y为Temsirolimus类、开环-环丙基苯并[e]吲哚酮类似物、吡咯并苯二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepines，PBD)二聚体类、Calicheamicin类、喜树碱及其类似物、紫杉醇及其衍生物、长春碱及其类似物、Dolastatins类、Auristatin类、Tubulysin类、Combretastatin类、美登素类、DM1、埃博霉素类、丝裂霉素类、Daunorubicin类化合物、沙蟾毒精及其衍生物或蟾毒灵及其衍生物。

更进一步的，本发明所述Y为开环-环丙基苯并[e]吲哚酮类似物、吡咯并苯二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepines，PBD)二聚体类、Calicheamicin类、喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)、依喜替康(Exatecan)及其衍生物、7-环己基-21-氟喜树碱、DAVLBH、Tubulysin B、MMAE、MMAF、MMAF衍生物、DM1、紫杉醇及其衍生物、埃博霉素B、丝裂霉素C、沙蟾毒精及其衍生物、蟾毒灵及其衍生物、长春新碱、柔红霉素、多柔比星或表柔比星。

更进一步优选地，A-B选自以下结构中的一种：

优选的，所述小分子偶联物的结构选自以下结构中的一种：

Y选自

最优选的，所述小分子偶联物的结构选自以下结构中的一种：

本发明的小分子偶联物可按照常规方法制备为药用盐的形式。

本发明所述小分子偶联物的药用盐，由药学上可接受的无机酸和有机酸所形成的盐，其中较优的无机酸包括：盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；较优的有机酸包括：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、萘二磺酸(1，5)、亚细亚酸、甘珀酸、甘草次酸、齐墩果酸、山楂酸、熊果酸、科罗索酸、白桦酸、乳香酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、氨基酸。

本发明的第二方面提供了一种所述小分子偶联物或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明化合物的药理活性使其可以用于制备抗肿瘤、治疗心血管疾病、抗炎及抗神经系统疾病的药物(RialdiA,et al,Science,2016,352,6289；Pan P,J Med Chem,2018,61,8613.)。

本发明的小分子偶联物具有抗肿瘤活性，所述肿瘤包括食道、胃、肠、直肠、口腔、咽、喉、肺、结肠、乳腺、子宫、子宫内膜、卵巢、前列腺、睾丸、膀胱、肾、肝、胰腺、骨、结缔组织、皮肤、眼、脑和中枢神经系统等部位发生的癌症，以及甲状腺癌、白血病、霍金氏病、淋巴瘤和骨髓瘤等。尤其是食道癌、胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、肝癌、脑胶质瘤。

本发明的第三方面提供了一种药物组合物，包括所述小分子偶联物或其药用盐，所述小分子偶联物或其药用盐作为药物活性成分；或所述药物组合物还包括至少一种治疗剂，如化学治疗剂、免疫检查点抑制剂、炎症调节剂、抗高胆固醇血症剂、抗感染剂或放疗药物等(Fang D.,et al.J Immunother Cancer,2019,7,327；Yi H.et al.J Exp ClinCancer Res,2018,37,97)。

所述药物组合物可以是固体形式或是液体形式，还可用于制备下列药物：心脑血管疾病、炎症和神经系统疾病的治疗药物等。

本发明的第四方面提供了一种药物制剂，包括所述小分子偶联物或其药用盐。

本发明所述小分子偶联物可以和药剂学上的常规药用辅料制成药物制剂。

所述药物制剂为：小容量注射剂、中容量注射剂、大容量注射剂、粉针注射剂、注射用乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、膏剂、霜剂、贴剂、搽剂、粉剂、喷雾剂、植入剂、滴剂、栓剂、软膏剂；各类纳米制剂；脂质体；相应的脂质体主要地制成以上所提及的注射剂。

本发明使用的术语“烷基”是指具有一个到十二个碳原子的饱和直链或支链的一价烃基，其中该烷基可任选地被如下所述的一个或多个取代基独立地取代。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、1-庚基、1-辛基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。

本发明使用的术语“环烷基”是指具有三到十个碳原子的单价非芳香族饱和或部分饱和的环烃原子团。其实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环十一烷基、环十二烷基。术语“环烷基”还包括多环的(例如，二环和三环)环烷基结构，其中多环的结构任选地包括与饱和或部分不饱和的环烷基或杂环基或芳基或杂芳基环稠合的饱和或部分不饱和的环烷基。具有7到12个原子的双环碳环可以布置为例如双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统，或布置为桥接系统例如双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]庚辛烷和双环[3.2.2]壬烷。

本发明使用的术语“杂烷基”是指具有一个到十二个碳原子的饱和直链或支链的一价烃基，其中至少一个碳原子被选自氮、氧和硫的杂原子代替，并且其中该基团可为碳基团或杂原子基团(即，该杂原子可以出现在该基团的中间或末端)。杂烷基可任选地被一个或多个本发明所述的取代基独立地取代。术语“杂烷基”还包括烷氧基和杂烷氧基。

本发明使用的术语“杂环基”是指具有3到8个环原子的饱和或部分不饱和的碳环基团，其中至少一个环原子为独立地选自氮、氧和硫的杂原子，其余的环原子为碳原子，其中一个或多个环原子可任选地被一个或多个如下所述的取代基独立地取代。该基团可为碳基团或杂原子基团。术语“杂环基”还包括杂环烷氧基，还包括其中杂环基与饱和、部分不饱和的、或完全不饱和的(即，芳香族的)碳环或杂环稠合的基团。杂环基的实例包括但不限于吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉基、4-硫代吗啉基、噻噁烷基(thioxanyl)、哌嗪基、高哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、氧氮杂基(oxazepinyl)、二氮杂基、硫氮杂基(thiazepinyl)、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二氧杂环己基、1,3-二氧杂环戊基、吡唑啉基、二硫杂环己基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂双环[3.1.0]己烷、3-氮杂双环[4.1.0]庚烷基、氮杂双环[2.2.2]己烷基、3H-吲哚基、喹嗪基和N-吡啶基脲。螺环部分也被包括在该定义的范围内。杂环基可为C-连接的或N-连接的，只要其是可能的即可。例如，由吡咯衍生的基团可为吡咯-1-基(N-连接的)或吡咯-3-基(C-连接的)。此外，有咪唑衍生的基团可为咪唑-1-基(N-连接的)或咪唑-3-基(C-连接的)。其中2个环碳原子被氧代(C＝O)部分取代的杂环基团的实例为二氢异吲哚-1,3-二酮基和1,1-二氧代硫代吗啉基。本发明中的杂环基基团可为未被取代的，或者按照说明在一个或多个可取代位置被各种基团取代。

本发明使用的术语“芳基”是指含有至少一个芳香族烃环的任选经取代的单环或多环基团或环系统，例如但不限于：苯基、萘基、芴基、薁基、蒽基、菲基、芘基、联苯和联三苯。

本发明使用的术语“杂芳基”是指含有至少一个具有一或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的芳香族环的任选经取代的单环或多环基团或环系统，单环杂芳基的实例，例如但不限于呋喃基、咪唑基、异噻唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、四唑基、三嗪基和三唑基。双环杂芳基的实例，例如但不限于苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并异噁唑基、苯并吡喃基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并三唑基、苯并噁唑基、呋喃并吡啶基、咪唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、吲哚嗪基、吲哚基、吲唑基、异苯并呋喃基、异苯并噻吩基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、萘啶基、噁唑并吡啶基、酞嗪基、喋啶基、嘌呤基、吡啶并吡啶基、吡咯并吡啶基、喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、噻二唑并嘧啶基和噻吩并吡啶基。三环杂芳基的实例，例如但不限于吖啶基、苯并吲哚基、咔唑基、二苯并呋喃基、呸啶基、啡啉基、啡啶基、啡呻嗪基、啡嗪基、啡噻嗪基、啡噁嗪基和呫吨基。

本发明使用的术语“芳基烷基”是指被一个或多个芳基部分(如上述定义的)取代的烷基(如上述定义的)。芳基烷基的实例包括芳基-C_1-3-烷基，例如但不限于：苄基、苯基乙基等。

本发明使用的术语“杂芳基烷基”是指被杂芳基部分(如上述定义的)取代的烷基部分(如上述定义的)。杂芳基烷基的实例包括5元或6元杂芳基-C_1-3-烷基，例如但不限于噁唑基甲基、吡啶基乙基等。

