一种包载生物大分子药物的口服纳米聚合物靶向递送系统
阅读说明：本技术 一种包载生物大分子药物的口服纳米聚合物靶向递送系统 (Oral nano polymer targeted delivery system for entrapped biomacromolecule medicine ) 是由 高钟镐 韩颖 黄伟 陈丽青 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种用于口服的新型纳米聚合物靶向递送系统,包括包载生物大分子药物的组成及制备方法,生物大分子药物为核酸、肽、疫苗、抗体或聚糖。选用两种不同性质的胆酸：疏水胆酸和亲水胆酸分别为内外靶头,首先通过电荷作用和疏水作用制备包载生物大分子药物的阳离子聚合物—疏水胆酸核心复合物,然后通过薄膜水化作用和电荷作用将核心复合物包裹于阴离子聚合物—聚乙二醇—亲水胆酸中形成纳米粒,将纳米粒制成冻干粉装入肠溶胶囊中构建一种自组装口服纳米聚合物靶向递送系统。口服后,通过转运体进入淋巴,然后吸收入血,可提高口服药物的生物利用度。(The invention belongs to the technical field of biological medicines, and particularly relates to a novel oral nano polymer targeted delivery system which comprises a composition for encapsulating biological macromolecular medicaments and a preparation method, wherein the biological macromolecular medicaments are nucleic acid, peptide, vaccine, antibody or glycan. Two different cholic acids were selected: hydrophobic cholic acid and hydrophilic cholic acid are respectively used as an internal target and an external target, firstly, a cationic polymer-hydrophobic cholic acid core compound which is used for encapsulating biomacromolecule drugs is prepared through charge action and hydrophobic action, then, the core compound is coated in an anionic polymer-polyethylene glycol-hydrophilic cholic acid through film hydration action and charge action to form nanoparticles, the nanoparticles are prepared into freeze-dried powder and then are filled into enteric capsules to construct a self-assembled oral nano polymer targeted delivery system. After oral administration, the drug enters lymph through a transporter and then is absorbed into blood, so that the bioavailability of the oral drug can be improved.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于口服的纳米聚合物靶向递送系统，包括包载生物大分子药物的组成及制备方法。选用两种不同性质的胆酸：疏水胆酸和亲水胆酸分别为内外靶头，首先通过电荷作用和疏水作用制备包载生物大分子药物的阳离子聚合物—疏水胆酸核心复合物，然后通过薄膜水化作用和电荷作用将此核心复合物包裹于阴离子聚合物—聚乙二醇—亲水胆酸中形成纳米粒，将纳米粒制成冻干粉装入肠溶胶囊中构建一种自组装口服纳米聚合物靶向递送系统。口服后，通过胆酸转运体进入淋巴，然后吸收入血，可提高口服药物的生物利用度。药物包括核酸、肽、疫苗、抗体或聚糖。
