一种血卟啉衍生物在神经母细胞瘤治疗中的应用
阅读说明：本技术 一种血卟啉衍生物在神经母细胞瘤治疗中的应用 (Application of hematoporphyrin derivative in treatment of neuroblastoma ) 是由 范平生 李增 纪丽君 张腾跃 汪国兴 钱立庭 刘亚贝 杨广山 黄金 翁呈韬 樊高 于 2020-12-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于增加化疗药物敏感性的医药学领域,具体涉及一种血卟啉骈合维拉帕米片段化合物A2在神经母细胞瘤逆转化疗药物的耐受与增敏的用途。化合物A2不同程度的增敏化疗药物抑制神经母细胞瘤细胞增殖作用,表明化合物A2能够发展成为化疗药物的增敏剂或者逆转耐药剂,用于神经母细胞瘤患者的治疗。(The invention belongs to the field of medicine for increasing the sensitivity of chemotherapeutic drugs, and particularly relates to an application of a hematoporphyrin-fused verapamil fragment compound A2 in the tolerance and sensitivity enhancement of a neuroblastoma reversal chemotherapeutic drug. The different degrees of sensitization chemotherapeutic drugs of the compound A2 inhibit the proliferation of neuroblastoma cells, which indicates that the compound A2 can be developed into a sensitizer of the chemotherapeutic drugs or a reversal drug resistance agent for the treatment of neuroblastoma patients.)
技术领域
本发明属于增加化疗药物敏感性的医药学领域，具体涉及一种血卟啉骈合维拉帕米片段化合物A2在神经母细胞瘤逆转化疗药物的耐受与增敏的用途。
技术背景
神经母细胞瘤(Neuroblastoma，NB)是小儿最常见的颅外实体瘤，起源于神经嵴，是好发于幼儿期交感和副交感神经节的异质性恶性实质肿瘤，占15岁以下青少年恶性肿瘤的8％，其年发病率为0.3/10万-0.5/10万，仅次于白血病及中枢神经系统肿瘤[1]。由于NB具有原发部位隐匿、早期诊断困难、恶性程度高、进展迅速和易早期转移等特点，传统的治疗方法包括手术、化疗和放疗等治疗效果并不乐观，主要原因之一是化疗过程中产生原发或继发耐药现象[2]。如何提高化疗敏感性，逆转耐药成为NB治疗中亟待解决的难题。
维拉帕米(Verapamil，VER)是一种耐药逆转剂，VER是早期发现的可以改变细胞内化疗药物浓度而降低肿瘤耐药性的药物，实验研究表明，VER可以明显提高恶性肿瘤细胞对化学药物的敏感性[3]。该药物能够逆转肿瘤多药耐药(multiple drug resistance，MDR)的有效浓度为6.0-10.0μmol/L，但是当维拉帕米的静脉血药浓度超过1.0-2.0μmol/L就会出现心血管不良反应，如心率下降、血压下降、房室传导阻滞等[4]。因此，口服、静脉应用维拉帕米逆转肿瘤细胞多药耐药的应用受到限制。VER联合化疗药物靶血管灌注和瘤体局部注射有效，然而恶性实体肿瘤生长及转移部位的特殊性、介入治疗要求一定的设备和医生的技能，这样很多恶性实体肿瘤失去此有效方法，这些因素成为限制临床应用VER转肿瘤化疗药物耐受的主要原因。
血卟啉为暗红色结晶性粉末，易溶于甲醇，乙醇，己醇和氯仿等有机溶剂，难溶于水，乙醚及稀无机酸。血卟啉盐溶于水。光敏物质，在肿瘤组织中选择性潴留，在有氧的条件下，光敏剂与分子氧及其他物质作用产生活性氧组分(reactive oxygen species，ROS)，如单线态氧和氧自由基，这些活性氧分子易与多种生物分子反应，引起脂类、蛋白质、核酸和其他细胞组分的损伤，破坏组织、细胞，最终杀灭肿瘤细胞和组织己达到治疗目的。生物特性主要表现为特异性聚集，即为血卟啉及衍生物可以在肿肾、脾、皮肤、瘤、肝、骨等组织中选择性积聚并滞留。通常来说，癌细胞对血卟啉的亲和力比正常细胞大10倍，因此血卟啉在癌细胞中的浓度远大于正常的组织细胞[5]，癌细胞内的滞留时间比较长，在上述正常组织细胞中血卟啉及其衍生物数小时可清除，经过48-72小时之后，正常组织中的血卟啉己完全排出，此时它几乎全部滞留在癌细胞内。经过特定波长的光照射，从而到达治疗癌症目的[6]。但由于血卟啉极性较低，因此不能直接通过静脉给药，从而极大的限制了其在临床中的应用。
参考文献：
[1]Irwin MS,Park JR.Neuroblastoma:Paradigm for precision medieine[J].Pediatr Clin North Am.2015；62(1):225-256.