本发明使用的术语“杂环基烷基”是指被杂环基部分(如上述定义的)取代的烷基部分(如上述定义的)。杂环基烷基的实例包括5元或6元杂芳基-C_1-3-烷基，例如但不限于四氢吡喃基甲基。

本发明使用的术语“被取代的烷基”是指一个或多个氢原子各自独立地被取代基代替的烷基。典型的取代基包括但不限于F、Cl、Br、I、CN、CF₃、OR、R、＝O、＝S、＝NR、＝N⁺(O)(R)、＝N(OR)、＝N⁺(O)(OR)、＝N-NRR′、-C(＝O)R、-C(＝O)OR、-C(＝O)NRR′、-NRR′、-N⁺RR′R″、-N(R)C(＝O)R′、-N(R)C(＝O)OR′、-N(R)C(＝O)NR′R″、-SR、-OC(＝O)R、-OC(＝O)OR、-OC(＝O)NR′R″、-OS(O)₂OR、-OP(＝O)(OR)₂、-OP(OR)₂、-P(＝O)(OR)₂、-P(＝O)(OR)NR′R″、-S(O)R、-S(O)₂R、-S(O)₂NR、-S(O)(OR)、-S(O)₂(OR)、-SC(＝O)R、-SC(＝O)OR、＝O和-SC(＝O)NR′R″；其中每个R、R′和R″独立地选自氢、氘、烷基、烯基、炔基、芳基和杂环基。如上定义的烯基、炔基、烯丙基、饱和或部分不饱和的环烷基、杂烷基、杂环基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂环基烷基、环烷基烷基、芳基和杂芳基也可以类似地被取代。

术语“卤素”本文中使用的包括氟、溴、氯、碘。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明的化合物经肿瘤细胞高表达的酶选择性代谢后，释放出细胞毒药物和p53-MDM2小分子抑制剂，从而起到双重抗肿瘤作用。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1

化合物I-1的制备

将化合物1(250mg，采购于平湖正远公司)和5mL干燥的DMF加入到25mL烧瓶中，搅拌溶解后加入EDCI(85mg)和HOBt(60mg)，室温反应30分钟。然后加入化合物2(196mg)，室温反应过夜。将反应液倒入50mL冰水中，乙酸乙酯萃取(20mL×3)，无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂，柱色谱分离得360mg无色液体化合物3(二氯甲烷:甲醇＝100:2)，收率98.1％。¹H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:10.41(s,1H),8.48(t,J＝5.5Hz,1H),8.32(d,J＝8.4Hz,1H),7.73(t,J＝7.0Hz,1H),7.61–7.51(m,3H),7.49(d,J＝8.5Hz,1H),7.37(dt,J＝10.3,7.3Hz,3H),4.62–4.56(m,2H),4.37(s,1H),3.99–3.89(m,4H),3.60–3.44(m,16H),3.44–3.38(m,2H),2.40(t,J＝6.2Hz,2H),1.68–1.61(m,1H),1.38(s,9H),1.27(d,J＝13.9Hz,1H),0.98(s,9H).

将化合物3(140mg)、5mL二氯甲烷和300μL三氟乙酸加入到5mL烧瓶，室温反应过夜。减压蒸去溶剂得100mg白色固体化合物4，收率为76.3％。¹H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:12.16(s,1H),10.42(s,1H),8.49(t,J＝5.5Hz,1H),8.33(d,J＝8.3Hz,1H),7.74(t,J＝7.0Hz,1H),7.61–7.53(m,3H),7.50(d,J＝8.5Hz,1H),7.38(dt,J＝8.9,6.9Hz,3H),4.61(s,2H),4.38(s,1H),4.01–3.89(m,4H),3.59(t,J＝6.3Hz,2H),3.47(ddd,J＝19.9,17.4,14.8Hz,17H),2.44(t,J＝6.4Hz,2H),1.66(dd,J＝13.7,10.1Hz,1H),0.99(s,9H).

将化合物4(400mg)、5mLDMF和242μL DIPEA加入到25mL烧瓶中，室温搅拌30分钟。依次加入HATU(350mg)和化合物5(211mg，参考文献Wei B.,et al.J Med Chem,2018,61,989制备)，室温反应过夜。将反应液倒入50mL冰水中，乙酸乙酯萃取(20mL×3)，20mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂，柱色谱分离得420mg白色固体化合物6(二氯甲烷:甲醇＝100:5)，收率82.0％。¹H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:10.42(s,1H),9.91(s,1H),8.51(t,J＝5.8Hz,1H),8.32(d,J＝8.4Hz,1H),8.11(d,J＝7.8Hz,1H),7.89(d,J＝8.7Hz,1H),7.74(t,J＝6.9Hz,1H),7.65–7.46(m,6H),7.43–7.32(m,3H),7.23(d,J＝8.5Hz,2H),5.99(s,1H),5.42(s,2H),5.10(t,J＝5.7Hz,1H),4.59(d,J＝5.9Hz,2H),4.46–4.32(m,4H),4.26–4.19(m,1H),4.11(q,J＝5.3Hz,2H),4.00–3.91(m,4H),3.64–3.39(m,18H),2.98(ddd,J＝46.1,13.1,6.5Hz,2H),2.47(t,J＝6.8Hz,1H),2.41–2.35(m,1H),2.03–1.89(m,2H),1.06(t,J＝7.0Hz,1H),0.98(s,9H),0.89–0.76(m,8H).ESI HRMS calcdC₆₀H₇₇C_l2F₂N₉O₁₂[M+H]⁺m/z,1124.5037；found 1124.5105.

将化合物6(420mg)、10mL THF和118μL吡啶加入到25mL烧瓶中，冰水浴下搅拌15分钟。然后加入对硝基氯甲酸苯酯(137mg)，缓慢升温至室温反应过夜。减压蒸去溶剂，柱色谱分离得250mg白色固体化合物7(二氯甲烷:甲醇＝100:10)，收率52.5％。ESI HRMS calcdC₆₇H₈₀C_l2F₂N₁₀O₁₆[M+H]⁺m/z,1389.5099；found 1389.5178.

将化合物7(50mg)、2mL DMF和化合物8(23mg，按照公开号为CN110483608A的专利申请中实施例7的方法制备)加入到5mL烧瓶中，室温搅拌30分钟。依次加入HOBt(1mg)和29μL吡啶，室温反应过夜。将反应液倒入50mL冰水中，乙酸乙酯萃取(20mL×3)，20mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂，柱色谱分离得28mg白色固体化合物I-1(二氯甲烷:甲醇＝100:10)，收率43.7％。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ10.44(s,1H),10.03(s,1H),8.53(s,1H),8.34(d,J＝8.4Hz,1H),8.15(d,J＝7.2Hz,1H),7.90(d,J＝8.6Hz,1H),7.84(d,J＝9.6Hz,1H),7.76(t,J＝6.8Hz,1H),7.56(ddd,J＝38.3,22.5,8.3Hz,8H),7.45–7.29(m,6H),6.35(d,J＝9.8Hz,1H),6.01(s,1H),5.77(s,1H),5.39(d,J＝63.3Hz,2H),5.02(d,J＝16.9Hz,3H),4.88(s,1H),4.62(s,3H),4.41(s,2H),4.33–4.22(m,2H),4.03–3.90(m,6H),3.61(d,J＝6.2Hz,2H),3.58–3.46(m,16H),3.46–3.42(m,4H),3.00(dd,J＝47.7,6.4Hz,2H),2.48(d,J＝7.3Hz,2H),2.43–2.35(m,1H),2.00(dd,J＝21.4,9.2Hz,3H),1.93–1.81(m,4H),1.81–1.57(m,9H),1.46(s,2H),1.42–1.18(m,13H),1.12(s,4H),0.99(s,10H),0.91–0.78(m,11H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ213.74,171.60,171.50,171.05,170.78,166.03,161.62,159.35,154.91,154.63,150.69,147.96,147.64,139.14,131.90,131.43,130.47,130.07,129.75,129.07,128.97,126.09,125.75,121.33,120.52,119.67,119.49,117.78,117.49,115.10,110.07,84.62,73.62,71.47,70.23,70.18,70.15,70.09,69.93,69.45,67.37,66.65,65.09,63.91,63.71,62.64,57.96,56.27,55.36,53.58,50.62,44.36,43.66,39.10,36.97,36.38,33.12,32.37,31.05,30.55,29.96,29.74,29.48,28.13,27.28,26.73,25.93,23.84,21.74,19.63,18.56,17.75.ESI HRMS calcdC₉₀H₁₁₅Cl₂F₂N₁₁O₂₀[M+H]⁺m/z,1778.7655；found 1778.7738.