背景技术
生物大分子药物口服递送需要克服胃肠道的多种物化屏障，包括复杂的pH和酶环境，粘液屏障和小肠上皮屏障，且生物大分子药物多具有脂溶性差、分子量大和物化性质不稳定等特点，这又增加了递送的困难。一些慢性病治疗药物如糖尿病药，抗癌药，神经药等药物需要长期口服，注射剂会带来诸多副作用和不方便。因此，急需开发一种可有效提高药效，降低用药剂量，减少毒副作用，既经济又实惠的口服药物制剂。
胆酸转运蛋白是肠道的重要吸收转运体，肝脏分泌的胆酸通过远端小肠的回肠顶端的钠依赖性胆盐转运体-细胞质内的胆盐结合蛋白-底端的有机蛋白转运体等一系列转运体进入淋巴，然后吸收入血，转运回肝脏。在胆酸的作用下，消化的脂肪分子被吸收进入小肠细胞并重新组装成甘油三酯，经由内质网和高尔基体处理，最终同脂蛋白和胆固醇以乳糜微粒的形式从小肠上皮细胞中释放出来，然后经由淋巴系统(即乳糜池和胸导管)和左侧锁骨下静脉被转移到体循环中。因此，表面修饰胆酸的载药复合物，可以在回肠末端的胆酸转运蛋白的作用下，促进药物颗粒吸收入血，提高在体的吸收利用度。
发明内容
本发明提供了一种口服药物纳米聚合物，要解决的技术问题是提高生物大分子药物的口服递送能力。选用疏水和亲水两种性质的胆酸，采用亲水胆酸为靶头修饰共价连接的荷负电、生物相容性好的阴离子聚合物和具有优秀粘膜穿透作用的聚乙二醇材料，疏水胆酸修饰带正电的、低毒的阳离子聚合物，拟通过电荷作用和疏水作用用阳离子聚合物—疏水胆酸包载生物大分子药物形成核心复合物，然后通过薄膜水化作用和电荷作用将核心复合物包裹于阴离子聚合物—聚乙二醇—亲水胆酸中形成纳米粒，将纳米粒制成冻干粉装入肠溶胶囊中构建一种自组装口服纳米聚合物靶向递送系统。
聚合物中胆酸的修饰增加了药物的生物利用度，为肽、基因、寡核苷酸、疫苗等生物大分子药物提供了口服的可能性。本发明的特点在于巧妙利用了不同胆酸的性质，一来考虑到了生物大分子药物的特点：仅通过电荷作用包载生物大分子药物能力低且容易团聚，而通过疏水胆酸的疏水作用可以极大提高包载能力和稳定性；二来疏水胆酸在内层可以起到进一步的胞内靶向作用，与外层的亲水胆酸一起，极大的提高生物大分子药物的口服生物利用度。本发明的自组装纳米靶向递送系统提供了一种口服技术平台，为肠道吸收差、不稳定，以及酶降解而不能口服的生物大分子药物，提供了口服给药的技术和方法。
为解决本发明的技术问题，本发明采用如下技术方案。
本发明技术方案的第一方面是提供了载体材料阳离子聚合物—疏水胆酸和阴离子聚合物—聚乙二醇—亲水胆酸的合成与纯化。
其中，阳离子聚合物选自低分子量鱼精蛋白、聚精氨酸、聚赖氨酸的至少一种。阴离子聚合物是一种高分子，在中性pH值的条件下带负电荷，阴离子聚合物选自：天然阴离子聚合物、合成阴离子聚合物或聚阴离子聚合物。所述天然阴离子聚合物为聚唾液酸、透明质酸、海藻酸、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、肝素、褐藻酸；所述合成阴离子聚合物为磺酸、羧酸聚合物、磷酸盐或磺胺类；所述聚阴离子聚合物是一个天然的或合成的聚合物的共聚物，或两个以上的任何类型的聚合物共聚物。胆酸包括胆酸、脱氧胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、石胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸或任何类型的胆酸，结构见图1。
包括如下步骤：
第一步，合成阳离子聚合物—疏水胆酸功能性载体材料：
1)从序列C端到N端，步骤如下：称取n当量树脂放入反应器，加入二氯甲烷溶胀半小时，然后抽掉二氯甲烷，加入序列中第一个氨基酸2n当量，加2n当量的二异丙基乙胺，适量的N,N-二甲基甲酰胺，二氯甲烷(适量是指以可使树脂充分鼓动起来为宜)，氮气鼓泡反应60min。然后加入约5n当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用N,N-二甲基甲酰胺、甲醇洗净；