[2]司莹莹，李爱敏，王晓莉等.Am80对神经母细胞瘤细胞化疗敏感性的影响及机制研究[J].中国小儿血液与肿瘤杂志,2018,23(6):307-311.
[3]Yeh JM,Tramontano AC,Hur C.Comparative effectiveness of adjuvantchemoradiotherapy after gastrectomy among older patients with gastricadenocarcinoma:a SEER-Medicare study[J].Gastric cancer,2017；10(2):1007-1020.
[4]Chen L,Ma LG.The conversion therapy for unresectable gastriccancer[J].Chinese journal of surgery,2016；54(3):169-171.
[5]Kyrochristos ID,Glantzounis GK,Ziogas DE,Gizas I,Schizas D,Lykoudis EG,Felekouras E,Machairas A,Katsios C,Liakakos T,Cho WC,RoukosDH.From Clinical Standards to Translating Next-Generation Sequencing Researchinto Patient Care Improvement for Hepatobiliary and Pancreatic Cancers.Int JMol Sci.2017；18(1).pii:E180.
[6]Krawczenko A,Bielawska-Pohl A,Wojtowicz K,Jura R,Paprocka M,WojdatE,U,Klimczak A,Grillon C.Expression and activity of multidrugresistance proteins in mature endothelial cells and their precursors:Achallenging correlation.PLoS One.2017；12(2):e0172371.
发明内容
本发明的目的之一在于提供了一种用于治疗神经母细胞瘤的药物组合物，该药物由药学上有效剂量的血卟啉衍生物A2和化疗药物，以及药学上可接受的载体制得。
所述血卟啉衍生物A2由血卟啉和维拉帕米片段的骈合形成，其具有如下结构：
所述维拉帕米片段为3,4-二甲氧基苯乙胺，其结构如下：
优选的，所述化疗药物为阿霉素(ADM)。
优选的，所述有效剂量为血卟啉衍生物A2占药物组合物的质量分数为0.1-99％。
优选的，所述有效剂量为血卟啉衍生物A2占药物组合物质量分数为10％、20％、30％、50％、70％。
本申请中所述药学上可接受的载体包括赋形剂、稳定剂、抗氧化剂、着色剂、稀释剂、缓释剂等一种或几种功能的辅料，如淀粉、脂类、蜡、糊精、蔗糖、乳糖、微晶纤维素、明胶、柠檬酸、无机盐类、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素等。
优选的，所述药物组合物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂中任意一种。
本发明的另一目的在于提供血卟啉类衍生物A2在制备抗神经母细胞瘤药物的增敏及逆转耐受中的应用。血卟啉类衍生物A2在抗肿瘤药物作用神经母细胞瘤的应用中增加抗肿瘤药物对神经母细胞瘤的抑制作用，增强了肿瘤细胞对药物的敏感性。
本发明的再一目的在于提供血卟啉衍生物A2与神经母细胞瘤化疗药物的联合应用，其特征在于，所述血卟啉衍生物A2用于逆转耐受或增敏化疗药物阿霉素(ADM)。
本发明还提供血卟啉衍生物A2在药理学上容许的盐在制备治疗神经母细胞瘤药物的增敏剂或者逆转耐受剂中的应用。
优选的，所述在药理学上容许的盐包括血卟啉衍生物A2与无机酸、有机酸、碱金属、碱土金属或碱性氨基酸中任一种成的盐；所述无机酸为盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸中的一种，所述有机酸为马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸，己二酸，棕榈酸，单宁酸中的一种，所述碱金属为锂，钠、钾中的一种；所述碱土金属为钙、镁中的一种；所述碱性氨基酸为赖氨酸。
发明有益效果如下：
1)考虑到：VER静脉应用的有效浓度所至毒性限制；体外实验和靶血管灌注、胸腹腔、局部注射对恶性实体肿瘤有良好的逆转效果；血卟啉在肿瘤组织中选择性潴留的特性；我们在国内外首次发明了血卟啉与维拉帕米片段合成新的化合物并验证了本全新的化合物联合化疗药物抗神经母细胞瘤作用的研究。
2)本发明提供了具有血卟啉衍生物对恶性实体肿瘤在逆转神经母细胞瘤化疗药物耐受及增敏的用途；
