7.

具体实施方式

7.1.定义

除非本文另有定义，否则与本公开内容相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关的命名法和技术是本领域熟知和常用的那些。除非另有说明，否则本公开内容的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法进行，并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所描述的。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)和Ausubel等，Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)，以及Harlow和LaneAntibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1990)，其通过引用并入本文。酶促反应和纯化技术根据生产厂商的说明书进行，如本领域中通常完成的或如本文所述的。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学相关使用的术语，以及其实验室程序和技术是本领域熟知和常用的那些。可以用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂、和递送以及患者治疗的标准技术。

除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义：

术语“免疫球蛋白”指一类结构相关的蛋白，其通常包含两对多肽链：一对轻(L)链和一对重(H)链。在“完整免疫球蛋白”中，所有这四条链均通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已被很好地表征。参见，例如，Paul,Fundamental Immunology 7th ed.,Ch.5(2013)Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA。简言之，每条重链通常包含重链可变区(V_H)和重链恒定区(C_H)。重链恒定区通常包含三个结构域，缩写为C_H1、C_H2和C_H3。每条轻链通常包含轻链可变区(V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区通常包含一个结构域，缩写为C_L。

术语“重组多克隆蛋白(RPP)”指包含特异性结合至抗原或表位的一个或多个抗原结合结构域的蛋白。在一些实施方式中，抗原结合结构域以与天然存在的抗体相似的特异性和亲和性结合抗原或表位。在一些实施方式中，RPP包括抗体。在一些实施方式中，RPP由抗体组成。在一些实施方式中，RPP基本上由抗体组成。在一些实施方式中，RPP包括替代支架。在一些实施方式中，RPP由替代支架组成。在一些实施方式中，RPP基本上由替代支架组成。在一些实施方式中，RPP包括抗体片段。在一些实施方式中，RPP由抗体片段组成。在一些实施方式中，RPP基本上由抗体片段组成。

术语“抗体”在本文中以其最广泛的含义使用，包括某些类型的免疫球蛋白分子，其包含一个或多个特异性结合至抗原或表位的抗原结合结构域。抗体特别地包括完整抗体(例如，完整免疫球蛋白)、抗体片段和多特异性抗体。抗原结合结构域的一个实例是由V_H-V_L二聚体形成的抗原结合结构域。抗体包括RPP的一种类型。

术语“替代支架”是指一种分子，其中一个或多个区域可以多样化以产生一个或多个与抗原或表位特异性结合的抗原结合结构域。在一些实施方式中，抗原结合结构域以与天然存在的抗体相似的特异性和亲和性结合抗原或表位。示例性替代支架包括来源于纤连蛋白(例如，Adnectins^TM)、β-夹心(例如，iMab)、脂质运载蛋白(例如，)、EETI-II/AGRP、BPTI/LACI-D1/ITI-D2(例如，Kunitz结构域)、硫氧环蛋白肽适体、蛋白A(例如，)、锚蛋白重复序列(例如，DARPins)、γ-B-晶状体蛋白/泛素(例如，Affilins)、CTLD3(例如，四联蛋白)、Fynomers和(LDLR-A模块)(例如，Avimers)的那些。在Binz等，Nat.Biotechnol.,2005 23:1257-1268；Skerra,Current Opin.in Biotech.,200718:295-304；和Silacci等，J.Biol.Chem.,2014,289:14392-14398中提供了替代支架的其他新型；其每一个的全部内容通过引用并入。替代支架包括RPP的一种类型。

术语“抗原结合结构域”指能够特异性结合至抗原或表位的ABP的部分。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指具有与天然存在的抗体结构基本相似的结构并且具有包含Fc区的重链的抗体。

术语“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C末端区域，在天然存在的抗体中，其与Fc受体和补体系统的某些蛋白相互作用。各种免疫球蛋白Fc区的结构以及其中包含的糖基化位点是本领域公知的。参见Schroeder和Cavacini,J.Allergy Clin.Immunol.,2010,125:S41-52，其全部内容通过引用并入。Fc区可以是天然存在的Fc区，或者如本公开内容其他地方所述的经修饰的Fc区。

V_H和V_L区可以进一步细分为高变区(“高变区(HVR)；”也称为“互补性决定区”(CDR))，其中散布着更保守的区域。更保守的区域称为框架区(FR)。每个V_H和V_L通常包含三个CDR和四个FR，其按照以下顺序排列(从N末端到C末端)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。CDR参与抗原结合，并影响抗体的抗原特异性和结合亲和性。参见Kabat等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest 5th ed.(1991)Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD，其全部内容通过引用并入。

基于其恒定结构域的序列，来自任何脊椎动物物种的轻链可以归为两种类型之一，称为κ和λ。

来自任何脊椎动物物种的重链可以归为五种不同类型(或同种型)之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类别也分别称为α、δ、ε、γ和μ。IgG和IgA类别根据序列和功能的差异进一步分为亚类。人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。

CDR的氨基酸序列边界可由本领域技术人员使用多种已知编号方案中的任一种确定，包括由Kabat等，同上(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等，1997,J.Mol.Biol.,273:927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等，1996,J.Mol.Biol.262:732-745(“Contact”编号方案)；Lefranc等，Dev.Comp.Immunol.,2003,27:55-77(“IMGT”编号方案)；和Honegge和Plückthun,J.Mol.Biol.,2001,309:657-70(“AHo”编号方案)描述的那些；其每一个的全部内容通过引用并入。

表1提供了CDR1-L(V_L的CDR1)、CDR2-L(V_L的CDR2)、CDR3-L(V_L的CDR3)、CDR1-H(V_H的CDR1)、CDR2-H(V_H的CDR2)和CDR3-H(V_H的CDR3)的位置，如通过Kabat和Chothia方案鉴定的。对于CDR1-H，使用Kabat和Chothia编号方案两者提供残基编号。

例如，可以使用抗体编号软件分配CDR，如从www.bioinf.org.uk/abs/abnum/获得的Abnum，以及在Abhinandan和Martin,Immunology,2008,45:3832-3839中对其进行了描述，其全部内容通过引用并入。

*CDR1-H的C末端，当使用Kabat编号惯例编号时，在32和34之间变化，其取决于CDR的长度。

当涉及抗体重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号方案”(例如，如在Kabat等中报道的，同上)。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，如完整抗体的抗体结合或可变区。抗体片段包括例如Fv片段、Fab片段、F(ab’)₂片段、Fab’片段、scFv(sFv)片段和scFv-Fc片段。

“Fv”片段包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域非共价连接的二聚体。

除了重链和轻链可变结构域以外，“Fab”片段包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(C_H1)。Fab片段可以例如通过重组方法或通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生。

“F(ab’)₂”片段包含两个Fab’片段，其在铰链区附近通过二硫键连接。F(ab’)₂片段可以例如通过重组方法或通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生。F(ab’)片段可以被解离，例如，通过使用β-巯基乙醇处理。

“单链Fv”、“sFv”或“scFv”抗体片段包含在单一多肽链中的V_H结构域和V_L结构域。V_H和V_L通常通过肽接头连接。参见Plückthun A.(1994)。在一些实施方式中，接头是(GGGGS)n(SEQ ID NO:12190)。在一些实施方式中，n＝1、2、3、4、5或6。参见Antibodies fromEscherichia coli.In Rosenberg M.&Moore G.P.(Eds.),The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies vol.113(pp.269-315).Springer-Verlag,New York，其全部内容通过引用并入。

“scFv-Fc”片段包含附接至Fc结构域的scFv。例如，Fc结构域可以附接至scFv的C末端。Fc结构域可以在V_H或V_L之后，这取决于在scFv中可变结构域的方向(即，V_H-V_L或V_L-V_H)。可以使用本领域公知的或本文所述的任何适宜Fc结构域。在一些情况下，Fc结构域包含IgG4 Fc结构域。

术语“单域抗体”指其中抗体的一个可变结构域特异性结合抗原而不存在其他可变结构域的分子。单域抗体及其片段如在Arabi Ghahroudi等，FEBS Letters,1998,414:521-526和Muyldermans等，Trends in Biochem.Sci.,2001,26:230-245中所描述的，其每一个的全部内容通过引用并入。