2)往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为2n当量)，2n当量1－羟基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸盐及二异丙基乙胺，氮气鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱帽液去除9-芴甲氧羰基保护基，洗净，茚三酮检测；
3)依步骤2)的方式依次加入序列中不同的氨基酸，在最后一个氨基酸的N端加入疏水胆酸；
4)将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加入切割液和树脂以10毫升/克比例的切割液(组成是95％三氟乙酸，2％乙二硫醇，2％三异丙基硅烷，1％水)，震荡，滤掉树脂；
5)得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到序列的粗产物；
6)用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度，纯化好的液体放入冻干机中进行浓缩，冻干成阳离子聚合物—疏水胆酸白色粉末。
第二步，合成阴离子聚合物—聚乙二醇—亲水胆酸功能性载体材料：
1)将亲水胆酸溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺作为缩合剂，室温下活化；
2)将等比例的一端叔丁基保护的氨基聚乙二醇加入上述溶液中，并加入少量三乙胺，室温下继续反应；
3)反应结束后，透析，冷冻干燥，经1H-NMR验证，即得一端叔丁基保护的聚乙二醇-亲水胆酸白色粉末；
4)将一端叔丁基保护的聚乙二醇-亲水胆酸加入二氯甲烷溶剂中，缓慢滴加三氟乙酸，室温搅拌，旋蒸除去三氟乙酸和二氯甲烷，得到脱保护的聚乙二醇-亲水胆酸，加水溶解；
5)将带羧基的阴离子聚合物溶解于乙磺酸缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺作为缩合剂，室温下活化；
6)将脱保护的聚乙二醇-亲水胆酸加入步骤5)中的乙磺酸缓冲液中，加入氢氧化钠调pH至约8，室温下继续反应；
7)反应结束后，透析，冷冻干燥，经1H-NMR验证，即得阴离子聚合物-聚乙二醇-亲水胆酸白色粉末；
其中步骤1)中
亲水胆酸质量：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐质量：N-羟基琥珀酰亚胺质量：N,N-二甲基甲酰胺的体积比是2:2:1：1；
优选的亲水胆酸的质量是：50mg，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的质量是:50mg，N-羟基琥珀酰亚胺的质量是：25mg，N,N-二甲基甲酰胺的体积是25ml；
优选的反应温度是：30℃；
优选的活化时间是：2h。
其中步骤2)中
聚乙二醇的分子量范围为2000～20000；
聚乙二醇：亲水胆酸：三乙胺的摩尔比是1:1：400；
优选的聚乙二醇2000质量是：215mg，亲水胆酸质量是：50mg，三乙胺的剂量是：15μl；
优选的反应温度是：30℃；
优选的反应时间是：24h。
其中步骤3)中
透析袋的截留分子量范围：1k～10kDa；
优选的透析液是：乙醇、去离子水；
优选的透析时间：72h。
其中步骤4)中
二氯甲烷：三氟乙酸体积比为2:1；
优选的搅拌时间是：2h；
优选的反应温度是：30℃。
其中步骤5)中
优选的阴离子聚合物：聚乙二醇-亲水胆酸的摩尔比是：1:20～1:40；
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的质量：N-羟基琥珀酰亚胺的质量：乙磺酸溶液的体积是：10:1:1～100:1:1；
优选的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的质量是：100mg，N-羟基琥珀酰亚胺的质量是：10mg，乙磺酸溶液的体积是：10ml；