3)从血卟啉与维拉帕米功能基团制备得到几种对恶性实体肿瘤在逆转神经母细胞瘤化疗药物耐受及增敏的衍生物，在治疗恶性肿瘤具有广阔的应用前景；
4)本发明的方法易掌握、发明的衍生物能够产业化生产，并且本发明所涉及的血卟啉衍生物为全新结构可应用与抗肿瘤领域。
附图说明
图1：血卟啉衍生物A2在神经母细胞瘤细胞中的安全范围；
图2：CCK8法检测ADM+血卟啉衍生物A2作用于神经母细胞瘤SH-SY5Y的药物敏感性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做出更为具体的说明，除非另有说明，本文中所使用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义。本文中使用的“A2”仅作为对本申请使用的血卟啉衍生物的命名，并不用于限制该血卟啉衍生物。
实施例1
血卟啉衍生物A2的合成
将血卟啉与维拉帕米片段(3,4-二甲氧基苯乙胺)在BOP地催化下，通过酰胺缩合反应合成目标产物即血卟啉衍生物A2。合成流程如下：
具体操作为：
将0.5mmol血卟啉溶于盛有30mL二甲基甲酰胺(DMF)的反应容器中，并加入4mmol3,4-二甲氧基苯乙胺和0.5mmol苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)，室温搅拌3小时，TLC检测反应进程；待反应结束后，向反应容器中加入100mL水，并将反应容器放于冰上等待析出固体；抽滤所述析出固体并干燥，即得到粗产物；将粗产物溶于乙酸乙酯中，加入相当于粗产物的三倍质量的量的200-300目硅胶，真空旋转蒸发乙酸乙酯；在硅胶柱层析中以二氯甲烷：甲醇体积比50:1为洗脱剂，根据血卟啉衍生物A2与杂质极性不同，被洗脱下来时间不同，将血卟啉衍生物A2与杂质分离，得到深棕色血卟啉衍生物A2固体纯品。
本实施例制备的血卟啉衍生物A2的氢谱和质谱如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.52–8.46(m,2H),8.27(d,J＝11.0Hz,2H),8.16(s,1H),7.86(t,J＝4.8Hz,1H),6.85–6.77(m,4H),6.74–6.66(m,2H),4.85(dd,J＝16.5,5.2Hz,2H),4.71(ddtd,J＝7.3,6.3,5.1,1.0Hz,1H),4.45(qd,J＝6.7,5.4Hz,1H),3.82–3.77(m,12H),3.45(td,J＝5.3,4.8Hz,2H),3.14(q,J＝5.3Hz,5H),3.01–2.92(m,2H),2.71(tt,J＝5.3,1.0Hz,4H),2.55(dd,J＝16.4,0.4Hz,2H),2.50–2.39(m,4H),2.09(s,3H),1.98(d,J＝1.0Hz,3H),1.94(s,3H),1.28–1.16(m,6H).MS(ESI):m/z 925.5[M+H]+。
实施例2
CCK8试剂盒检测化合物A2和化疗药物抑制神经母细胞瘤细胞增值活性
实验材料：血卟啉衍生物A2由血卟啉和维拉帕米的部分片段依据实施例1合成，纯度不低于95％；神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y由安徽医科大学药学院提供；血卟啉，3,4-二甲氧基苯乙胺即维拉帕米片段，卡特缩合剂，BOP，DIC，5-氨基-2-(3,4-二甲氧基苯基)-2-异丙基戊腈，阿霉素(ADM)，奥沙利铂(Oxaliplatin)购自拜尔迪公司，纯度均大于99％。CCK8试剂盒购自biosharp Life sciences公司。
实验方法：
1.细胞复苏
1)从液氮罐中取出冻存管，直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2)从37℃水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液1ML，注入离心管并加入2ML培养液，混合后低速离心，弃去上清，再重复用培养液洗一次。
3)将培养液适当稀释后，接种于培养瓶，放在37℃培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养到一定密度时进行传代。
2.细胞传代培养
将神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株分别培养于含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中。每天观察细胞生长的情况，当细胞在培养瓶中生长到约90％汇合度(贴壁细胞)时，按照1:3到1:5的比例传代，约每隔2-4天传代一次。方法如下：
1)用1×磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次。