“单特异性RPP”是包含与单个表位特异性结合的结合位点的RPP。单特异性RPP的实例是天然存在的IgG分子，其虽然是二价的，但在每个抗原结合结构域识别相同表位。结合特异性可以以任何适宜的化合价存在。

“多特异性RPP”是包含非特异性结合多于一个表位的结合位点的RPP。多特异性RPP的一个实例是结合不同血清型肺炎链球菌的抗体混合物。

术语“单克隆抗体”指来自一组基本同质的抗体的抗体。除了在单克隆抗体产生过程中通常可能出现的变体以外，一组基本上同质的抗体包含基本上相似并结合一个或多个相同表位的抗体。此类变体通常仅以少量存在。单克隆抗体通常通过包括从多种抗体中选择单一抗体的方法获得。例如，选择方法可以是从多个克隆中选择独特克隆，如杂交瘤克隆、噬菌体克隆、酵母克隆、细菌克隆或其他重组DNA克隆。可以进一步改变选择的抗体，例如，以提高对靶点的亲和性(“亲和性突变”)、使抗体人源化、提高其在细胞培养物中的产量和/或降低其在受试者中的免疫原性。

术语“多克隆抗体”指至少两种单克隆抗体的混合物。多克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的。

术语“嵌合抗体”指重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同来源或物种的抗体。

“人源化”形式的非人抗体是嵌合抗体，其包含来源于非人抗体的最小序列。人源化抗体通常是人抗体(受体抗体)，其中来自一个或多个CDR的残基被来自非人抗体(供体抗体)的一个或多个CDR残基替代。供体抗体可以是任何适宜的非人抗体，如具有所需特异性、亲和性或生物学效应的小鼠、大鼠、家兔、鸡或非人灵长类抗体。在一些情况下，受体抗体的选定框架区残基被来自供体抗体的相应康佳区残基替代。人源化抗体还包含在受体抗体或供体抗体中均未发现的残基。可以进行此类修饰以进一步完善抗体功能。对于进一步的细节，参见Jones等，Nature,1986,321:522-525；Riechmann等，Nature,1988,332:323-329；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,1992,2:593-596,其每一个的全部内容通过引用并入。

“人抗体”是这样一种抗体，其具有与由人或人细胞产生的或源自利用人抗体文库或人抗体编码序列的非人来源抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列(例如，从人类来源获得或从头设计)。人抗体明确排除人源化抗体。在一些实施方式中，啮齿动物经基因改造，用人抗体替代其啮齿动物抗体。

“分离的RPP”或“分离的核酸”是已从天然环境的组分中分离和/或回收的RPP或核酸。天然环境的组分可以包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白材料。在一些实施方式中，分离的RPP被纯化到足以获得至少15个N-末端或内部氨基酸序列残基的程度，例如通过使用旋转杯测序仪。在一些实施方式中，在还原或非还原条件下通过凝胶电泳(例如，SDS-PAGE)将分离的RPP纯化至均质，并通过考马斯蓝或银染进行检测。分离的RPP包括重组细胞内的原位RPP，因为RPP天然环境的至少一种组分不存在。在一些方面中，分离的RPP或分离的核酸通过至少一个纯化步骤制备。在一些实施方式中，分离的RPP或分离的核酸被纯化至以重量计至少80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方式中，分离的RPP或分离的核酸被纯化至以体积计至少80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方式中，分离的RPP或分离的核酸以溶液形式提供，所述溶液包含以重量计至少85％、90％、95％、98％、99％至100％的RPP或核酸。在一些实施方式中，分离的RPP或分离的核酸以溶液形式提供，所述溶液包含以体积计至少85％、90％、95％、98％、99％至100％的RPP或核酸。

“亲和性”指分子(例如，RPP)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原或表位)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“亲和性”指内在结合亲和性，其反映了结合对成员(例如，RPP和抗原或表位)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和性可以用解离平衡常数(K_D)表示。在下面更详细地描述了有助于解离平衡常数的动力学组分。可以通过本领域公知的通常方法测量亲和性，包括本文所述的哪些。可以例如使用表面等离子体共振(SPR)技术(例如，)或生物层干涉法(例如，)确定亲和性。

对于RPP与靶分子的结合，术语“结合”、“特异性结合”、“特异性结合至”、“特异性针对”、“选择性结合”和“选择性针对”特定抗原(例如，多肽靶点)或特定抗原上的表位指与非特异性或非选择性相互作用(例如，与非靶分子)显著不同的结合。例如，可以通过测量与靶分子的结合并将其与同非靶分子的结合进行比较来测量特异性结合。特异性结合也可以通过与模拟靶分子上识别的表位的对照分子的竞争来确定。在这种情况下，如果与靶分子的结合被对照分子竞争性抑制，则表明特异性结合。

如本文所用，术语“k_d”(秒^-1)指特定ABP-抗原相互作用的解离速率常数。该值也称为K_off值。

如本文所用，术语“k_a”(M^-1×秒^-1)指特定ABP-抗原相互作用的结合速率常数。该值也称为K_on值。

如本文所用，术语“K_D”(M)指特定ABP-抗原相互作用的解离平衡常数。K_D＝k_d/k_a。

如本文所用，术语“K_A”(M^-1)指特定ABP-抗原相互作用的结合平衡常数。K_A＝k_a/k_d。

“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子缀合的RPP。

“效应功能”指由抗体Fc区介导的生物学活性，其活性可以因抗体同种型而异。抗体效应功能的实例包括激活补体依赖性细胞毒性(CDC)的C1q结合、激活抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的Fc受体结合。

当本文在两个或多个RPP的背景下使用时，术语“与……竞争”或“与……交叉竞争”表示两个或更多个RPP竞争结合抗原(例如，肺炎链球菌多糖)。在一个示例性测定时，将肺炎链球菌多糖涂覆在表面上并与第一肺炎链球菌多糖RPP接触，然后加入第二肺炎链球菌多糖RPP。在另一个示例性测定中，将第一肺炎链球菌多糖RPP涂覆在表面上并与肺炎链球菌多糖接触，然后加入第二肺炎链球菌多糖RPP。如果第一肺炎链球菌多糖RPP的存在降低了第二肺炎链球菌多糖RPP的结合，则在任一测定中RPP竞争。术语“与……竞争”还包括RPP的组合，其中一个RPP减少了另一个RPP的结合，但是当RPP以相反顺序添加时没有观察到竞争。然而，在一些实施方式中，第一和第二RPP抑制彼此的结合，无论添加顺序如何。在一些实施方式中，一种RPP将另一种RPP与其抗原的结合降低至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。技术人员可以基于RPP对肺炎链球菌多糖的亲和性和RPP的价数选择用于竞争测定的抗体浓度。在该定义中描述的测定是说明性的，技术人员可以利用任何适宜的测定来确定抗体是否相互竞争。例如在Cox等，“Immunoassay Methods,”Assay Guidance Manual[网络]，2014年12月24日更新(www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/；2015年9月29日访问)；Silman等，Cytometry,2001,44:30-37；和Finco等，J.Pharm.Biomed.Anal.,2011,54:351-358中描述了适宜的测定；其每一个的全部内容通过引用并入。

术语“表位”指特异性结合至RPP的抗原的一部分。表位通常由表面可接近的氨基酸残基和/或糖侧链组成，并且可具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下可能会失去与前者的结合，而不是后者。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基，以及不直接参与结合的其他氨基酸残基。RPP结合的表位可以使用已知的表位测定技术来确定，例如，测试RPP与肺炎链球菌多糖血清型的结合。

多肽序列和参考序列之间的“同一性”百分比，定义为在比对序列并引入缺口(如果需要)之后，多肽序列中与参考序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，以达到最大的序列同一性百分比。可以以本领域技术范围内的各种方式实现用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对，例如，使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、MEGALIGN(DNASTAR)、CLUSTALW、CLUSTAL OMEGA或MUSCLE软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。

“保守性置换”或“保守性氨基酸置换”指使用化学或功能上相似的氨基酸置换氨基酸。提供相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。例如，表2-4中提供的氨基酸组在一些实施方式中被认为是彼此的保守性置换。