优选的活化时间是:25min。
其中步骤6)中
优选的反应时间是:24h。
其中步骤7)中
透析袋的截留分子量范围：5k～50kDa；
优选的透析液是：去离子水；
优选的透析时间是：72h。
本发明技术方案的第二方面是提供了阳离子聚合物—疏水胆酸和阴离子聚合物—聚乙二醇—亲水胆酸在体内外作为生物大分子药物递送载体中的应用。
所述的生物大分子药物包括肽、核酸、疫苗、抗体、聚糖。
包括如下步骤：
1)在水溶液中，阳离子聚合物—疏水胆酸与生物大分子药物的摩尔比为1:1到9:1，形成核心复合物；
2)将阴离子聚合物—聚乙二醇—亲水胆酸溶于甲醇中，旋转蒸发除去甲醇形成一层薄膜，用水溶解，将步骤1)中的核心复合物加入水中自发形成纳米粒，阴离子聚合物—聚乙二醇—亲水胆酸与生物大分子药物的摩尔比为0.1:1到0.9:1；
3)将步骤2)中的纳米粒制备成冻干粉装入肠溶胶囊中得到一种自组装口服纳米聚合物靶向递送系统，冻干保护剂是1％到4％(w/v)的海藻糖。
其中步骤1)中
优选的阳离子聚合物—疏水胆酸与生物大分子药物的摩尔比为3:1到5:1；
优选的搅拌速度是：400rpm；
优选的反应温度是：4℃；
优选的搅拌时间是：2h。
其中步骤3)中
优选的阴离子聚合物—聚乙二醇—亲水胆酸与生物大分子药物的摩尔比为0.3:1到0.6:1；
优选的海藻糖剂量是：2％(w/v)。
有益技术效果：
本发明主要提供了一种增加生物大分子药物溶解度、提高生物利用度的口服制剂，可有效提高药效，降低用药剂量，减少毒副作用。生物大分子药物口服递送需要克服胃肠道的多种复杂的物化屏障，且生物大分子药物多具有脂溶性差、分子量大和物化性质不稳定等特点，这又增加了递送的困难。一些慢性病治疗药物需要长期口服，注射剂会带来诸多副作用和不方便。
为解决上述产品的不足，本发明巧妙利用了不同胆酸的性质，一来考虑到了生物大分子药物的特点：仅通过电荷作用包载生物大分子药物能力低且容易团聚，而通过疏水胆酸的疏水作用可以极大提高包载能力和稳定性；二来疏水胆酸在内层可以起到进一步的胞内靶向作用，与外层的亲水胆酸一起，极大的提高生物大分子药物的口服生物利用度。本发明的自组装纳米靶向递送系统提供了一种口服技术平台，为肠道吸收差、不稳定，以及酶降解而不能口服的生物大分子药物，提供了口服给药的技术和方法，体内生物利用度明显高于没有胆酸修饰的纳米粒，该载体细胞毒性低，体内外应用良好，粒径范围为100～300nm，包封率大于70％。
附图说明
图1.几种胆酸的结构
图2.几种代表性的阳离子聚合物-疏水胆酸合成反应式
图3.几种代表性的阴离子聚合物-PEG-亲水胆酸合成反应式
图4.纳米粒的制备过程
图5.纳米粒电镜图
图6.纳米粒储存稳定性
图7.纳米粒在胆盐转运体高表达的SK-BR-3细胞上的摄取
图8.纳米粒在体外Caco-2模型上的转运
图9.纳米粒在小肠内的吸收
图10.艾塞那肽载药纳米聚合物的体内血糖浓度变化
图11.艾塞那肽载药纳米聚合物的体内药动
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。
实施例1：八聚精氨酸-鹅去氧胆酸的合成
1)称取275mg树脂放入反应器，加入4ml二氯甲烷溶胀半小时，然后抽掉二氯甲烷，加入序列中第一个精氨酸35mg，加26mg二异丙基乙胺，5mlN,N-二甲基甲酰胺，5ml二氯甲烷，氮气鼓泡反应60min。然后加入4ml当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用N,N-二甲基甲酰胺、甲醇洗净；
2)往反应器中加入序列中第二个精氨酸35mg，76mg 1－羟基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸盐及26mg二异丙基乙胺，氮气鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱帽液去除9-芴甲氧羰基保护基，洗净，茚三酮检测；
3)依次加入剩余的精氨酸，在最后一个精氨酸的N端加入78.5mg鹅去氧胆酸；
4)将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加入切割液和树脂以10ml/g比例的切割液(组成是95％三氟乙酸，2％乙二硫醇，2％三异丙基硅烷，1％水)，震荡，滤掉树脂；