实施例2

化合物I-2的制备

按照实施例1的方法，以3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸代替化合物2(1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸)，得化合物I-2。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ10.41(s,1H),9.98(s,1H),8.48(t,J＝5.6Hz,1H),8.32(d,J＝8.5Hz,1H),8.10(d,J＝7.4Hz,1H),7.88–7.80(m,2H),7.73(t,J＝6.9Hz,1H),7.59(dd,J＝12.6,9.3Hz,5H),7.53(t,J＝7.6Hz,1H),7.49(d,J＝8.4Hz,1H),7.39(t,J＝8.5Hz,1H),7.37–7.33(m,2H),7.30(d,J＝8.6Hz,2H),6.33(d,J＝9.7Hz,1H),5.97(s,1H),5.40(s,2H),5.02(s,2H),4.96(s,1H),4.86(s,1H),4.62–4.57(m,2H),4.53(d,J＝4.8Hz,1H),4.41–4.34(m,2H),4.28(dd,J＝10.9,4.8Hz,1H),4.25–4.20(m,1H),4.00–3.90(m,5H),3.59(dd,J＝11.6,6.1Hz,2H),3.55–3.45(m,11H),3.41(dd,J＝17.8,12.1Hz,10H),3.02(dd,J＝13.5,6.6Hz,1H),2.94(dd,J＝13.2,6.7Hz,1H),2.48–2.43(m,2H),2.41–2.34(m,1H),1.97(dd,J＝13.5,6.7Hz,2H),1.87(dd,J＝28.6,14.7Hz,4H),1.73(t,J＝11.2Hz,3H),1.68–1.57(m,5H),1.43(d,J＝10.4Hz,2H),1.33(d,J＝17.6Hz,2H),1.27–1.19(m,4H),1.10(s,3H),0.98(s,9H),0.86(d,J＝6.8Hz,3H),0.83(d,J＝6.8Hz,3H),0.81(s,3H).HRMS(ESI,positive)m/z calcdfor C₈₈H₁₁₁Cl₂F₂N₁₁O₁₉[M+H]⁺:1734.7481；found 1734.7400.

实施例3

化合物I-3的制备

按照实施例1的方法，以紫杉醇代替得25mg白色固体化合物I-3。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ10.41(s,1H),10.04(s,1H),9.27(d,J＝8.5Hz,1H),8.50(t,J＝5.6Hz,1H),8.32(d,J＝8.4Hz,1H),8.14(d,J＝7.4Hz,1H),8.02–7.96(m,2H),7.87(d,J＝8.7Hz,1H),7.84–7.80(m,2H),7.73(dd,J＝13.3,6.9Hz,2H),7.64(t,J＝7.7Hz,2H),7.62–7.56(m,4H),7.56–7.52(m,2H),7.51–7.42(m,7H),7.39(t,J＝8.5Hz,1H),7.37–7.33(m,2H),7.31(d,J＝8.7Hz,2H),7.19(dd,J＝7.4,4.8Hz,1H),6.31(s,1H),5.98(s,1H),5.84(t,J＝9.1Hz,1H),5.54(t,J＝8.7Hz,1H),5.42(d,J＝7.2Hz,3H),5.36(d,J＝8.9Hz,1H),5.14(s,2H),4.92(t,J＝8.9Hz,2H),4.65(s,1H),4.59(d,J＝5.9Hz,2H),4.39(d,J＝5.7Hz,2H),4.26–4.22(m,1H),4.13(dd,J＝17.8,7.0Hz,1H),4.02(dd,J＝16.9,8.3Hz,2H),3.98–3.90(m,4H),3.63–3.56(m,3H),3.48(dddd,J＝21.1,16.4,9.0,3.9Hz,17H),2.99(ddd,J＝19.4,13.3,6.5Hz,2H),2.47(t,J＝7.0Hz,1H),2.41–2.30(m,2H),2.26(s,3H),2.12(s,3H),1.97(dq,J＝13.3,6.7Hz,1H),1.82(s,3H),1.75–1.57(m,4H),1.56–1.49(m,4H),1.45(s,1H),1.36(d,J＝5.0Hz,1H),1.27(d,J＝13.5Hz,1H),1.04(s,3H),1.01(s,3H),0.97(s,9H),0.86(d,J＝6.7Hz,3H),0.83(d,J＝6.8Hz,3H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ171.63,171.49,170.76,170.15,169.41,169.23,166.84,166.02,159.35,139.64,134.53,133.96,132.01,131.44,130.47,130.41,130.04,129.76,129.21,129.14,128.79,128.05,127.86,126.09,125.74,120.51,119.99,119.49,117.77,117.49,110.08,84.09,80.75,77.62,77.16,75.76,75.19,74.96,70.87,70.23,70.18,70.15,70.09,69.92,69.44,67.37,65.08,63.67,57.94,57.87,56.27,54.40,53.62,50.62,46.56,44.36,43.42,36.99,36.38,34.84,31.04,30.54,29.96,29.69,27.29,26.80,22.99,21.82,21.13,19.63,18.56,14.38,10.23.ESI HRMS calcd C₁₀₈H₁₂₉Cl₂F₂N₁₀O₂₇[M+H]⁺m/z,2103.8139；found 2103.8212.

实施例4

化合物I-4的制备

按照实施例1的方法，以(按照公开号为CN102532235A的专利申请中实施例15的方法制备)代替得30mg淡绿色固体化合物I-4。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ10.41(s,1H),9.98(s,1H),8.50(t,J＝5.6Hz,1H),8.32(d,J＝8.4Hz,1H),8.11(d,J＝7.5Hz,1H),7.94(dd,J＝9.7,2.5Hz,1H),7.87(d,J＝8.7Hz,1H),7.73(t,J＝6.9Hz,1H),7.58(dd,J＝11.2,5.1Hz,4H),7.55–7.51(m,2H),7.50–7.47(m,1H),7.39(t,J＝8.4Hz,1H),7.37–7.33(m,2H),7.27(dd,J＝14.6,8.4Hz,3H),6.29(d,J＝9.9Hz,1H),5.97(s,1H),5.41(s,2H),4.94(s,2H),4.84(s,1H),4.59(d,J＝6.1Hz,2H),4.42–4.34(m,2H),4.25–4.20(m,1H),4.16(s,1H),3.98–3.91(m,4H),3.88(d,J＝13.3Hz,2H),3.58(dt,J＝9.4,4.8Hz,2H),3.55–3.45(m,14H),3.41(dd,J＝11.7,5.9Hz,2H),3.06–2.90(m,3H),2.47(d,J＝7.2Hz,2H),2.38(dd,J＝13.4,7.1Hz,1H),2.11–1.88(m,4H),1.83–1.67(m,5H),1.61(dt,J＝17.2,11.8Hz,7H),1.54–1.29(m,10H),1.29–1.15(m,6H),1.06(s,2H),0.98(s,9H),0.89(s,3H),0.86(d,J＝6.8Hz,3H),0.82(d,J＝6.8Hz,3H),0.60(s,3H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ171.03,170.92,170.45,170.19,165.43,158.76,155.22,153.91,149.12,147.39,147.32,130.87,129.91,129.50,128.58,125.52,125.19,122.65,119.95,118.81,116.92,114.09,109.51,83.31,70.41,69.66,69.62,69.58,69.52,69.36,68.89,66.81,64.88,64.52,63.15,57.39,55.70,52.99,50.05,48.49,47.95,47.41,43.79,42.12,41.11,36.87,35.82,34.76,31.91,30.46,30.17,29.98,29.40,29.17,28.38,26.73,26.23,24.63,23.69,21.01,20.92,19.07,17.99,16.56.ESIHRMS calcd C₉₁H₁₁₉Cl₂F₂N₁₁O₁₈[M+H]⁺m/z,1762.8080；found 1762.8152.