其他保守性置换可以参见例如Creighton,Proteins:Structures and MolecularProperties 2nd ed.(1993)W.H.Freeman&Co.,New York,NY。通过在亲本RPP中制备一个或多个保守性氨基酸残基取代产生的RPP称为“保守性修饰的变体”。

术语“治疗(treating)”(及其变体，如“治疗(treat/treatment)”)指试图改变有需要的受试者的疾病或病症的自然过程的临床干预。治疗即可以用于预防，也可以在临床病理过程中进行。治疗的预期效果包括预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速度、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。

如本文所用，术语“治疗有效量”或“有效量”指本文提供的RPP或药物组合物的量，当施用于受试者时，可有效治疗疾病或病症。

如本文所用，术语“受试者”指哺乳动物受试者。示例性受试者包括人、猴、犬、猫、小鼠、大鼠、奶牛、马、骆驼、山羊、家兔和绵羊。在某些实施方式中，受试者是人。在一些实施方式中，受试者患有能够使用本文提供的RPP治疗的疾病或病况。在一些方面中，所述疾病或病况是癌症。在一些方面中，所述疾病或病况是病毒感染。

术语“包装说明书”用于指通常包含在治疗或诊断产品(例如，试剂盒)的商业包装中的说明书，其中包含使用此类治疗或诊断产品所关注的有关适应症、用法、剂量、给药、联合治疗、禁忌症和/或使用警告信息。

如本文所用，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。

“化学治疗剂”指用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂包括“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，其作用是调节、减少、阻断或抑制可促进癌症生长的激素的作用。

术语“细胞抑制剂”指在体外或体内阻止细胞生长的化合物或组合物。在一些实施方式中，细胞抑制剂是降低S期细胞百分比的药剂。在一些实施方式中，细胞抑制剂降低S期细胞百分比至少约20％、至少约40％、至少约60％或至少约80％。

术语“肿瘤”指所有肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌变细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中并不互相排斥。术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与某些程度的异常细胞增殖相关的病症。在一些实施方式中，细胞增殖性病症是癌症。

术语“药物组合物”指这样一种制剂，其形式使得包含在其中的活性成分的生物活性能够有效治疗受试者，并且不包含对受试者具有不可接受的毒性的附加成分。

术语“调节(modulate/modulation)”指降低或抑制，或者，激活或增加所列举的变量。

术语“增加”和“激活”指所列举的变量增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。

术语“减少”和“抑制”指所列举的变量减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。

术语“激动”指激活受体信号以诱导与受体激活相关的生物应答。“激动剂”是与受体结合并激动受体的实体。

术语“拮抗”指抑制受体信号传导以抑制与受体激活相关的生物应答。“拮抗剂”是与受体结合并拮抗受体的实体。

术语“效应T细胞”包括T辅助(即，CD4+)细胞和细胞毒性(即，CD8+)T细胞。CD4+效应T细胞有助于多种免疫过程的发展，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活。CD8+效应T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞。参见Seder和Ahmed,Nature Immunol.,2003,4:835-842，其全部内容通过引用并入，用于提供效应T细胞的更多信息。

术语“调节性T细胞”包括调节免疫耐受的细胞，例如，通过抑制效应T细胞。在一些方面中，调节性T细胞具有CD4+CD25+Foxp3+表型。在一些方面中，调节性T细胞具有CD8+CD25+表型。参见Nocentini等，Br.J.Pharmacol.,2012,165:2089-2099，其全部内容通过引用并入，用于提供调节性T细胞的更多信息。

术语“树突状细胞”指能够激活幼稚T细胞和刺激B细胞生长和分化的专业抗原呈递细胞。

术语“浆细胞”指分泌大量抗体的白细胞。其由血浆和淋巴系统运输。B细胞(例如，生发中心的幼稚B细胞或记忆B细胞)分化为浆细胞，产生模仿前体B细胞受体的抗体分子。一旦释放到血液和淋巴中，这些抗体分子就会与靶抗原(异物)结合并开始中和或破坏其。终末分化的浆细胞表达相对较少的表面抗原，不表达常见的泛B细胞标志物，如CD19和CD20。相反，浆细胞通过流式细胞术通过CD138、CD78和白细胞介素6受体的额外表达来识别。在人中，CD27是浆细胞的良好标志物，幼稚B细胞是CD27-，记忆B细胞是CD27+，浆细胞是CD27++。表面抗原CD138(多配体聚糖-1)以高水平表达。另一个重要的表面抗原是CD319(SLAMF7)。该抗原以高水平在正常人浆细胞上表达。其还在多发性骨髓瘤的恶性浆细胞上表达。与在离体条件下迅速消失的CD138相比，CD319的表达要稳定得多。

术语“浆母细胞”指外周血中分泌抗体的细胞，在抗原刺激下，其从活化的B细胞(如记忆B细胞)分化。被认为属于浆细胞谱系的最不成熟的血细胞是浆母细胞。浆母细胞分泌的抗体多于B细胞，但少于浆细胞。其迅速分裂，并且仍然能够内化抗原并将其呈递给T细胞。一个细胞可能会在这种状态下停留数天，然后要么死亡，要么不可逆转地分化为成熟的、完全分化的浆细胞。成熟B细胞向浆细胞的分化取决于转录因子Blimp-1/PRDM1和IRF4。

术语“记忆B细胞”是指初次感染后在生发中心内形成的B细胞亚型，并且对于在再次感染的情况下产生加速和更强大的抗体介导的免疫应答(也称为二次免疫应答)很重要。记忆B细胞在被其特定抗原激活之前不会分泌抗体。

术语“幼稚B细胞”指未曾暴露于抗原的B细胞。一旦暴露于抗原，幼稚B细胞要么变成记忆B细胞，要么变成浆细胞，分泌最初结合的抗原的特异性抗体。浆细胞在循环中不会持续很长时间，这与持续很长时间的记忆细胞形成对比。

术语“滴度”指对生物体产生多少识别特定表位或抗原的抗体的测量，表示为仍然给出阳性结果的最大稀释度(在连续稀释中)的倒数。酶联免疫吸附测定(ELISA)是确定抗体滴度的常见方法。