2)加入1-2ml 0.25％胰蛋白酶消化液消化，置于37℃培养箱中数分钟。待到细胞分离。
3)用含10％胎牛血清的合适培养基终止消化。将细胞分装于新的培养瓶中，继续培养。
3.细胞冻存
1)取培养至对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化，收集于离心管中并计数，离心。
2)弃去胰蛋白酶和旧的培养液，加入配置好的冻存液，冻存液中细胞的最终浓度为0.5-1×107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每管加1-1.5ml。
将冻存管放入冻存盒中置于-80℃，5小时后移入液氮罐中保存。
4.CCK8实验检测细胞药物敏感性
先进行血卟啉衍生物A2对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的安全性实验，用于确定血卟啉衍生物A2的安全范围，以便后续实验。
将神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y分别按照5000/孔的密度接种到96孔板中，细胞贴壁后除去培养基，用PBS冲洗细胞两次。用补充有10％FBS和不同浓度的血卟啉衍生物A2的新鲜培养基，每孔100μL，在37℃，5％CO2条件下培养24小时。血卟啉衍生物A2使用50,20,10,5,2.5,1.25μmol/L共6种浓度梯度。温育后将每孔中液体弃去，在96孔板中每孔再加入CCK8溶液10μL和90μL的不含血清的培养基，并将96板再温育2小时。然后将96孔板放在酶标仪中450nm处测吸光度值(OD450值)。空白组为不加细胞只加培养基，对照组为不加药细胞组。细胞抑制率＝1-(实验组OD450-空白组OD450)/(对照组OD450-空白组OD450)。
血卟啉衍生物A2在神经母细胞瘤细胞中的安全范围结果如图1、图2所示，从图上可以看出，血卟啉衍生物A2在低于等于10μM时对神经母细胞瘤细胞是无毒的，因此在检测细胞药物敏感性实验中分别选择血卟啉衍生物A2浓度为10μM进行实验，以排除血卟啉衍生物A2自身对实验结果的干扰。
4.1血卟啉衍生物A2对神经母细胞瘤细胞G292的药物敏感性
将神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y按照5000/孔的密度接种到96孔板中，细胞贴壁后除去培养基，用PBS冲洗细胞两次。用补充有10％FBS和不同浓度的药液的新鲜培养基37℃，5％CO2条件下培养各细胞24小时,每孔100μL。上述药液为神经母细胞瘤常用化疗药物阿霉素(ADM)，奥沙利铂(Oxaliplatin)，使用20,10,5,2.5,1.25μmol/L共5种浓度梯度。温育后将每孔中液体弃去，在96孔板中每孔再加入CCK8溶液10μL和90μL的不含血清的培养基，并将96板再温育2小时。然后将96孔板放在酶标仪中450nm处测吸光度值(OD450值)。通过计算得到用药组相对于对照组的细胞增值比率。空白组为不加细胞只加培养基，对照组为不加药细胞组。
细胞抑制率＝1-(实验组OD450-空白组OD450)/(对照组OD450-空白组OD450)。
以上实验均进行了三次重复，所得结果用SPSS统计分析软件进行分析作图，分析细胞抑制率为50％时所需的药物浓度，结果如表1所示。
表1：化疗药物对神经母细胞瘤细胞存活率的影响
通过表中单用不同的化疗药物对神经母细胞瘤细胞作用的IC50值与血卟啉衍生物A2+不同化疗药物后对细胞作用的IC50值可以看出，奥沙利铂(Oxaliplatin)联合血卟啉衍生物A2作用肿瘤细胞较单用奥沙利铂(Oxaliplatin)作用肿瘤细胞，其IC50值下降不明显，但阿霉素(ADM)在与血卟啉衍生物A2共同使用后对肿瘤细胞的作用所测得IC50值显示出显著的降低，其中阿霉素(ADM)单用的IC50值为857.565，阿霉素(ADM)+血卟啉衍生物A2联用的IC50值为74.015，有显著性差异，提示该血卟啉衍生物A2对化疗药物阿霉素(ADM)有增敏的作用。
进一步分析阿霉素，阿霉素+血卟啉衍生物A2对神经母细胞瘤细胞的作用，结果如图2所示。
根据图2可知，随着阿霉素(ADM)浓度的不断增加，对肿瘤细胞的抑制越明显，肿瘤细胞存活率越低，其中在浓度梯度中，相同浓度条件下阿霉素(ADM)+血卟啉衍生物A2的抑制作用明显高于阿霉素(ADM)单用组，并且所得IC50值也显示出相应的优势。
上述实验表明，针对神经母细胞瘤细胞株，血卟啉衍生物A2可以不同程度增强神经母细胞瘤常用化疗药物阿霉素(ADM)对神经母细胞瘤细胞的敏感性，增强阿霉素(ADM)对神经母细胞瘤细胞G292的抑制敏感性作用，提示血卟啉衍生物A2对化疗药物有增敏的作用。
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