实施例5

化合物I-5的制备

按照实施例1的方法，分别以代替和3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸代替化合物2(1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸)，得化合物I-5。¹HNMR(600MHz,DMSO)δ10.40(s,1H),9.96(s,1H),8.48(s,1H),8.31(d,J＝8.3Hz,1H),8.08(d,J＝7.8Hz,1H),7.95–7.91(m,1H),7.85(d,J＝8.6Hz,1H),7.72(d,J＝7.2Hz,1H),7.60–7.56(m,4H),7.55–7.51(m,2H),7.48(d,J＝6.6Hz,1H),7.39(t,J＝8.5Hz,1H),7.36–7.33(m,2H),7.28(d,J＝8.8Hz,2H),7.23(s,1H),6.28(d,J＝9.3Hz,1H),5.96(s,1H),5.40(s,2H),4.93(s,2H),4.84(s,1H),4.59(d,J＝5.9Hz,2H),4.38(s,2H),4.24–4.20(m,1H),4.14(s,1H),3.98–3.91(m,4H),3.86(s,2H),3.61–3.56(m,2H),3.49(tt,J＝11.7,6.2Hz,11H),3.41(d,J＝5.9Hz,2H),3.01(s,1H),2.94(s,1H),2.45(d,J＝6.7Hz,2H),2.37(d,J＝14.8Hz,2H),2.07(s,2H),1.95(dd,J＝18.6,12.2Hz,2H),1.78(s,5H),1.61(d,J＝27.6Hz,7H),1.49(s,4H),1.36(d,J＝29.9Hz,6H),1.23(t,J＝15.4Hz,7H),0.97(s,9H),0.89(d,J＝9.2Hz,3H),0.85(d,J＝6.7Hz,3H),0.82(d,J＝6.8Hz,3H),0.59(s,3H).HRMS(ESI,positive)m/z calcd for C₈₉H₁₁₅Cl₂F₂N₁₁O₁₇[M+H]⁺:1718.7896；found 1718.7890.

实施例6

化合物I-6的制备

按照实施例1的方法，以丝裂霉素C代替得25mg紫色固体化合物I-6。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ10.41(s,1H),9.99(s,1H),8.50(t,J＝5.5Hz,1H),8.32(d,J＝8.4Hz,1H),8.12(d,J＝7.4Hz,1H),7.87(d,J＝8.7Hz,1H),7.74(t,J＝6.8Hz,1H),7.63–7.52(m,5H),7.49(dd,J＝8.4,1.5Hz,1H),7.40(t,J＝8.5Hz,1H),7.37–7.34(m,2H),7.31(d,J＝8.6Hz,2H),7.06(s,1H),6.64(d,J＝95.7Hz,2H),5.97(s,1H),5.41(s,2H),4.96(dd,J＝34.0,12.4Hz,2H),4.72(dd,J＝10.5,4.5Hz,1H),4.59(d,J＝5.7Hz,2H),4.41–4.35(m,2H),4.23(dd,J＝7.7,6.0Hz,2H),3.99–3.89(m,5H),3.63–3.56(m,3H),3.55–3.37(m,20H),3.13(s,3H),3.05–2.91(m,2H),2.47(dd,J＝14.3,7.1Hz,1H),2.37(dd,J＝13.6,7.2Hz,1H),1.96(dd,J＝13.5,6.7Hz,1H),1.78–1.62(m,5H),1.58(d,J＝9.4Hz,1H),1.39(d,J＝48.5Hz,2H),1.27(d,J＝13.5Hz,1H),0.98(s,9H),0.84(dd,J＝20.0,6.7Hz,6H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ177.09,176.26,171.58,171.50,171.04,170.73,166.01,159.33,159.14,157.03,154.94,149.25,147.96,130.47,130.06,129.74,129.45,129.06,126.44,126.08,125.74,120.51,119.39,118.12,117.93,117.77,117.48,110.07,110.02,105.78,103.36,70.22,70.17,70.14,70.08,69.91,69.44,67.93,67.37,65.08,63.86,63.71,61.00,57.91,56.27,53.56,50.63,49.75,48.98,44.35,43.39,42.28,36.38,31.05,30.54,29.96,29.75,27.25,19.63,18.55,8.79.ESI HRMS calcdC₇₆H₉₃Cl₂F₂N₁₃O₁₈[M+H]⁺m/z,1584.6107；found 1584.6179.

实施例7

化合物I-7的制备

按照实施例1的方法，分别以和1-氨基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一-21-酸代替和化合物2(1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸)，得化合物I-7。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ10.41(s,1H),9.97(s,1H),8.48(t,J＝5.8Hz,1H),8.32(d,J＝8.4Hz,1H),8.10(d,J＝7.3Hz,1H),7.93(dd,J＝9.7,2.4Hz,1H),7.86(d,J＝8.5Hz,1H),7.73(t,J＝6.6Hz,1H),7.58(dd,J＝11.3,5.1Hz,4H),7.56–7.51(m,2H),7.49(dd,J＝8.5,1.7Hz,1H),7.39(t,J＝8.5Hz,1H),7.37–7.33(m,2H),7.26(dd,J＝18.5,8.2Hz,3H),6.29(d,J＝9.7Hz,1H),5.97(s,1H),5.40(s,2H),4.94(s,2H),4.84(s,1H),4.61–4.57(m,2H),4.37(s,2H),4.25–4.19(m,1H),4.15(s,1H),3.99–3.91(m,4H),3.88(d,J＝12.6Hz,2H),3.62–3.57(m,2H),3.55–3.46(m,22H),3.44–3.39(m,2H),3.02(dd,J＝13.6,6.7Hz,1H),2.94(dd,J＝13.0,6.3Hz,1H),2.48–2.44(m,2H),2.38(t,J＝6.3Hz,1H),2.10–2.01(m,2H),1.99–1.89(m,2H),1.75(d,J＝32.6Hz,5H),1.65–1.55(m,6H),1.50(t,J＝18.9Hz,4H),1.36(dd,J＝43.6,13.5Hz,6H),1.29–1.14(m,8H),1.08(s,2H),0.98(s,9H),0.89(s,3H),0.86(d,J＝6.8Hz,3H),0.82(d,J＝6.7Hz,3H),0.60(s,3H).HRMS(ESI,positive)m/z calcd for C₉₅H₁₂₇Cl₂F₂N₁₁O₂₀[M+H]⁺:1850.8682；found1850.8677.

实施例8

化合物I-8的制备

按照实施例1的方法，以1-氨基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一-21-酸代替化合物2(1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸)，得化合物I-8。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ10.40(s,1H),9.98(s,1H),8.47(t,J＝5.6Hz,1H),8.32(d,J＝8.4Hz,1H),8.10(d,J＝7.5Hz,1H),7.87–7.80(m,2H),7.73(t,J＝6.8Hz,1H),7.61–7.56(m,5H),7.53(t,J＝7.0Hz,1H),7.51–7.47(m,1H),7.39(t,J＝8.4Hz,1H),7.37–7.33(m,2H),7.31(d,J＝8.6Hz,2H),6.33(d,J＝9.7Hz,1H),5.96(d,J＝5.8Hz,1H),5.40(s,2H),5.02(s,2H),4.96(s,1H),4.86(s,1H),4.61–4.57(m,2H),4.53(d,J＝4.8Hz,1H),4.39(dd,J＝13.5,8.0Hz,2H),4.28(dd,J＝11.1,4.9Hz,1H),4.23(dd,J＝8.5,6.8Hz,1H),4.00–3.90(m,5H),3.63–3.57(m,2H),3.56–3.46(m,23H),3.44–3.36(m,8H),3.02(dd,J＝13.3,6.6Hz,1H),2.94(dd,J＝12.9,6.4Hz,1H),2.47(t,J＝7.0Hz,2H),2.41–2.35(m,1H),2.03–1.94(m,2H),1.92–1.82(m,4H),1.73(t,J＝11.5Hz,3H),1.63(ddd,J＝24.4,14.0,9.7Hz,5H),1.43(d,J＝9.8Hz,2H),1.35(dd,J＝24.4,11.4Hz,2H),1.30–1.19(m,5H),1.10(s,3H),0.98(s,9H),0.86(d,J＝6.8Hz,3H),0.83(d,J＝6.8Hz,3H),0.81(s,3H).HRMS(ESI,positive)m/z calcd for C₉₄H₁₂₃Cl₂F₂N₁₁O₂₂[M+H]⁺:1866.8268；found 1186.8262.