5)得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到序列的粗产物；
6)用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度，纯化好的液体放入冻干机中进行浓缩，冻干成阳离子聚合物—疏水胆酸白色粉末。
示意图见图2-1。
实施例2：低分子量鱼精蛋白-脱氧胆酸的合成
1)称取275mg(0.1mmol)树脂放入反应器，加入4ml二氯甲烷溶胀半小时，然后抽掉二氯甲烷，加入序列中第一个精氨酸35mg(0.2mmol)，加26mg二异丙基乙胺，5mlN,N-二甲基甲酰胺，5ml二氯甲烷，氮气鼓泡反应60min。然后加入4ml当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用N,N-二甲基甲酰胺、甲醇洗净；
2)往反应器中加入序列中第二个氨基酸0.2mmol，76mg 1－羟基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸盐及26mg二异丙基乙胺，氮气鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱帽液去除9-芴甲氧羰基保护基，洗净，茚三酮检测；
3)依次加入剩余的氨基酸，在最后一个缬氨酸的N端加入78.5mg脱氧胆酸；
4)将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加入切割液和树脂以10ml/g比例的切割液(组成是95％三氟乙酸，2％乙二硫醇，2％三异丙基硅烷，1％水)，震荡，滤掉树脂；
5)得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到序列的粗产物；
6)用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度，纯化好的液体放入冻干机中进行浓缩，冻干成阳离子聚合物—疏水胆酸白色粉末。
示意图见图2-2。
实施例3：聚唾液酸-聚乙二醇2000-甘氨胆酸的合成
1)在圆底烧瓶中，将109mg甘氨胆酸溶解于40ml N,N-二甲基甲酰胺中，加入100mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和50mg N-羟基琥珀酰亚胺作为缩合剂，室温下活化2h，
2)将270mg的一端叔丁基保护的氨基聚乙二醇2000加入上述溶液中，并加入200μl三乙胺，室温下继续反应24h，
3)反应结束后，透析，冷冻干燥。
4)将12mg一端叔丁基保护的聚乙二醇2000-甘氨胆酸加入2ml二氯甲烷中，缓慢滴加1ml三氟乙酸，室温搅拌2h，旋蒸除去三氟乙酸和二氯甲烷，得到氨基聚乙二醇2000-甘氨胆酸，加水溶解，
5)将60mg聚唾液酸溶解于10ml乙磺酸缓冲液中，加入300mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和6mg N-羟基琥珀酰亚胺作为缩合剂，室温下活化25min，
6)将氨基聚乙二醇2000-甘氨胆酸加入乙磺酸缓冲液中，加入5N氢氧化钠调pH至约8，室温下继续反应12h，
7)反应结束后，透析，冷冻干燥，经1H-NMR验证，即得聚唾液酸-聚乙二醇2000-甘氨胆酸白色粉末。
示意图见图3-1。
实施例4：硫酸软骨素-聚乙二醇7500-牛磺胆酸的合成
1)在圆底烧瓶中，将60mg牛磺胆酸溶解于20mlN,N-二甲基甲酰胺中，加入50mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和25mg N-羟基琥珀酰亚胺作为缩合剂，室温下活化2h，
2)将500mg一端叔丁基保护的氨基聚乙二醇7500加入上述溶液中，并加入100μl三乙胺，室温下继续反应24h，
3)反应结束后，透析，冷冻干燥。
4)将20mg一端叔丁基保护的聚乙二醇7500-牛磺胆酸加入2ml二氯甲烷中，缓慢滴加1ml三氟乙酸，室温搅拌2h，旋蒸除去三氟乙酸和二氯甲烷，得到氨基聚乙二醇7500-牛磺胆酸，加水溶解，
