一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体及其制备和用途
阅读说明：本技术 一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体及其制备和用途 (Nano antibody aiming at Cry3Bb protein and preparation and application thereof ) 是由 邱雨楼 俞晓平 叶子弘 付贤树 张明洲 崔海峰 游阿娟 于 2021-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体及其制备和用途,包括所述的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明制备的纳米抗体可替代传统抗体,应用于Cry3Bb蛋白的免疫学检测分析,该纳米抗体具有制备简单、成本低、结合活性高等特点。(The invention discloses a nano antibody aiming at Cry3Bb protein, and preparation and application thereof, wherein the amino acid sequence of the nano antibody is shown as SEQ ID NO. 1. The nano antibody prepared by the invention can replace the traditional antibody and be applied to the immunological detection and analysis of Cry3Bb protein, and the nano antibody has the characteristics of simple preparation, low cost, high binding activity and the like.)
技术领域
本发明属于基因工程抗体和食品生物技术领域，尤其是涉及一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体及其制备和用途。
背景技术
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)在形成孢子阶段会产生一种伴胞晶体蛋白，对鳞翅目、鞘翅目等多种昆虫具有高效毒杀作用，被称为Bt蛋白或δ-内毒素。目前已知的Bt蛋白超过400种，根据氨基酸序列同源性，分为晶体蛋白(crystal protein,Cry)和细胞溶解蛋白(cytolytic protein,Cyt)两大类。其中，Cry蛋白被广泛应用于转基因农作物的害虫防治中，常见的种类包括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry2A和Cry3Bb等。近年来，转基因农作物的种植面积呈快速增长趋势，但转基因农作物的安全性并未得到广泛认同，转基因农作物可能对生态环境和人体健康造成潜在危害。为安全起见，许多国家已经对转基因产品实行了标签制度。因此，对转基因农作物及其产品中的Bt Cry蛋白进行有效监控和快速检测是十分必要的。
Bt Cry蛋白的检测方法主要是基于核酸和蛋白质水平的分析，包括PCR方法和ELISA方法。PCR方法具有灵敏度高、准确性高等特点，但不能对表达的Bt Cry蛋白进行定量检测，且需要专业的仪器设备和操作人员。而ELISA方法具有简便、快速、低耗等特点，适合于农作物中Cry蛋白的现场快速定性和定量检测。其中，高特异性、高亲和性抗体的制备是ELISA方法建立的前提和关键。
纳米抗体(Nanobody)源于驼科动物(骆驼、羊驼等)体内天然缺失轻链的重链抗体，克隆重链抗体的可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为单域重链抗体，也称为纳米抗体。纳米抗体是目前已知最小的功能性抗体片段，只含有3个互补决定区(Complementarity-determining region,CDR)，却具有与普通抗体相同的抗体功能。与普通抗体相比，纳米抗体的CDR3更长，可以形成凸环结构，能够伸入目标蛋白的凹槽、裂缝等普通抗体难以达到的表位。同时，纳米抗体还具有高亲和力、高水溶性、易表达等特点。因此，纳米抗体是一种优良的抗体材料，可替代传统抗体，广泛应用于医疗诊断、食品安全检测等多个领域。然而，目前，针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体还未见报道。因此，迫切需要开发有效的针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，提供一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体及其制备和用途。
为了实现上述目的，本发明的第一方面，提供了一种针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体，所述的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述纳米抗体包含框架区及互补决定区，其中框架区包括以下4段FR的氨基酸序列：SEQ ID NO.2所示的FR1、SEQ ID NO.4所示的FR2、SEQ ID NO.6所示的FR3及SEQID NO.8所示的FR4；所述互补决定区包括以下3段CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO.3所示的CDR1、SEQ ID NO.5所示的CDR2及SEQ ID NO.7所表示的CDR3。互补决定区主要负责抗原的识别，框架区结构相对稳定，主要起着支撑维持蛋白质结构的作用。