实施例9

化合物I-9的制备

按照实施例1的方法，以10-苄基-7-乙基喜树碱代替得化合物I-9。¹H NMR(300MHz,DMSO)δ10.41(s,1H),10.03(s,1H),8.50(s,1H),8.31(d,J＝8.5Hz,1H),8.12(d,J＝9.4Hz,2H),7.88(d,J＝8.9Hz,1H),7.73(s,1H),7.58(d,J＝10.3Hz,9H),7.48(d,J＝8.6Hz,2H),7.45–7.27(m,10H),7.18(s,1H),6.97(s,1H),6.00(s,1H),5.51(s,2H),5.44–5.30(m,6H),5.09(d,J＝5.5Hz,2H),4.60(s,2H),4.37(s,2H),4.24(s,1H),3.99–3.89(m,4H),3.51(dd,J＝25.2,12.1Hz,18H),3.18(d,J＝6.6Hz,2H),2.98(d,J＝8.1Hz,2H),2.17(d,J＝7.0Hz,2H),2.00(d,J＝7.3Hz,4H),1.64(s,3H),1.30(s,7H),0.97(s,9H),0.86(s,3H).ESI HRMS calcd C₉₀H₁₀₁Cl₂F₂N₁₁O₁₈[M+Na]⁺m/z,1754.6569；found1754.6572.

实施例10

化合物I-10的制备

按照实施例1的方法，以Val-Ala代替Val-Cit，得化合物I-10。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ10.40(s,1H),9.99(s,1H),8.48(s,1H),8.37(d,J＝6.6Hz,1H),8.31(d,J＝8.3Hz,1H),7.93(d,J＝9.5Hz,1H),7.76–7.66(m,8H),7.57(d,J＝8.0Hz,4H),7.55–7.50(m,2H),7.46(dd,J＝23.9,8.7Hz,2H),7.42–7.32(m,3H),7.26(dd,J＝21.8,7.9Hz,3H),6.28(d,J＝9.7Hz,1H),5.59(s,1H),4.95(d,J＝22.1Hz,2H),4.84(s,1H),4.62–4.57(m,2H),4.42–4.35(m,2H),4.30–4.27(m,1H),4.17–4.10(m,8H),4.04(t,J＝6.5Hz,2H),4.01–3.90(m,10H),3.87(d,J＝13.2Hz,2H),3.63–3.48(m,12H),3.40(d,J＝5.9Hz,3H),2.89–2.84(m,3H),2.72(d,J＝15.1Hz,2H),2.45(s,1H),1.62(dd,J＝15.4,9.3Hz,7H),1.53(ddd,J＝20.4,14.2,6.2Hz,10H),1.33–1.25(m,38H),0.97(s,9H),0.59(s,3H).

实施例11

化合物I-11的制备

按照实施例1的方法，以和Val-Ala分别代替和Val-Cit，得化合物I-11。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ10.40(s,1H),10.09(s,1H),8.52(t,J＝5.6Hz,1H),8.40(d,J＝7.0Hz,1H),8.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.81(dd,J＝9.8,2.3Hz,1H),7.73(t,J＝6.8Hz,1H),7.58(dd,J＝14.1,11.2Hz,5H),7.53(t,J＝7.6Hz,1H),7.47(dd,J＝18.0,8.8Hz,2H),7.39(t,J＝8.5Hz,1H),7.36–7.33(m,2H),7.29(d,J＝8.5Hz,2H),6.32(d,J＝9.7Hz,1H),5.00(d,J＝10.3Hz,3H),4.85(s,1H),4.59(s,2H),4.53(d,J＝4.7Hz,1H),4.40(dd,J＝14.3,7.2Hz,2H),4.28(dt,J＝11.9,5.9Hz,2H),3.99–3.89(m,8H),3.61–3.49(m,11H),3.40(dd,J＝15.7,10.0Hz,9H),2.45(d,J＝12.8Hz,1H),2.00(dd,J＝13.4,6.9Hz,2H),1.86(dd,J＝26.6,15.9Hz,4H),1.72(t,J＝11.3Hz,2H),1.68–1.59(m,4H),1.52(dd,J＝14.6,7.4Hz,1H),1.43(d,J＝13.4Hz,1H),1.33–1.27(m,7H),1.22(dd,J＝19.4,13.7Hz,7H),1.09(s,3H),0.97(s,9H),0.87(dd,J＝8.0,5.1Hz,6H),0.83–0.79(m,6H).

实施例12

化合物I-12的制备

按照实施例1的方法，以Met-Cit和紫杉醇代替Val-Cit和得化合物I-12。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ10.40(s,1H),10.08(s,1H),9.28(d,J＝8.7Hz,1H),8.50(s,1H),8.32(d,J＝8.4Hz,1H),8.14(d,J＝7.7Hz,1H),8.08(d,J＝7.9Hz,1H),7.99(d,J＝7.2Hz,2H),7.82(d,J＝7.5Hz,2H),7.73(dd,J＝13.4,6.9Hz,2H),7.63(dd,J＝17.3,8.3Hz,4H),7.59–7.53(m,4H),7.50–7.43(m,7H),7.39(t,J＝8.6Hz,1H),7.35(dd,J＝7.3,3.6Hz,2H),7.31(d,J＝8.5Hz,2H),7.20(d,J＝4.1Hz,1H),6.31(s,1H),6.02(s,1H),5.84(s,1H),5.54(t,J＝8.6Hz,1H),5.42(s,3H),5.37(d,J＝8.8Hz,1H),5.14(s,2H),4.92(d,J＝7.7Hz,2H),4.64(s,1H),4.60(s,2H),4.42–4.36(m,3H),4.12(s,1H),4.02(dd,J＝16.9,8.3Hz,2H),3.96–3.90(m,4H),3.59(dd,J＝10.1,5.4Hz,3H),3.49(ddd,J＝16.8,7.7,4.7Hz,16H),3.41(d,J＝5.7Hz,2H),3.05–3.00(m,1H),2.98–2.94(m,1H),2.46–2.44(m,2H),2.38–2.32(m,2H),2.26(s,3H),2.12(s,3H),2.02(s,3H),1.88(s,2H),1.82(s,3H),1.51(s,3H),1.26–1.23(m,6H),1.02(d,J＝16.1Hz,6H),0.97(s,9H).ESI HRMS calcdC₁₀₈H₁₂₆Cl₂F₂N₁₁O₂₇S[M+H]⁺m/z,2135.7938；found2135.7932

实施例13

化合物I-13的制备

按照实施例1的方法，以Met-Cit代替Val-Cit，得化合物I-13。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ10.40(s,1H),10.01(s,1H),8.48(s,1H),8.32(d,J＝8.4Hz,1H),8.09(dd,J＝26.9,7.8Hz,2H),7.82(d,J＝9.5Hz,1H),7.73(t,J＝6.6Hz,1H),7.59(dd,J＝16.5,9.0Hz,5H),7.53(t,J＝7.3Hz,1H),7.49(d,J＝8.3Hz,1H),7.39(t,J＝8.3Hz,1H),7.35(d,J＝5.7Hz,2H),7.31(d,J＝8.5Hz,2H),6.33(d,J＝10.0Hz,1H),5.98(s,1H),5.41(s,2H),5.02(s,2H),4.96(s,1H),4.86(s,1H),4.59(d,J＝6.0Hz,2H),4.53(d,J＝4.6Hz,1H),4.39(s,3H),4.31–4.25(m,1H),4.00–3.90(m,5H),3.59(dd,J＝14.3,6.8Hz,2H),3.56–3.45(m,15H),3.44–3.35(m,9H),3.06–2.92(m,2H),2.44(dd,J＝15.7,9.0Hz,4H),2.36(dd,J＝13.8,7.1Hz,1H),2.02(s,3H),1.86(d,J＝32.6Hz,5H),1.79–1.69(m,4H),1.63(dd,J＝16.1,9.8Hz,4H),1.43(d,J＝13.5Hz,2H),1.32–1.20(m,9H),1.10(s,3H),0.98(s,9H),0.80(s,3H).