术语“外周血”指通过外周血管的血液。外周血通常通过静脉穿刺(也称为静脉切开术)或通过手指点刺获得少量。

术语“疫苗”是指刺激机体的免疫系统以将所述药剂识别为威胁、摧毁其并进一步识别和摧毁与所述药剂在未来可能遇到的任何微生物相关的任何微生物的药剂。术语疫苗可以指提供针对特定疾病的主动获得性免疫的生物制剂。疫苗通常含有一种类似于致病微生物的药剂，通常由弱化或杀死的微生物、其毒素或其表面蛋白之一制成。疫苗可以是预防性的(例如：预防或改善未来由天然或“野生”病原体感染的影响)或治疗性的(例如，正在研究针对癌症的疫苗)。更一般地，术语疫苗可以指诱导免疫应答的任何药剂。例如，癌细胞可用于针对某些癌症抗原对个体进行疫苗接种。一些疫苗含有已被化学物质、热量或辐射破坏的灭活但以前具有毒性的微生物。实例包括脊髓灰质炎疫苗、甲型肝炎疫苗、狂犬病疫苗和一些流感疫苗。一些疫苗含有活的、减毒的微生物。其中很多是活病毒，其是在禁用其毒力特性的条件下培养的，或者使用密切相关但危险性较低的生物体来产生广泛的免疫应答。尽管大多数减毒疫苗是病毒性的，但有些是细菌性的。实例包括病毒性疾病黄热病、麻疹、腮腺炎和风疹，以及细菌性疾病伤寒。由Calmette和Guérin开发的活结核分枝杆菌疫苗不是由传染性菌株制成，而是包含一种称为“BCG”的经过毒力改造的菌株，用于引发对疫苗的免疫应答。含有鼠疫耶尔森菌EV菌株的减毒活疫苗用于鼠疫免疫。减毒疫苗有一些优点也有一些缺点。其通常会引起更持久的免疫应答，是健康成年人的首选类型。但是其对于免疫功能低下的个体使用可能不安全，并且在极少数情况下会突变为有毒形式并导致疾病。类毒素疫苗由引起疾病的灭活有毒化合物而不是微生物制成。基于类毒素的疫苗的实例包括破伤风和白喉。类毒素疫苗以其功效而著称。并非所有类毒素都针对微生物；例如，西部菱背响尾蛇类毒素用于为狗免疫接种以防止响尾蛇咬伤。在蛋白亚单位疫苗中，不是将灭活或减毒微生物引入免疫系统(这将构成“全剂”疫苗)，其一个片段可以产生免疫应答。实例包括乙型肝炎病毒亚单位疫苗，其仅由病毒的表面蛋白组成(以前从慢性感染患者的血清中提取，但现在通过将病毒基因重组到酵母中来产生)或作为食用藻类疫苗，针对人乳头瘤病毒(HPV)的病毒样颗粒(VLP)疫苗由病毒主要衣壳蛋白、流感病毒的血凝素和神经氨酸酶亚基组成。对于缀合物疫苗，某些细菌具有免疫原性较差的多糖外壳。通过将这些外壳与蛋白(例如，毒素)连接起来，可以引导免疫系统将多糖识别为蛋白抗原。这种方法用于乙型流感嗜血杆菌疫苗。树突状细胞疫苗将树突状细胞与抗原结合，将抗原呈递给人体的白细胞，从而刺激免疫应答。这些疫苗在治疗脑肿瘤方面显示出一些积极的初步结果，并且还在恶性黑色素瘤中进行了检测。对于重组载体疫苗，通过将一种微生物的生理学与另一种微生物的DNA结合起来，可以针对具有复杂感染过程的疾病产生免疫力。一个实例是Merck的RVSV-ZEBOV疫苗获得许可，该疫苗于2018年用于在刚果抗击埃博拉病毒。另一种疫苗接种的实验方法称为DNA疫苗接种，其是由传染源的DNA建立的，正在研发中。提出的机制是将病毒或细菌DNA插入(和表达，通过使用电穿孔增强，触发免疫系统识别)到人或动物细胞中。识别表达的蛋白的免疫系统的某些细胞将对这些蛋白和表达其的细胞发起攻击。因为这些细胞的存活时间很长，如果以后遇到正常表达这些蛋白的病原体，其就会立即受到免疫系统的攻击。DNA疫苗的一个潜在优势是其非常易于生产和储存。疫苗可以是单价(也称为单价的)或多价的(也称为多价的)。单价疫苗旨在针对单一抗原或单一微生物进行免疫。多价或多价的疫苗旨在针对同一微生物的两种或多种菌株进行免疫，或者针对两种或多种微生物进行免疫。多价疫苗的价数可以用希腊语或拉丁语前缀表示(例如，四价(tetravalent/quadrivalent))。在某些情况下，单价疫苗可能更适合快速产生强烈的免疫应答。

术语“超免疫”指类似于静脉内免疫球蛋白(IVIg)的多克隆抗体制剂，不同之处在于其是从供体的血浆中制备的，具有针对特定生物体或抗原的高滴度抗体。术语超免疫通常与术语“超免疫丙种球蛋白”和“超免疫球蛋白”互换使用。可以使用超免疫球蛋白的一些药物包括乙型肝炎、狂犬病、破伤风毒素、水痘-带状疱疹等。超免疫球蛋白的施用为患者提供针对药剂的“被动”免疫。这与提供“主动”免疫的疫苗形成对比。然而，疫苗需要更长的时间才能达到这一目的，而超免疫球蛋白可提供即时的“被动”短期免疫。

术语“体内”翻译为“在活体中”，是指在整个生物体或细胞(通常是动物，包括人和植物)上测试各种生物实体的影响的科学研究，而不是组织提取物或死有机体。这不应与体外(“在玻璃中”)实验相混淆，即在实验室环境中使用试管、培养皿等。体内研究的实例包括：通过比较细菌感染的影响与纯化细菌毒素的影响来研究疾病的发病机制；非抗生素、抗病毒药物和新药的总体开发；和新的外科手术。因此，动物试验和临床试验是体内研究的主要组成部分。体内检测通常用于体外，因为其更适合观察实验对活体受试者的整体效果。

术语“活性”是指针对抗原、疫苗、蛋白、表位、细胞、细菌或病毒的RPP或抗体的定量测量。可以使用体内或体外方法评估活性。

术语“重组”是指由活细胞内重组DNA表达产生的蛋白。重组DNA是由至少两个独立的DNA区段组合而成DNA片段的总称。

术语“体外”翻译为“在玻璃中”，是指在正常生物环境之外对微生物、细胞或生物分子进行的科学研究。通俗地称为“试管实验”，这些生物学及其子学科的研究传统上是在实验室器具中完成的，如试管、烧瓶、培养皿和微量滴定板。使用与通常生物环境分离的生物体成分进行的研究比对整个生物体进行的分析更详细或更方便；然而，从体外实验中获得的结果可能无法完全或准确地预测对整个生物体的影响。与体外实验相反，体内研究是在动物(包括人)和整个植物中进行的研究。

术语“中和”是指特定抗体阻断病毒上用于进入其靶细胞的位点的能力。如果抗体对这种抗原缺乏特异性，即使抗体产生大量过量，中和抗体的作用也可以忽略不计。可以学习特定抗体的产生，以便在下次展示时做出更快的应答。同源感染因子的减少或破坏可以是部分的或完全的，并且可以使其不再对其他细胞具有感染性或致病性。

多肽(例如，抗体)的“变体”包含氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸残基相对于天然多肽序列插入、缺失和/或置换到氨基酸序列中，并且基本上保留与天然多肽相同的生物活性。可以使用本领域的标准技术测量多肽的生物活性(例如，如果变体是抗体，则其活性可以通过结合测定来检测，如本文所述的)。本公开内容的变体包括片段、类似物、重组多肽、合成多肽和/或融合蛋白。

多肽的“衍生物”是已被化学修饰的多肽(例如，抗体)，例如，通过缀合至另一化学部分，比如，例如，聚乙二醇、白蛋白(例如，人血清白蛋白)、磷酸化和糖基化。除非另有说明，否则术语“抗体”除包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白，其实例如下所述。

如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达的水平、时间或位置)，则核苷酸序列与调控序列“可操作地连接”。“调控序列”是影响与其可操作地连接的核酸的表达(例如，表达的水平、时间或位置)的核酸。例如，调控序列可以直接对受调控的核酸发挥作用，或通过一种或多种其他分子(例如，与调控序列和/或核酸结合的多肽)起作用。调控序列的实例包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多聚腺苷酸信号)。例如，在Goeddel,1990,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,SanDiego,CA和Baron等，1995,Nucleic Acids Res.23:3605–06中描述了调控序列的其他实例。

“宿主细胞”是可用于表达核酸(例如，本公开内容的核酸)的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如，A host cell can be a prokaryote,例如，大肠杆菌，或者其可以是真核细胞，例如，单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或者杂交瘤。宿主细胞的实例包括CS-9细胞、猴肾细胞COS-7细胞系(ATCC CRL 1651)(参见Gluzman等，1981,Cell23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物，如Veggie CHO和在无血清培养基中生长的相关细胞系(参见Rasmussen等，1998,Cytotechnology28:31)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系、来源于非洲绿猴肾细胞系CV1(ATCC CCL 70)的CV1/EBNA细胞系(参见McMahan等，1991,EMBOJ.10:2821)、人胚肾细胞，如293、293 EBNA或MSR 293、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其他转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、来源于原代组织体外培养物的细胞系、原代外植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。通常，宿主细胞是可以用编码多肽的核酸转化或转染的培养细胞，然后其可以在宿主细胞中表达。

短语“重组宿主细胞”可用于表示已用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可以是包含核酸但不以所需水平表达其的细胞，除非将调控序列引入宿主细胞使其与核酸可操作地连接。应理解的是，术语宿主细胞不仅指特定的受试者细胞，而且指这种细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于例如突变或环境影响而在后续世代中发生，所以此类后代实际上可能与亲代细胞不同，但仍包括在如本文所用术语的范围内。

7.2.其他解释惯例

将此处所述的范围理解为该范围内所有值的简写，包括所列举的端点。例如，将1至50的范围理解为包括来自以下的任何数字、数字组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50。