本发明的第二方面，提供了一种编码如上述针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明的第三方面，提供了一种重组表达载体，包含如权利要求3所述的核苷酸。
本发明的第四方面，提供了一种重组工程菌，包含如权利要求4所述的重组表达载体。
本发明的第五方面，提供了一种如上述针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体在Cry3Bb免疫学检测分析中的应用。
本发明的第六方面，提供了一种如上述的针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1：Cry3Bb纳米抗体的淘选；
S2：Cry3Bb纳米抗体阳性噬菌体克隆的鉴定；
S3：噬菌体展示纳米抗体的扩增及活性鉴定；
S4：Cry3Bb纳米抗体在大肠杆菌中的表达及纯化。
可选的，所述S1中重复进行多轮淘选，其中多轮淘选过程中包被的Cry3Bb蛋白的浓度依次减少，PBST的洗涤次数依次增加。
可选的，所述S2采用phage-ELISA进行阳性噬菌体克隆的鉴定，当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，初步判定为阳性克隆。
可选的，所述S4的具体步骤为：
S41：将噬菌粒载体上的纳米抗体基因亚克隆至表达载体pET-30a中，获得重组表达载体；
S42：将重组表达载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，培养后涂布于LB-K平板，继续培养；
S43：从LB-K平板上挑取单菌落接种于LB培养基中进行培养，将培养物接种于LB-KG培养基中；
S44：当培养物菌体浓度OD600达到0.5时，向培养物中加入IPTG，振荡培养；
S45：将S44获得的培养物离心收集菌体沉淀，重悬细胞于PBS溶液，超声破碎后，离心取上清，即得纳米抗体粗提液；
S46：将纳米抗体粗提液经镍柱进行纯化，得到纯化的纳米抗体蛋白
综上所述，本发明具有以下有益效果：
本发明制备的纳米抗体可替代传统抗体，应用于Cry3Bb蛋白的免疫学检测分析，该纳米抗体具有制备简单、成本低、结合活性高等特点。
附图说明
图1为本发明纳米抗体的氨基酸序列示意图；
图2本发明纳米抗体结合活性测定结果示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。并且下面对本申请涉及的术语做进一步的说明，若无特殊指明，按照本领域通用的一般所属进行理解和解释。
纳米抗体：骆驼科动物重链抗体的可变区；
氨基酸序列框架区FR1，纳米抗体的第一段恒定区序列；
氨基酸序列框架区FR2，纳米抗体的第二段恒定区序列；
氨基酸序列框架区FR3，纳米抗体的第三段恒定区序列；
氨基酸序列框架区FR4，纳米抗体的第四段恒定区序列；
氨基酸序列互补决定区CDR1，纳米抗体的第一段可变区序列；
氨基酸序列互补决定区CDR2，纳米抗体的第二段可变区序列；
氨基酸序列互补决定区CDR3，纳米抗体的第三段可变区序列；
实施例1：针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体的淘选
将Cry3Bb蛋白用PBS(0.01M，pH 7.4)稀释至100μg/mL，加入酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；用PBST(0.01M PBS，pH 7.4，含0.1％Tween-20)洗涤6次，加入300μL的3％BSA-PBS(3％OVA-PBS)，37℃封闭2h；PBST洗板6次，加入100μL的噬菌体展示天然纳米抗体库(滴度约2.0×1011pfu)，37℃孵育1h；PBST洗涤6次，加入100μL的Glycine-HCl(0.2M，pH 2.2)洗脱8min后，立即加入15μL Tris-HCl(1M，pH 9.0)中和，取10μL洗脱噬菌体测滴度，其余的感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1进行扩增，扩增噬菌体经PEG/NaCl纯化后用于下一轮的淘选。
随后重复进行3轮淘选，淘选步骤与第一轮基本相同，包被的Cry3Bb蛋白的浓度分别减少为50μg/mL，25μg/mL和10μg/mL，PBST的洗涤次数分别增加为9次，12次和15次。
实施例2：针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体阳性噬菌体克隆的鉴定
从上述实施例1中第三轮和第四轮噬菌体滴度平板上随机挑取48个克隆，接种于2×YT-A培养基，37℃振荡培养过夜；按1％接种量(v/v)接种于1mL 2×YT-AG培养基，37℃振荡培养至OD600约为0.5；加入辅助噬菌体M13K07，37℃振荡培养45min；将培养物3000rpm离心10min后，加入1mL 2×YT-AK培养基重悬菌体，30℃200rpm振荡培养4-5h；将培养物于4℃下10000rpm离心10min，收集噬菌体上清，采用phage-ELISA进行阳性噬菌体克隆的鉴定。
具体方法为：将Cry3Bb蛋白用0.01M PBS稀释至5μg/mL，加入酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗板3次，加入300μL的5％脱脂奶粉，37℃封闭2h；PBST洗板3次，加入100μL噬菌体，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL的HRP标记M13二抗(1:5000稀释)，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL TMB底物溶液，显色10min，在450nm波长处读取吸收值。当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，初步判定为阳性克隆。将阳性噬菌体克隆送生物公司进行测序，获得核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。根据核苷酸测序结果及密码子表可翻译获得Cry3Bb纳米抗体的氨基酸序列如图1所示。Cry3Bb纳米抗体包含框架区及互补决定区，其中框架区包括以下4段FR的氨基酸序列：SEQ ID NO.2所示的FR1、SEQ ID NO.4所示的FR2、SEQID NO.6所示的FR3及SEQ ID NO.8所示的FR4；所述互补决定区包括以下3段CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO.3所示的CDR1、SEQ ID NO.5所示的CDR2及SEQ ID NO.7所表示的CDR3。具体见下表：