5)将100mg硫酸软骨素溶解于10ml乙磺酸缓冲液中，加入600mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和12mg N-羟基琥珀酰亚胺作为缩合剂，室温下活化25min，
6)将氨基聚乙二醇7500-牛磺胆酸盐加入乙磺酸缓冲液中，加入5N氢氧化钠调pH至约8，室温下继续反应12h，
7)反应结束后，透析，冷冻干燥，经1H-NMR验证，即得硫酸软骨素-聚乙二醇7500-牛磺胆酸白色粉末。
示意图见图3-2。
实施例5：艾塞那肽载药纳米聚合物靶向递送系统的制备
1)在圆底烧瓶中，将600μg艾塞那肽与1.2mg低分子量鱼精蛋白-脱氧胆酸溶解于水溶液中，4℃下，以400rpm的转速搅拌2h,形成带正电的核心复合物；
2)将4mg聚唾液酸—聚乙二醇2000—甘氨胆酸溶于5ml甲醇中，旋转蒸发除去有机溶剂形成一层薄膜，用水溶解，将核心复合物加入水中自发形成纳米粒；
3)以2％的海藻糖作为冻干保护剂，将纳米粒制备成冻干粉装入肠溶胶囊中。
制备示意图见图4。
考察纳米粒在胆盐转运体高表达的SK-BR-3细胞上的摄取，通过流式实验进行定量测定，SK-BR-3细胞以3×105个/孔的密度接种于6孔板中，培养48h，然后加入不同纳米粒孵育1.5h，胰酶消化离心，弃去上清，细胞用PBS清洗3次，重悬分析，证明带有胆酸的纳米聚合物的体外摄取最好，结果见图5。
对纳米粒进行Cy7标记后，对小鼠进行灌胃，通过小动物实时成像考察小肠内的吸收情况，结果证明带有胆酸盐的纳米粒的主要吸收部位在回肠，见图6。
考察纳米粒的体内降糖效果，在db/db小鼠模型中，分为皮下给药组(剂量为20μg/kg)和灌胃给药组，灌胃组分为艾塞那肽游离药物组，载药纳米聚合物组，载药胆酸纳米聚合物组(剂量为300μg/kg)，结果证实载药胆酸纳米聚合物的降糖效果更好，见图7。对大鼠进行体内药动学试验，分为皮下给药组(剂量为20μg/kg)、载药纳米聚合物灌胃组、载药胆酸纳米聚合物灌胃组，结果证实载药胆酸纳米聚合物灌胃组的生物利用度是载药纳米聚合物灌胃组的2.2倍，结果见图8和表1。
表1载艾塞那肽纳米粒的体内药动
实施例6：胰岛素载药纳米聚合物靶向递送系统的制备
1)在圆底烧瓶中，将600μg胰岛素与1.5mg八聚精氨酸-鹅去氧胆酸溶解于水溶液中，4℃下，以400rpm的转速搅拌2h,形成带正电的药物复合物；
2)将12mg硫酸软骨素—聚乙二醇7500—牛磺胆酸溶于5ml甲醇中，旋转蒸发除去有机溶剂形成一层薄膜，用水溶解，将核心复合物加入水中自发形成纳米粒；
3)以2％的海藻糖作为冻干保护剂，将纳米粒制备成冻干粉装入肠溶胶囊中。
在电镜下观察纳米粒的形态，均一圆整，见图9。
建立体外Caco-2细胞模型，细胞密度2×105个/孔接种于聚碳酸酯膜12孔板中，在细胞顶端每孔加0.5ml细胞悬液，基底端每孔加1.5ml新鲜培养基，前两周每两天换一次液，以后每天换液，连续培养至21天，跨膜电阻大于800欧姆的视为模型成功建立。对纳米聚合物进行异硫氰酸荧光素荧光标记，通过激光共聚焦显微镜进行定性测定，加入不同浓度的纳米粒孵育并固定，苯基吲哚核染色，镜下观察，结果发现带胆酸的纳米聚合物的转运效率最高，见图10。
实施例7：siRNA基因载药纳米聚合物靶向递送系统的制备
1)在圆底烧瓶中，将200μg siRNA基因与2.5mg低分子量鱼精蛋白-熊去氧胆酸溶解于水溶液中，4℃下，以400rpm的转速搅拌2h,形成带正电的核心复合物；
2)将6mg透明质酸—聚乙二醇12000—牛磺胆酸溶于5ml甲醇中，旋转蒸发除去有机溶剂形成一层薄膜，用水溶解，将核心复合物加入水中自发形成纳米聚合物；
3)以4％的海藻糖作为冻干保护剂，将纳米聚合物制备成冻干粉装入肠溶胶囊中。
考察纳米聚合物的储存稳定性，将纳米混悬液分别储存于4℃一定的时间，通过粒径及分散度考察纳米粒的储存稳定性，稳定性良好，结果见图11。
本发明专利尽管通过详细的一般性说明和多个实施例对发明内容进行了表述，但仍能够在此基础上对其修改、添加、置换和某些子组合。因此，在本发明专利核心内容基础上进行的修改、添加、置换和子组合，均属于本发明专利要求保护的范围。