除非另有说明，否则提及具有一个或多个立体中心的化合物是指其每种立体异构体及其立体异构体的所有组合。

7.3.RPP和RPP的文库

本文所述的RPP文库的每个成员是特异性结合抗原的多肽，例如是抗体或抗体片段。在一些实施方式中，RPP包含本文公开的重链和轻链CDR3序列的同源对。在一些实施方式中，RPP是scFv。在一些实施方式中，RPP是全长抗体。

在一些实施方式中，RPP是抗体片段。Fab片段是具有V_L、V_H、C_L和C_H1结构域的单价片段；F(ab’)₂片段是具有在铰链区通过二硫键桥连接的两个Fab片段的二价片段；Fd片段具有V_H和C_H1结构域；Fv片段具有抗体单一臂的V_L和V_H结构域；和dAb片段具有V_H结构域、V_L结构域或者V_H或V_L结构域的抗原结合片段(美国专利号6,846,634、6,696,245，美国申请公开号05/0202512、04/0202995、04/0038291、04/0009507、03/0039958，Ward等，Nature 341:544-546,1989)。

天然存在的免疫球蛋白链表现出由三个高变区(也称为互补性决定区或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)的相同一般结构。从N末端到C末端，轻链和重链两者均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸分配符合Kabat等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,US Dept.of Health and HumanServices,PHS,NIH,NIH出版物编号91-3242,1991的定义。

术语“人抗体”，也称为“全人抗体”包括具有一个或多个来源于人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的所有抗体。在一个实施方式中，全部的可变和恒定结构域来源于人免疫球蛋白序列(全人抗体)。这些抗体可以以多种方式制备，其实例如下所述，包括通过用小鼠的目的抗原免疫接种，所述小鼠经遗传修饰以表达来源于人重链和/或轻链编码基因的抗体。

人源化抗体的序列与来源于非人物种的抗体的序列不同，其通过一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加，以使得当将其施用于人受试者时，与非人物种抗体相比，人源化抗体不太可能诱导免疫应答，和/或诱导不严重的免疫应答。在一个实施方式中，在非人物种抗体的重链和/或轻链的框架和恒定结构域中的某些氨基酸被突变以产生人源化抗体。在另一个实施方式中，人抗体的一个或多个恒定结构域融合至非人物种的一个或多个可变结构域。在另一个实施方式中，当非人抗体施用于人受试者时，改变非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基以降低非人抗体可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基对于抗体与其抗原的免疫特异性结合不是关键的，或者对氨基酸序列所做的改变是保守的改变，以使得人源化抗体与抗原的结合不明显比非人抗体与抗原的结合差。如何制备人源化抗体的实例可以参见美国专利号6,054,297、5,886,152和5,877,293。

依照本说明书的教导并使用本领域众所周知的技术，本领域普通技术人员可以容易地制备抗体的片段或类似物。优选的片段或类似物的氨基和羧基末端出现在功能性结构域的边界附近。可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专有序列数据库进行比较来鉴定结构和功能结构域。计算机化的比较方法可用于鉴定存在于其他已知结构和/或功能的蛋白中的序列基序或预测的蛋白构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。参见，例如，Bowie等，1991,Science 253:164。

RPP还可以是任何合成或基因工程化蛋白。例如，抗体片段包括由轻链可变区组成的分离的片段、由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段、其中轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(scFv蛋白)。

抗体片段的另一种形式是包含抗体的一个或多个互补性决定区(CDR)的肽。CDR(也称为“最小识别单元”或“高变区”)可以共价或非共价掺入分子中，使其成为抗原结合蛋白。CDR可以通过构建编码目标CDR的多核苷酸获得。此类多核苷酸例如通过使用聚合酶链式反应以抗体产生细胞的mRNA作为模板合成可变区制备(参见，例如，Larrick等，Methods:A Companion to Methods in Enzymology2:106,1991；Courtenay Luck,“GeneticManipulation of Monoclonal Antibodies,”Monoclonal Antibodies:Production,Engineering and Clinical Application,Ritter等编著，第166页(CambridgeUniversity Press 1995)；和Ward等，“Genetic Manipulation and Expression ofAntibodies,”Monoclonal Antibodies:Principles and Applications,Birch等编著，第137页(Wiley Liss,Inc.1995))。

RPP的可变区结构域可以是任何天然存在的可变结构域或其工程化形式。工程化形式指使用重组DNA工程技术创建的可变区结构域。此类工程化形式包括例如通过在特定抗体的氨基酸序列中插入、缺失或改变而从特定抗体可变区产生的那些。具体实例包括工程化的可变区结构域，其含有来自第一抗体的至少一个CDR和任选地一个或多个框架氨基酸以及来自第二抗体的可变区结构域的其余部分。

可变区结构域可以在C末端氨基酸处共价连接至至少一个其他抗体结构域或其片段。因此，例如，在可变区结构域中存在的V_H结构域可以连接至免疫球蛋白CH1结构域或其片段。类似地，V_L结构域可以连接至CK结构域或其片段。以这种方式，例如，抗体可以是Fab片段，其中抗原结合结构域含有相关的V_H和V_L结构域，在其C末端分别与CH1和CK结构域共价连接。CH1结构域可以用更多氨基酸延伸，例如以提供在Fab’片段中发现的铰链区或铰链区结构域的一部分，或者以提供更多结构域，如抗体CH2和CH3结构域。

如本文所述，RPP包含本文公开的重链和轻链CDR3序列的同源对。例如，可以将CDR引入已知抗体框架区(IgG1、IgG2等)，或缀合至适宜载剂以增强其半衰期。适宜载剂包括但不限于Fc、聚乙二醇(PEG)、白蛋白、转铁蛋白等。这些和其他适宜载剂是本领域公知的。此类缀合的CDR肽可以是单体、二聚体、四聚体或其他形式。在一个实施方式中，一种或多种水溶性聚合物键合在粘合剂的一个或多个特定位置，例如氨基末端。

在某些实施方式中，在RPP中的抗体包含一个或多个水溶性聚合物连接物，包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。参见，例如，美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192和4,179,337。在某些实施方式中，衍生的结合剂包括单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其他碳水化合物基聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇的一种或多种，以及此类聚合物的混合物。在某些实施方式中，一种或多种水溶性聚合物随机附接至一条或多条侧链。在某些实施方式中，PEG能够起到提高结合剂(如抗体)的治疗能力的作用。例如，在美国专利号6,133,426中讨论了某些此类方法，出于任何目标将其通过引用并入本文。

例如，RPP可以具有天然存在的免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是四聚化分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包含主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分定义了一个主要负责效应功能的恒定区。人轻链分为κ轻链和λ轻链。重链分为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区由约12个或更多氨基酸的“J”区连接，重链还包含约10个或更多个氨基酸的“D”区。通常参见，FundamentalImmunology Ch.7(Paul,W.编著，2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))(出于所有目的其全部内容通过引用并入)。每个轻/重链对的可变区形成抗体结合位点，以使得完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。

不同的RPP可与疾病靶点的不同结构域结合或通过不同作用机制发挥作用。如本文中特别指出的，除非另有说明，否则结构域区域被指定为包括该组。例如，氨基酸4-12指9个氨基酸：在位置4和12的氨基酸，以及在该序列中的七个中间氨基酸。其他实例包括抗原结合蛋白，其抑制病原体与其靶细胞的结合，即，中和活性。抗原结合蛋白无需完全抑制与靶细胞的结合即可用于本发明。

本文描述的RPP可以包含FC区，例如，二聚体Fc多肽。在PCT申请WO 93/10151(通过引用在此并入)中描述的一种适宜Fc多肽是从人IgG1抗体Fc区的N-末端铰链区延伸至天然C-末端的单链多肽。另一种有用的Fc多肽是在美国专利5,457,035中和在Baum等，1994,EMBO J.13:3992-4001中描述的Fc突变蛋白。该突变蛋白的氨基酸序列与WO 93/10151中提供的天然Fc序列的氨基酸序列相同，除了氨基酸19已从Leu变为Ala，氨基酸20已从Leu变为Glu，以及氨基酸22已从Gly变为Ala以外。突变蛋白针对Fc受体显示出降低的亲和性。