实施例3：噬菌体展示纳米抗体的扩增及活性鉴定
(1)噬菌体展示纳米抗体的扩增
将实施例2获得的阳性噬菌体克隆细胞接种于50mL2×YT-AG培养基中，37℃振荡培养至OD600约为0.5；加入辅助噬菌体M13K07，37℃振荡培养45min；将培养物10000rpm离心10min后，加入50mL 2×YT-AK培养基重悬菌体，30℃200rpm振荡培养过夜；将培养物于4℃下10000rpm离心10min，收集上清，加入1/6体积的PEG/NaCl，混匀后4℃静置4h；4℃下10000rpm离心10min，弃上清，将沉淀重悬于0.5mL PBS(0.01M，pH 7.4)中，再加入0.5mL甘油于-80℃保存备用。
(2)扩增噬菌体展示纳米抗体结合活性的鉴定
将Cry3Bb蛋白用0.01M PBS稀释至1μg/mL，加入酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗板3次，加入300μL的5％BSA，37℃封闭2h；PBST洗板3次，加入100μL倍比稀释的噬菌体展示纳米抗体(1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000)，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL的HRP标记M13二抗(1:5000稀释)，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL TMB底物溶液，显色10min，在450nm波长处读取吸收值。选择吸收值在1.0-1.5之间的稀释倍数为扩增噬菌体展示纳米抗体的最适稀释倍数。
将Cry3Bb蛋白倍比稀释(1000ng/mL、500g/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.63ng/mL)后加入酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗板3次，加入300μL的5％BSA，37℃封闭2h；PBST洗板3次，加入100μL上述最适稀释倍数的噬菌体展示纳米抗体，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL的HRP标记M13二抗(1:5000稀释)，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μL TMB底物溶液，显色10min，在450nm波长处读取吸收值，结果如图2所示。
实施例4：针对Cry3Bb蛋白的纳米抗体在大肠杆菌中的表达及纯化
将噬菌粒载体上的纳米抗体基因亚克隆至表达载体pET-30a中，再将重组表达载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，将细胞培养后涂布于LB-K平板，37℃培养过夜；从LB-K平板上挑取单菌落接种于5mLLB培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，将过夜培养物按1％接种量(v/v)接种于50mL的LB-KG培养基中，37℃，200rpm振荡培养；当培养物菌体浓度OD600达到0.5时，向培养物中加入终浓度为0.1mM的IPTG，30℃，200rpm振荡培养过夜；将培养物于4℃，8000rpm离心15min收集菌体沉淀；重悬细胞于5mL预冷的PBS溶液，超声破碎10min后，8000rpm离心15min取上清，即得纳米抗体粗提液；将纳米抗体粗提液经镍柱进行纯化，得到纯度90％以上的纳米抗体蛋白。
实施例5：纳米抗体在Cry3Bb免疫检测中的应用
(1)标准曲线的建立
将Cry3Bb多克隆抗体稀释至1μg/mL，4℃包被过夜；PBST洗涤3次，加入300μL的5％BSA，37℃封闭2h；PBST洗板3次，加入100μL不同浓度的Cry3Bb蛋白标准品，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入实施例3获得的噬菌体展示纳米抗体/实施例4获得的纳米抗体蛋白，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入HRP标记的抗M13二抗/抗His标签二抗，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入100μLTMB底物溶液，显色15min，在450nm波长处读取吸收值，建立ELISA标准曲线。
(2)样品的检测
称取1g待检样品(市售玉米)，粉碎后加入5mLPBS溶液，充分振荡1h；10000rpm离心10min后，取上清液用滤纸进行过滤，取1mL滤液与1mLPBS混匀，即为样品提取液。用样品提取液替代上述Cry3Bb蛋白标准品，按照标准曲线方法进行操作，根据标准曲线推算出样品中Cry3Bb蛋白的含量。
以上所述的实施方式，并不构成对该技术方案保护范围的限定。任何在上述实施方式的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在该技术方案的保护范围之内。