实施例14

化合物I-14的制备

按照实施例1的方法，以和Met-Cit分别代替和Val-Cit，得化合物I-14。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ10.41(s,1H),10.00(s,1H),8.49(t,J＝5.7Hz,1H),8.32(d,J＝8.4Hz,1H),8.08(dd,J＝21.1,7.7Hz,2H),7.93(dd,J＝9.7,2.5Hz,1H),7.73(t,J＝7.2Hz,1H),7.58(dd,J＝15.0,5.2Hz,4H),7.55–7.51(m,2H),7.50–7.47(m,1H),7.39(t,J＝8.5Hz,1H),7.37–7.33(m,2H),7.28(t,J＝10.0Hz,2H),6.29(d,J＝10.0Hz,1H),5.99(s,1H),5.41(s,2H),4.96(d,J＝23.2Hz,2H),4.84(s,1H),4.62–4.56(m,2H),4.39(dt,J＝13.4,6.8Hz,3H),4.14(s,1H),3.99–3.85(m,6H),3.63–3.57(m,2H),3.56–3.44(m,16H),3.41(dd,J＝11.7,5.9Hz,2H),3.02(dd,J＝13.4,6.5Hz,1H),2.94(dd,J＝13.1,6.7Hz,1H),2.44(ddd,J＝21.6,10.2,5.1Hz,4H),2.36(dd,J＝13.5,7.3Hz,1H),2.08–1.98(m,5H),1.90(t,J＝14.4Hz,2H),1.83–1.67(m,6H),1.61(td,J＝18.5,7.5Hz,6H),1.52–1.41(m,4H),1.35(dd,J＝28.5,14.5Hz,4H),1.29–1.18(m,10H),1.10(dd,J＝28.8,11.6Hz,2H),0.98(s,9H),0.89(s,3H),0.60(s,3H).ESIHRMS calcd C₉₁H₁₁₉Cl₂F₂N₁₁O₁₈S[M+H]⁺m/z,1794.7879；found 1795.7864

实施例15

化合物I-15的制备

按照实施例1的方法，以Gly-Gly-Phe-Gly和紫杉醇分别代替Val-Cit和得30mg白色固体化合物I-15。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ10.42(s,1H),9.95(s,1H),9.29(d,J＝8.3Hz,1H),8.51(s,1H),8.41(s,1H),8.32(d,J＝8.3Hz,1H),8.17(d,J＝10.4Hz,2H),8.04(s,1H),7.99(d,J＝7.7Hz,2H),7.83(d,J＝7.2Hz,2H),7.73(s,2H),7.63(dt,J＝16.7,8.0Hz,5H),7.55(dd,J＝17.7,10.1Hz,4H),7.49–7.43(m,6H),7.39–7.31(m,5H),7.26(d,J＝3.6Hz,4H),7.19(s,2H),6.31(s,1H),5.83(s,1H),5.54(t,J＝8.6Hz,1H),5.42(d,J＝6.9Hz,1H),5.37(d,J＝8.6Hz,1H),5.14(s,2H),4.97–4.89(m,2H),4.66(s,1H),4.60(s,2H),4.52(s,1H),4.39(s,1H),4.12(s,1H),4.02(dd,J＝15.6,8.2Hz,2H),3.92(s,4H),3.81–3.74(m,1H),3.70(d,J＝5.3Hz,2H),3.60(dd,J＝17.4,11.0Hz,4H),3.52(d,J＝5.1Hz,5H),3.49–3.44(m,8H),3.41(d,J＝5.7Hz,2H),3.08(d,J＝10.1Hz,1H),2.87–2.80(m,1H),2.39(t,J＝6.3Hz,2H),2.27(s,3H),2.12(s,3H),2.00(d,J＝15.3Hz,1H),1.81(s,4H),1.68–1.61(m,2H),1.51(s,4H),1.27(dd,J＝21.0,9.2Hz,5H),1.03(s,3H),1.00(s,3H),0.98(s,9H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ202.80,171.91,171.48,171.18,170.13,169.73,169.42,169.34,169.22,168.08,166.81,165.99,165.68,154.27,147.95,139.64,138.30,137.44,134.50,133.95,132.01,131.41,130.46,130.40,130.04,129.96,129.81,129.74,129.60,129.20,129.13,129.05,128.78,128.54,128.03,127.86,126.74,126.08,125.72,120.51,119.46,117.77,117.47,110.06,84.07,80.73,77.60,77.14,75.75,75.17,74.95,71.63,70.86,70.19,70.15,70.07,69.95,69.43,67.10,65.07,63.70,57.86,56.26,54.71,54.38,50.62,46.54,44.34,43.40,43.18,42.58,42.29,37.85,36.99,36.32,34.83,31.60,30.53,30.28,29.95,29.47,29.27,26.80,22.99,21.81,21.12,14.36,10.22.ESI HRMS calcd C₁₁₂H₁₂₄Cl₂F₂N₁₀O₂₈[M+H]⁺m/z,2165.7932；found 2165.8004.

实施例16

化合物I-16的制备

按照实施例1的方法，以Gly-Gly-Phe-Gly代替Val-Cit，得29mg白色固体化合物I-16。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ10.40(s,1H),9.85(s,1H),8.48(t,J＝5.6Hz,1H),8.38(t,J＝5.8Hz,1H),8.31(d,J＝8.4Hz,1H),8.18–8.13(m,2H),8.02(t,J＝5.6Hz,1H),7.81(dd,J＝9.9,2.5Hz,1H),7.73(t,J＝6.9Hz,1H),7.59(dd,J＝20.0,9.9Hz,5H),7.53(t,J＝7.7Hz,1H),7.49(d,J＝8.5Hz,1H),7.39(t,J＝8.5Hz,1H),7.37–7.30(m,4H),7.26(d,J＝4.3Hz,4H),7.18(dd,J＝8.5,4.4Hz,1H),6.33(d,J＝9.9Hz,1H),5.03(s,2H),4.96(s,1H),4.86(s,1H),4.62–4.56(m,2H),4.55–4.48(m,2H),4.36(s,1H),4.28(dd,J＝10.9,4.8Hz,1H),4.00–3.89(m,6H),3.81(ddd,J＝22.9,16.6,5.8Hz,2H),3.69(dd,J＝5.5,2.3Hz,2H),3.61(dt,J＝12.9,6.0Hz,3H),3.53(t,J＝5.8Hz,6H),3.50–3.44(m,8H),3.41(dd,J＝15.6,9.8Hz,10H),3.07(dd,J＝13.7,4.6Hz,1H),2.83(dd,J＝13.6,9.7Hz,1H),2.45(d,J＝13.7Hz,1H),2.38(t,J＝6.6Hz,2H),2.04–1.95(m,1H),1.87(dd,J＝29.5,14.3Hz,4H),1.73(t,J＝11.5Hz,2H),1.69–1.58(m,4H),1.43(d,J＝14.5Hz,1H),1.28(t,J＝9.2Hz,2H),1.22(d,J＝17.9Hz,4H),1.10(s,3H),0.98(s,9H),0.80(s,3H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ213.75,171.89,171.19,169.75,166.02,150.70,147.99,138.98,138.30,131.43,130.48,129.77,129.61,129.07,128.92,128.56,126.75,125.75,121.33,120.52,119.53,117.78,117.52,115.09,110.10,84.64,73.62,71.48,70.22,70.18,70.10,69.97,69.46,67.13,66.65,65.09,62.64,56.28,54.80,50.66,44.38,43.20,42.61,42.33,37.81,36.98,36.35,33.13,32.39,31.09,30.55,29.97,29.47,28.12,26.74,25.93,23.85,21.74,17.74.ESI HRMS calcd C₉₄H₁₁₃Cl₂F₂N₁₁O₂₁[M+H]⁺m/z,1840.7536；found 1840.7520