可以通过常规技术产生本发明所述的RPP的抗原结合片段。此类片段的实例包括但不限于Fab和F(ab’)₂片段。还涉及通过基因工程技术产生的抗体片段和衍生物。

其他实施方式包括嵌合抗体，例如，非人(例如，小鼠)多克隆抗体的人源化形式。此类人源化抗体可以通过公知技术制备，并且在将抗体施用于人时提供降低免疫原性的优势。在一个实施方式中，人源化单克隆抗体包含小鼠抗体的可变结构域(或其抗原结合位点的全部或部分)和来源于人抗体的恒定结构域。或者，人源化抗体片段可以包含小鼠单克隆抗体的抗原结合位点和来源于人抗体的可变结构域片段(缺乏抗原结合位点)。产生嵌合和进一步工程化的单克隆抗体的程序包括在Riechmann等，1988,Nature 332:323，Liu等，1987,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 84:3439，Larrick等，1989,Bio/Technology7:934，和Winter等，1993,TIPS 14:139中描述的那些。在一个实施方式中，嵌合抗体是CDR移植抗体。在例如美国专利号5,869,619、5,225,539、5,821,337、5,859,205、6,881,557，Padlan等，1995,FASEB J.9:133-39，和Tamura等，2000,J.Immunol.164:1432-41.中讨论了用于人源化抗体的技术。

已开发了在非人动物中产生人或部分人抗体的程序。例如，制备了一种或多种内源性免疫球蛋白基因已通过各种方法失活的小鼠。已将人免疫球蛋白基因引入小鼠以替代失活的小鼠基因。动物体内产生的抗体包含由引入动物的人遗传物质编码的人免疫球蛋白多肽链。在一个实施方式中，使用疫苗免疫非人动物(如转基因小鼠)，以使得在动物中产生针对疫苗抗原的抗体。

在以下描述了产生和使用转基因动物以产生人或部分人抗体的技术的实例：美国专利5,814,318、5,569,825和5,545,806，Davis等，2003,Production of humanantibodies from transgenic mice in Lo,ed.Antibody Engineering:Methods andProtocols,Humana Press,NJ:191-200，Kellermann等，2002,Curr Opin Biotechnol.13:593-97，Russel等，2000,Infect Immun.68:1820-26，Gallo等，2000,Eur J Immun.30:534-40，Davis等，1999,Cancer Metastasis Rev.18:421-25，Green,1999,J ImmunolMethods.231:11-23，Jakobovits,1998,Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42，Green等，1998,J Exp Med.188:483-95，Jakobovits A,1998,Exp.Opin.Invest.Drugs.7:607-14，Tsuda等，1997,Genomics.42:413-21，Mendez等，1997,Nat Genet.15:146-56，Jakobovits,1994,Curr Biol.4:761-63，Arbones等，1994,Immunity.1:247-60，Green等，1994,Nat Genet.7:13-21，Jakobovits等，1993,Nature.362:255-58，Jakobovits等，1993,Proc Natl Acad Sci U S A.90:2551-55，Chen,J.,M.Trounstine,F.W.Alt,F.Young,C.Kurahara,J.Loring,D.Huszar.Inter’l Immunol.5(1993):647-656，Choi等，1993,Nature Genetics 4:117-23，Fishwild等，1996,Nature Biotech.14:845-51，Harding等，1995,Annals of the New York Academy of Sciences，Lonberg等，1994,Nature 368:856-59，Lonberg,1994,Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies inHandbook of Experimental Pharmacology 113:49-101，Lonberg等，1995,InternalReview of Immunology 13:65-93,Neuberger,1996,Nature Biotechnology 14:826，Taylor等，1992,Nucleic Acids Res.20:6287-95，Taylor等，1994,Inter’l Immunol.6:579-91，Tomizuka等，1997,Nature Genetics 16:133-43，Tomizuka等，2000,Pro.Nat’lAcad.Sci.USA 97:722-27，Tuaillon等，1993,Pro.Nat’lAcad.Sci.USA 90:3720-24，和Tuaillon等，1994,J.Immunol.152:2912-20。

本发明所述的RPP(例如，抗体、抗体片段和抗体衍生物)可以包含本领域公知的任何恒定区。轻链恒定区可以是例如κ或λ型轻链恒定区，例如，人κ或λ型轻链恒定区。重链恒定区可以是例如α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区，例如，人α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区。在一个实施方式中，轻链或重链恒定区是天然存在的恒定区的片段、衍生物、变体或突变蛋白。

用于从目标抗体衍生不同亚类或同种型抗体的技术是公知的，即亚类转换。因此，IgG抗体可以来源于IgM抗体，例如，反之亦然。此类技术能够制备具有给定抗体(亲本抗体)的抗原结合性质的新抗体，但也表现出与同亲本抗体不同的抗体同种型或亚类相关的生物学性质。编码特定抗体多肽的克隆DNA可用于此类程序，例如，编码所需同种型抗体恒定结构域的DNA。亦然参见Lantto等，2002,Methods Mol.Biol.178:303-16。

单链抗体(scFv)可以通过经由氨基酸桥(短肽接头，例如，氨基酸残基的合成序列)连接重链和轻链可变结构域(Fv区)片段来形成，从而产生单一多肽链。此类单链Fv(scFv)已通过在编码两种可变结构域多肽(V_L和V_H)的DNA之间融合编码肽接头的DNA来制备。所得多肽能够自身折叠形成抗原结合单体，或者其能够形成多聚体(例如，二聚体、三聚体或四聚体)，这取决于两个可变结构域之间的柔性接头的长度(Kortt等，1997,Prot.Eng.10:423；Kortt等，2001,Biomol.Eng.18:95-108,Bird等，1988,Science 242:423-26和Huston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-83)。通过将不同的包含V_L和V_H的多肽组合，可以形成结合不同表位的多聚化scFv(Kriangkum等，2001,Biomol.Eng.18:31-40)。为了产生单链抗体而开发的技术包括在美国专利号4,946,778；Bird,1988,Science242:423；Huston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879；Ward等，1989,Nature 334:544，de Graaf等，2002,Methods Mol Biol.178:379-87中描述的那些。

在某些方面中，本发明包括从抗体编码表达载体文库产生的RPP。RPP包含10、100、1,000、10,000或多于100,000个不同的抗体序列。在某些方面中，RPP是从哺乳动物细胞中产生的，所述细胞具有由单个浆细胞或浆母细胞编码的抗体序列重组工程。在某些方面中，RPP是多价的，因为其包含具有不同抗原结合性质的抗体。在一些实施方式中，RPP结合至靶抗原上的多个表位。在一些实施方式中，RPP结合至多个抗原。

7.4.RPP的CDR3序列

序列表中提供了包含使用本文所述方法产生的十二个RPP的每个成员的CDR3H(重链免疫球蛋白)和CDR3L(轻链免疫球蛋白)多肽序列。在表5中提供了序列总结。这些序列可在随本申请提交的序列表中找到。本文提供的使用人胸腺细胞或人T细胞作为免疫原的RPP从表达完全人V(D)J抗体序列的人源化小鼠产生。使用肺炎链球菌多糖、甲型流感病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原或乙型流感嗜血杆菌多糖的本文提供的RPP从接种的人供体产生。RPP包含1,141个至10,537个之间的独特抗体。

表5：CDR3重链和CDR3轻链序列

如果其具有的氨基酸序列与本文提供的至少一个CDR具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，则寡肽或多肽在本发明的范围内。

7.5.核酸

在一个方面中，本发明提供了分离的核酸分子。所述核酸包括，例如，编码全部或部分RPP的多核苷酸，例如，本公开内容的抗体的一条或两条链，或其片段、衍生物、突变蛋白或变体，足以用作杂交探针、PCR引物或测序引物以鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的多核苷酸，用于抑制多核苷酸表达的反义核酸，以及上述的互补序列。核酸可以是任何长度。例如，其长度可以是5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000个或更多个核苷酸，和/或可以包含一个或多个另外的序列，例如，调控序列，和/或是更大核酸(例如，载体)的一部分。核酸可以是单链的或双链的，且可以包含RNA和/或DNA核苷酸，及其人工变体(例如，肽核酸)。

编码抗体多肽(例如，重链或轻链、仅可变结构域、仅CDR或全长)的核酸可从已用疫苗免疫小鼠的B细胞中分离。核酸可通过常规程序如聚合酶链式反应(PCR)分离。

本文显示了来自重链和轻链可变区的可变区的CDR3的多肽序列。本领域技术人员将意识到的是，由于遗传密码的简并性，因而本文公开的每个多肽序列由大量其他核酸序列编码。本发明提供了编码本发明的每个RPP的每个简并核苷酸序列。

用于杂交核酸的方法是本领域熟知的。参见，例如，Curr.Prot.inMol.Biol.,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。如本文所定义的，中等严格杂交条件使用含有5X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)的预洗涤溶液、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)、约50％甲酰胺的杂交缓冲液、6X SSC和55℃的杂交温度(或其他类似溶液，如含有约50％甲酰胺的溶液，杂交温度42℃)以及60℃在0.5X SSC、0.1％SDS中的洗涤条件。严格杂交条件在6X SSC中于45℃下杂交，然后在0.1X SSC、0.2％SDS中于68℃下洗涤一次或多次。此外，本领域技术人员可以操纵杂交和/或洗涤条件以增加或降低杂交的严格性，使得包含彼此至少65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％相同的核苷酸序列的核酸通常保持彼此杂交。影响杂交条件选择的基本参数和设计适宜条件的指导原则如下所示，例如，Sambrook,Fritsch和Maniatis(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.，第9章和第11章；以及Curr.Prot.in Mol.Biol.1995,Ausubel等编著，John Wiley&Sons,Inc.,第2.10和6.3-6.4节)，并且可以由本领域普通技术人员基于例如DNA的长度和/或碱基组成容易地确定。

可以通过突变将改变引入核酸，从而导致其编码的多肽(例如，RPP)的氨基酸序列发生改变。可以使用本领域公知的任何技术引入突变。在一个实施方式中，使用例如位点定向诱变方案改变一个或多个特定氨基酸残基。在另一个实施方式中，使用例如随机诱变方案改变一个或多个随机选择的残基。无论其是如何制备的，都可以表达和筛选突变多肽的所需性质(例如，结合至病毒)。

在另一个方面中，本发明提供了适合用作用于检测本发明所述的核酸序列的引物或杂交探针的核酸分子。本发明所述的核酸分子可以尽包含编码本发明所述的全长多肽的核酸序列的一部分，例如，可用作探针或引物的片段或编码本发明多肽的活性部分(例如，病毒结合部分)的片段。

基于本发明所述的核酸序列的探针可用于检测核酸或类似核酸，例如，编码本发明所述的多肽的转录物。探针可以包含标记基团，例如，放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。可以将此类探针用于鉴定表达多肽的细胞。

在另一个方面中，本发明提供了编码抗体蛋白文库的核酸文库，其来源于浆母细胞和浆细胞。这些核酸文库是通过将浆母细胞和浆细胞分离到单细胞反应容器中而产生的，在单细胞反应容器中，其被裂解并且抗体特异性核酸被纯化或捕获，例如在固体支持物如珠子上。本发明提供了并行捕获数百万个单细胞转录物的方法。转录物的捕获之后是编码重链和轻链免疫球蛋白的核酸的扩增，并且随后将所述核酸连接到编码重链和轻链免疫球蛋白的融合构建体的文库中。在这样的文库中，重链和轻链免疫球蛋白的天然配对得以保持，如最初在输入的浆母细胞和浆细胞中发现的那样。此类方法在数百万个单细胞上并行进行，使得所得的融合重链和轻链免疫球蛋白核酸文库包含数百万个单细胞的天然配对序列。此类方法在别处描述(Adler等，Mabs 9,1282-1996,2017)。

7.6.载体和表达载体

本发明提供了包含编码本发明所述的多肽或其部分的核酸的载体。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体、非游离基因哺乳动物载体和表达载体，例如，重组表达载体。

在本发明的另一个方面中，还提供了包含本发明所述的核酸分子和多核苷酸的表达载体和使用此类载体转化的宿主细胞，以及还提供了产生多肽的方法。术语“表达载体”指用于从多核苷酸序列表达多肽的质粒、噬菌体、病毒或载体。用于表达多肽的载体包含载体增殖和克隆插入片段表达所需的最少序列。表达载体包含转录单元，其包含以下组件：(1)在基因表达中具有调控作用的一个或多个遗传元件，例如，启动子或增强子，(2)编码多肽和蛋白的序列，可转录成mRNA并翻译成蛋白，和(3)适合的转录起始和终止序列。这些序列可以进一步包含选择性标记物。适合在宿主细胞中表达的载体很容易获得，并且使用标准重组DNA技术将核酸分子插入到载体中。此类载体可以包括在特定组织中起作用的启动子，以及用于在目标人或动物细胞中表达多肽的病毒载体。

本发明所述的重组表达载体可以包含适于在宿主细胞中表达核酸形式的本发明所述的核酸。重组表达载体包含一个或多个基于待用于表达的宿主细胞选择的调控序列，其与待表达的核酸序列可操作地连接。调控序列包括在很多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的那些序列(例如，SV40早期基因增强子、劳斯肉瘤病毒启动子和巨细胞病毒启动子)、指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异性调控序列，参见Voss等，1986,Trends Biochem.Sci.11:287，Maniatis等，1987,Science 236:1237，其全部内容通过引用并入本文)以及指导核苷酸序列响应特定治疗或病况的可诱导表达的那些序列(例如，在哺乳动物细胞中的金属硫蛋白启动子以及原核和真核系统中的tet响应性和/或链霉素响应性启动子(参见同上))。本领域技术人员将意识到的是，表达载体的设计可以取决于诸如待转化宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等因素。可以将本发明所述的表达载体引入宿主细胞中，从而产生由如本文所述的核酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。

本发明还提供了制备多肽(例如，RPP)的方法。可以利用多种其他表达/宿主系统。可以通过常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核系统。这些系统包括但不限于微生物，如使用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌)；使用酵母表达载体转化的酵母；使用病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；使用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染的或使用细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或者动物细胞系统。在重组蛋白产生中使用的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系或其衍生物，如Veggie CHO和在无血清培养基中生长的相关细胞系(参见Rasmussen等，1998,Cytotechnology28:31)或CHO细胞株DX-B11，其在DHFR中存在缺陷(参见Urlaub等，1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-20)、COS细胞，如猴肾细胞COS细胞系(ATCC CRL 1651)(参见Gluzman等，1981,Cell23:175)、W138、BHK、HepG2、3T3(ATCC CCL 163)、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、L细胞、C127细胞、BHK(ATCC CRL10)细胞系、来源于非洲绿猴肾细胞系CV1(ATCC CCL 70)的CV1/EBNA细胞系(参见McMahan等，1991,EMBO J.10:2821)、人胚肾细胞，如293、293EBNA或MSR 293、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其他转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、来源于原代组织体外培养物的细胞株、原代外植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。哺乳动物表达允许产生可以从生长培养基中回收的分泌或可溶性多肽。

对于哺乳动物细胞的稳定转染，众所周知，根据所使用的表达载体和转染技术，只有一小部分细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，通常将编码选择性标记物(例如，针对抗生素抗性)的基因与目标基因一起引入宿主细胞。例如，一旦用包含选择性标记物以及所需表达盒的载体转化此类细胞，就可以让细胞在富集培养基中生长，然后再将其转换为选择性培养基。将选择性标记物设计为允许成功表达引入序列的细胞生长和回收。可以使用适合于所用细胞系的组织培养技术来增殖稳定转化细胞的抗性团块(clump)。重组蛋白表达的综述参见Methods of Enzymology,v.185,Goeddell,D.V.,ed.,Academic Press(1990)。优选的选择性标记物包括赋予药物抗性的哪些，如G418、潮霉素和甲氨蝶呤。用引入的核酸稳定转染的细胞可以通过药物选择(例如，掺入选择性标记物基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)等方法进行鉴定。