实施例17

化合物I-17的制备

按照实施例1的方法，以和Gly-Gly-Phe-Gly分别代替和Val-Cit，得27mg淡绿色固体化合物I-17。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ10.41(s,1H),9.86(s,1H),8.50(s,1H),8.40(s,1H),8.32(d,J＝8.4Hz,1H),8.17(d,J＝6.8Hz,2H),8.04(s,1H),7.94(d,J＝9.9Hz,1H),7.74(t,J＝6.9Hz,1H),7.63–7.56(m,4H),7.56–7.47(m,3H),7.42–7.33(m,3H),7.30(d,J＝8.3Hz,2H),7.26(d,J＝3.8Hz,5H),7.19(d,J＝3.6Hz,1H),6.29(d,J＝9.6Hz,1H),4.94(s,2H),4.84(s,1H),4.60(s,2H),4.51(s,1H),4.38(s,1H),4.16(s,1H),3.99–3.83(m,9H),3.78(dd,J＝16.8,5.6Hz,1H),3.70(d,J＝4.6Hz,2H),3.59(t,J＝6.3Hz,3H),3.52(d,J＝4.9Hz,7H),3.50–3.45(m,9H),3.41(d,J＝5.5Hz,2H),3.17(s,1H),3.07(d,J＝10.1Hz,1H),2.86(dd,J＝38.0,27.4Hz,3H),2.46(s,1H),2.39(t,J＝6.2Hz,2H),2.08–2.00(m,2H),1.92(t,J＝13.0Hz,1H),1.77(d,J＝15.1Hz,4H),1.63(dd,J＝29.2,12.9Hz,5H),1.50(t,J＝18.2Hz,4H),1.39(s,1H),1.32(dd,J＝27.1,16.0Hz,4H),1.17(dd,J＝29.7,13.9Hz,3H),0.98(s,9H),0.89(s,3H),0.60(s,3H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ171.92,171.20,169.75,169.40,167.97,166.01,161.82,155.80,154.48,149.67,147.89,138.92,138.30,132.26,131.41,130.47,130.06,129.75,129.61,129.21,129.06,128.56,126.75,126.08,125.73,123.21,120.52,119.38,117.78,117.48,114.66,110.07,83.88,70.97,70.21,70.09,69.96,69.45,67.12,65.49,65.09,63.88,63.67,56.26,55.37,54.79,50.62,48.52,47.98,44.36,43.17,42.59,42.30,41.67,37.81,37.43,36.33,35.32,32.48,32.04,31.00,30.73,30.55,29.96,29.48,28.95,26.79,25.19,24.26,21.58,21.49,17.13.ESI HRMS calcd C₉₅H₁₁₇Cl₂F₂N₁₁O₁₉[M+H]⁺m/z,1824.7872；found 1824.7945.

实施例18

化合物I-18的制备

按照实施例1的方法，以丝裂霉素C和Gly-Gly-Phe-Gly分别代替和Val-Cit，得30mg紫色固体I-18。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ10.41(s,1H),9.88(s,1H),8.50(t,J＝5.5Hz,1H),8.39(t,J＝5.8Hz,1H),8.32(d,J＝8.4Hz,1H),8.16(dd,J＝10.6,5.1Hz,2H),8.03(t,J＝5.7Hz,1H),7.74(t,J＝6.9Hz,1H),7.59(dd,J＝9.0,5.4Hz,4H),7.54(t,J＝7.6Hz,1H),7.49(dd,J＝8.4,1.6Hz,1H),7.40(t,J＝8.5Hz,1H),7.37–7.30(m,4H),7.28–7.23(m,4H),7.18(dq,J＝8.7,4.3Hz,1H),7.06(s,2H),6.66(s,2H),4.97(dd,J＝36.3,12.3Hz,2H),4.73(dd,J＝10.6,4.6Hz,1H),4.62–4.56(m,2H),4.54–4.48(m,1H),4.38(s,1H),4.24(d,J＝13.5Hz,1H),3.99–3.89(m,6H),3.85(dd,J＝16.5,5.7Hz,1H),3.77(dd,J＝16.8,6.0Hz,1H),3.70(d,J＝5.7Hz,2H),3.64–3.56(m,4H),3.52(dd,J＝10.7,5.5Hz,8H),3.49–3.44(m,8H),3.41(dd,J＝12.4,6.5Hz,3H),3.13(s,3H),3.07(dd,J＝13.9,4.4Hz,1H),2.83(dd,J＝13.9,9.9Hz,1H),2.39(t,J＝6.5Hz,2H),1.68–1.61(m,4H),1.27(d,J＝13.4Hz,1H),0.98(s,9H).¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ177.09,176.26,171.88,171.49,171.19,169.73,169.35,167.96,166.01,160.69,157.02,154.94,149.24,147.96,139.17,138.30,131.43,130.96,130.47,130.06,129.75,129.60,129.45,129.06,128.54,126.74,126.08,125.73,120.51,119.40,117.93,117.77,117.48,110.07,110.02,105.79,103.36,70.20,70.16,70.08,69.95,69.44,67.94,67.11,65.08,63.67,61.00,56.27,55.36,54.73,50.62,49.75,48.98,44.35,43.40,43.15,42.58,42.28,37.84,36.32,30.54,29.96,29.48,8.79.ESI HRMS calcd C₈₀H₉₁Cl₂F₂N₁₃O₁₉[M+H]⁺m/z,1646.5899；found 1646.5972.

实施例19

本发明化合物的体外抗肿瘤活性试验

对本发明实施例制备的部分化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制试验，试验方法采用CCK-8法。细胞株HCT116(人结肠癌细胞)和SW1990(人胰腺癌细胞)购自上海美轩科技有限公司。用DMSO(Merck)溶解样品(实施例制备的部分化合物)，配制成10mM的浓度，最后用DMEM或McCoy's 5A 1640培养基三倍稀释成8个浓度梯度。细胞培养符合测试要求时收集细胞培养液，取10μL于细胞计数板上涂布均匀，然后在显微镜下进行计数3次，取平均值计算出细胞密度；取96孔板(Corning，#3599)，按6×10³个/孔的细胞浓度，每孔各加200μL进行细胞接种，将接种后的96孔板置于37℃，含5％CO₂的细胞培养箱中培养24h。吸除旧培养基，每孔加入含起始浓度10μmol/L经3倍稀释的样品DMEM或McCoy's 5A 1640培养基200μL，控制DMSO的含量为1％，置三个副孔，PBS作为空白对照，置上述培养箱中孵育72h。将96孔板中的原有DMEM或McCoy's 5A 1640培养基以及最后一排的PBS缓冲液吸出，加入配制好的CCK-8溶液(90％的DMEM或McCoy's 5A 1640培养基+10％的CCK-8)，置于孵育箱孵育，用Biotek酶标仪读取吸光度值。细胞生长抑制率IC％＝(空白对照孔OD值-给药孔OD值)/空白对照孔OD值×100％。根据各个浓度的IC％值，用GraphPad软件进行线性回归，计算各化合物抑制细胞生长50％的药物浓度，即IC₅₀。

试验结果见表1，其中，样品是指相应实施例中制备的化合物。

表1部分实施例化合物体外抗肿瘤活性

实施例20

本发明化合物的体外抗肿瘤活性试验

对本发明实施例的部分化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制试验，试验方法采用MTT法(如吕秋军主编《新药药理学研究方法》，2007：242-243)。

细胞株选用KYSE-150(人食管鳞癌细胞)、MGC803(人胃癌细胞)和SHG44(人胶质瘤细胞)，由上海医药工业研究院药理实验室冻存和传代。培养液为DMEM+10％FBS+双抗。

体外活性测试：96孔板每孔加入浓度为4-5×10⁴个/mL的细胞悬液100μL，置37℃，5％CO₂培养箱内。24h后，加入样品液，10μL/孔，设双复孔，37℃，5％CO₂作用72h。每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μL，作用4h后加入溶解液，100μL/孔，置培养箱内，溶解后用全波长多功能酶标仪测570nm OD值。用Excel软件计算抑制率(Inhibition Rate，IR)和半数抑制浓度(IC₅₀)。

按下列公式计算药物对细胞生长的抑制率(IR％)

试验结果见表2，其中，样品是指相应实施例中制备的化合物。

表2部分实施例化合物体外抗肿瘤活性

实施例21

本发明化合物的抗肿瘤活性试验

对本发明实施例制备的部分化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制试验，试验方法采用CCK-8法。细胞株HCT116(人结肠癌细胞)、MGC803(人胃癌细胞)和MIAPACA-2(人胰腺癌细胞)购自上海美轩科技有限公司。用DMSO(Merck)溶解样品(实施例制备的部分化合物)，配制成10mM的浓度，最后用DMEM或McCoy's 5A 1640培养基三倍稀释成8个浓度梯度。细胞培养符合测试要求时收集细胞培养液，取10μL于细胞计数板上涂布均匀，然后在显微镜下进行计数3次，取平均值计算出细胞密度；取96孔板(Corning，#3599)，按6×10³个/孔的细胞浓度，每孔各加200μL进行细胞接种，将接种后的96孔板置于37℃，含5％CO₂的细胞培养箱中培养24h。吸除旧培养基，每孔加入含起始浓度10μmol/L经3倍稀释的样品DMEM或McCoy's5A 1640培养基200μL，控制DMSO的含量为1％，置三个副孔，PBS作为空白对照，置上述培养箱中孵育72h。将96孔板中的原有DMEM或McCoy's 5A 1640培养基以及最后一排的PBS缓冲液吸出，加入配制好的CCK-8溶液(90％的DMEM或McCoy's 5A 1640培养基+10％的CCK-8)，置于孵育箱孵育，用Biotek酶标仪读取吸光度值。细胞生长抑制率IC％＝(空白对照孔OD值-给药孔OD值)/空白对照孔OD值×100％。根据各个浓度的IC％值，用GraphPad软件进行线性回归，计算各化合物抑制细胞生长50％的药物浓度，即IC₅₀。

试验结果见表3，其中，样品是指相应实施例中制备的化合物。

表3部分实施例化合物体外抗肿瘤活性

以上实验结果表明，本发明的化合物具有良好的抗肿瘤活性，并且对结肠癌、胰腺癌、食管鳞癌、胃癌和胶质瘤等细胞株均显示出优秀的活性，如化合物I-1、I-2、I-4、I-8、I-11、I-13、I-14、I-15、I-16、I-17等对大部分肿瘤细胞株增殖抑制活性IC₅₀均在数个至数百个纳摩尔。因此本发明化合物及其盐类可以用于制备抗肿瘤药物。

实施例22

本发明化合物I-1、I-4、I-16和I-17的人间质瘤SHG44体内抗肿瘤活性试验

动物：BALB/C裸鼠(SPF级)，雄性，18-20克。化合物先加总量4％的DMSO，再加总量2％的吐温-80助溶，再加总量5％的PEG300，最后加入灭菌生理盐水，配成1mg/mL的溶液。Idasanutlin先加总量4％的DMSO，再加总量2％的吐温-80助溶，再加总量5％的PEG300，最后加入灭菌生理盐水，配成2.5mg/ml的溶液

取生长良好的人间质瘤SHG44瘤块，无菌条件下切割成约3mm大小的均匀小块，用套管针每只小鼠右腋皮下接种一块。接种后第9天见瘤块体积平均约130mm³，根据肿瘤大小重新分组，淘汰肿瘤过大和过小的动物，每组肿瘤平均体积基本一致，开始按以下方案给药，给药体积为0.2mL/20g体重。自接种第9天起每周2次用数显电子卡尺测量肿瘤长径a(mm)，及相垂直的肿瘤短径b(mm)，肿瘤体积计算公式为：TV＝ab²/2，相对肿瘤体积计算公式为：RTV＝Vt/Vo，Vo为分笼时(即d1)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。接种后30天(d22)处死动物，称体重，解剖取瘤块，称瘤重，结果判定根据以下公式：

表4化合物I-1、I-4、I-16和I-17的人间质瘤SHG44体内抗肿瘤活性

与Control组比较：**P<0.01。

以上实验结果表明，本发明的化合物I-1、I-4、I-16和I-17具有良好的人间质瘤SHG44体内抗肿瘤活性，因此本发明化合物及其盐类可以用于制备抗肿瘤药物。

实施例23

本发明化合物I-1和I-4的人胃癌MGC803体内抗肿瘤活性试验

取生长良好的人胃癌MGC803瘤块，无菌条件下切割成约3mm大小的均匀小块，用套管针每只小鼠右腋皮下接种一块。接种后第9天见瘤块体积平均约130mm³，根据肿瘤大小重新分组，淘汰肿瘤过大和过小的动物，每组肿瘤平均体积基本一致，开始按以下方案给药，给药体积为0.2mL/20g体重。自接种第9天起每周2次用数显电子卡尺测量肿瘤长径a(mm)，及相垂直的肿瘤短径b(mm)，肿瘤体积计算公式为：TV＝ab²/2，相对肿瘤体积计算公式为：RTV＝Vt/Vo，Vo为分笼时(即d1)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。接种后30天(d22)处死动物，称体重，解剖取瘤块，称瘤重，结果判定根据以下公式：

表5化合物I-1和I-4的人胃癌MGC803体内抗肿瘤活性

与Control组比较：**P<0.01。

以上实验结果表明，本发明的化合物I-1和I-4具有良好的人胃癌MGC803体内抗肿瘤活性，因此本发明化合物及其盐类可以用于制备抗肿瘤药物。

实施例24

本发明化合物I-1和I-4的人食道癌KYSE-150体内抗肿瘤活性试验

取生长良好的人食道癌KYSE-150瘤块，无菌条件下切割成约3mm大小的均匀小块，用套管针每只小鼠右腋皮下接种一块。接种后第9天见瘤块体积平均约130mm³，根据肿瘤大小重新分组，淘汰肿瘤过大和过小的动物，每组肿瘤平均体积基本一致，开始按以下方案给药，给药体积为0.2mL/20g体重。自接种第9天起每周2次用数显电子卡尺测量肿瘤长径a(mm)，及相垂直的肿瘤短径b(mm)，肿瘤体积计算公式为：TV＝ab²/2，相对肿瘤体积计算公式为：RTV＝Vt/Vo，Vo为分笼时(即d1)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。接种后30天(d22)处死动物，称体重，解剖取瘤块，称瘤重，结果判定根据以下公式：

表6化合物I-1和I-4的人食道癌KYSE-150体内抗肿瘤活性

与Control组比较：**P<0.01。

以上实验结果表明，本发明的化合物I-1和I-4具有良好的人食道癌KYSE-150体内抗肿瘤活性，因此本发明化合物及其盐类可以用于制备抗肿瘤药物。

实施例25

本发明化合物I-1对hERG钾通道作用测试

CHO-hERG细胞培养于175cm²培养瓶中，待细胞密度生长到60～80％，移走培养液，用7mL PBS(Phosphate Buffered Saline磷酸盐缓冲液)洗一遍，然后加入3mL Detachin消化。待消化完全后加入7mL培养液中和，然后离心，吸走上清液，再加入5mL培养液重悬，以确保细胞密度为2～5×10⁶/mL。

单细胞高阻抗封接和全细胞模式形成过程全部由Qpatch仪器自动完成，在获得全细胞记录模式后，细胞钳制在-80毫伏，在给予一个5秒的+40毫伏去极化刺激前，先给予一个50毫秒的-50毫伏前置电压，然后复极化到-50毫伏维持5秒，再回到-80毫伏。每15秒施加此电压刺激，记录2分钟后给予细胞外液记录5分钟，然后开始给药过程，化合物浓度从最低测试浓度开始，每个测试浓度给予2.5分钟，连续给完所有浓度后，给予阳性对照化合物3μMCisapride。每个浓度至少测试3个细胞(n≥3)。

将20mM的化合物母液用DMSO进行稀释，取10μL 20mM的化合物母液加入至20μLDMSO溶液中，3倍连续稀释至6个DMSO浓度。分别取4μL 6个DMSO浓度的化合物，加入至396μL的细胞外液中，100倍稀释至6个中间浓度，再分别取80μL的6个中间浓度化合物，加入至320μL的细胞外液中，5倍稀释至需要测试的最终浓度。最高测试浓度为40μM，依次分别为40、13.33、4.44、1.48、0.49、0.16μM共6个浓度。最终测试浓度中的DMSO含量不超过0.2％，此浓度的DMSO对hERG钾通道没有影响。化合物准备由Bravo仪器完成整个稀释过程。实验数据由GraphPadPrism 5.0软件进行分析。

表7化合物的hERG钾通道活性测试

以上实验结果表明，本发明的化合物具有较低的hERG钾通道抑制活性，表明其心脏毒性较低。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

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一种小分子偶联物及其用途

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