可以在促进多糖表达的条件下培养转化细胞，并通过常规蛋白纯化程序回收多肽(如上文所定义)。

在一些情况下，如在使用原核系统的表达中，本发明所述的表达多肽可能需要“重折叠”并氧化成适当的三级结构和生成的二硫键以具有生物活性。可以使用本领域众所周知的多种程序实现重折叠。此类方法包括例如在离液剂存在下将溶解的多肽暴露于通常高于7的pH。离液剂的选择类似于用于包含体溶解的选择；然而，离液体通常以较低的浓度使用。示例性离液剂是胍和尿素。在大多数情况下，重折叠/氧化溶液还将包含特定比例的还原剂及其氧化形式，以产生特定的氧化还原电位，允许发生二硫化物重排以形成半胱氨酸桥。一些常用的氧化还原对包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽/二硫代双GSH、氯化铜、二硫苏糖醇DTT/二噻烷DTT和2-巯基乙醇(bME)/二硫代-bME。在很多情况下，可以使用共溶剂来提高重折叠的效率。常用的助溶剂包括甘油、各种分子量的聚乙二醇和精氨酸。

此外，多肽可以根据常规技术在溶液中或在固体支持物上合成。各种自动合成器是可商购的并且可以根据已知方案使用。参见，例如，Stewart和Young,Solid PhasePeptide Synthesis,2d.Ed.,Pierce Chemical Co.(1984)；Tam等，J Am Chem Soc,105:6442,(1983)；Merrifield,Science 232:341-347(1986)；Barany和Merrifield,ThePeptides,Gross and Meienhofer,eds,Academic Press,New York,1-284；Barany等，IntJ Pep Protein Res,30:705-739(1987)。

本发明所述的多肽和蛋白可以根据本领域技术人员公知的蛋白纯化技术进行纯化。这些技术在一个层面上涉及蛋白和非蛋白级分的粗分馏。将肽多肽与其他蛋白分离后，可以使用色谱和电泳技术进一步纯化目标肽或多肽以实现部分或完全纯化(或纯化至均质)。如本文所用，术语“纯化的多肽”旨在指一种组合物，其与其他组分分离，其中多肽相对于其天然可获得的状态被纯化至任何程度。因此，纯化的多肽也指脱离其可能天然存在的环境的多肽。通常，“纯化的”将指经过分级分离以去除各种其他组分的多肽组合物，并且所述组合物基本上保留了其表达的生物活性。当使用术语“基本上纯化的”时，该名称将指肽或多肽组合物，其中多肽或肽构成组合物的主要组分，如构成约50％、约60％、约70％、约80％、约85％或约90％或更多在组合物中的蛋白。

适用于纯化的各种技术是本领域技术人员熟知的。这些包括，例如，用硫酸铵、PEG、抗体(免疫沉淀)等沉淀，或通过热变性，随后通过离心；层析，如亲和层析(蛋白A柱)、离子交换、凝胶过滤、反相、羟基磷灰石、疏水性相互作用色谱、等电聚焦、凝胶电泳以及这些技术的组合。如本领域通常知晓的，相信可以改变进行各种纯化步骤的顺序，或者可以省略某些步骤，并且仍然产生用于制备基本上纯化的多肽的适宜方法。在下述实施例中提供了示例性纯化步骤。

根据本公开内容，本领域技术人员将知晓用于量化多肽纯化程度的各种方法。这些包括，例如，确定活性级分的特异性结合活性，或通过SDS/PAGE分析评估级分内肽或多肽的量。评估多肽级分纯度的优选方法是计算级分的结合活性，将其与初始提取物的结合活性进行比较，从而计算纯化程度，此处通过“-纯化倍数”评估。当然，用于表示结合活性量的实际单位将取决于为进行纯化而选择的特定测定技术以及多肽或肽是否表现出可检测的结合活性。

在一些方面中，本发明包括用于定点整合到哺乳动物基因组中的抗体编码核酸载体文库。此类载体包括质粒、逆转录病毒和慢病毒。这些载体文库编码抗体序列文库，然后将其用于工程化哺乳动物细胞以产生RPP。核酸载体文库可以包含10、100、1,000、10,000或超过100,000个不同的抗体编码序列。所述序列来源于浆母细胞和浆细胞。这些核酸文库是通过将浆母细胞和浆细胞分离到单细胞反应容器中而产生的，在单细胞反应容器中，其被裂解并且抗体特异性核酸被纯化或捕获，例如在固体支持物如珠子上。本发明提供了并行捕获数百万个单细胞转录物的方法。转录物的捕获之后是编码重链和轻链免疫球蛋白的核酸的扩增，并且随后将所述核酸连接到编码重链和轻链免疫球蛋白的融合构建体的文库中。在这样的文库中，重链和轻链免疫球蛋白的天然配对得以保持，如最初在输入的浆母细胞和浆细胞中发现的那样。此类方法在数百万个单细胞上并行进行，使得所得的融合重链和轻链免疫球蛋白核酸文库包含数百万个单细胞的天然配对序列。然后，使用Gibson组装、限制性核酸内切酶或其他重组DNA技术将这些配对的融合扩增子工程化成全长抗体构建体。

在整个文库上进行全长抗体构建体的工程化，以使得在整个过程中基本上保持文库的抗体序列含量和抗体序列计数。在一些方面中，表达载体文库分两步工程化，将scFv扩增子亚克隆到中间载体中，然后使用第二轮Gibson组装、限制性消化或其他重组技术将抗体的其他结构域工程化到scFv的接头(USPTO 14/734,953)。重链和轻链免疫球蛋白的天然配对在整个工程化为全长表达载体文库的过程中基本上保持不变。载体设计方向多样，例如，两个独立的启动子驱动重链和轻链免疫球蛋白的表达，或者一个启动子驱动重链和轻链免疫球蛋白的表达，并将翻译跳跃基序用于将重链和轻链免疫球蛋白分别翻译成单独的多肽。在一些实施方式中，表达载体包含用于定点整合到哺乳动物生产细胞中的序列，例如，CRISPR-Cas9、Flp-In、Cre/Lox或锌指重组方法。定点整合可确保每个哺乳动物生产细胞编码单个抗体序列，并降低单个生产细胞之间表达水平的变异性。

7.7.产生RPP(例如，抗体)的方法

RPP可以从已被编码抗体的基因转染的宿主细胞中纯化，方法是使用肝素HP柱，使用盐梯度洗脱宿主细胞培养液的过滤上清液。

可以通过本领域普通技术人员熟知的任何数量的技术产生全人单克隆抗体。此类方法包括但不限于人外周血细胞(例如，含有B淋巴细胞)的爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)转化、人B细胞的体外免疫、来自携带插入的人免疫球蛋白基因的免疫转基因小鼠的脾细胞融合、从人免疫球蛋白V区噬菌体文库中分离或如本领域公知的和基于本公开内容的其他程序。例如，全人单克隆抗体可以从转基因小鼠中获得，这些小鼠经过工程改造以产生对抗原挑战产生应答的特定人抗体。在以下中描述了用于从转基因小鼠获得全人抗体的方法，例如，Green等，Nature Genet.7:13,1994；Lonberg等，Nature 368:856,1994；Taylor等，Int.Immun.6:579,1994；美国专利号5,877,397；Bruggemann等，1997Curr.Opin.Biotechnol.8:455 58；Jakobovits等，1995Ann.N.Y.Acad.Sci.764:52535。在这项技术中，将人重链和轻链基因座的元件引入来源于胚胎干细胞系的小鼠品系中，其含有内源性重链和轻链基因座的靶向破坏(亦参见Bruggemann等，Curr.Opin.Biotechnol.8:455 58(1997))。例如，人免疫球蛋白转基因可以是微型基因构建体，或酵母人工染色体上的易位点，其在小鼠淋巴组织中经历B细胞特异性DNA重排和超突变。通过对转基因小鼠进行免疫接种，可以获得全人单克隆抗体，进而产生对抗原靶点或靶点特异的人抗体。根据本文所述的方法，经免疫的转基因小鼠的淋巴样细胞可用于产生分泌人抗体的杂交瘤。

用于产生本公开内容的人抗体的另一种方法包括通过EBV转化永生化人外周血细胞。参见，例如，美国专利号4,464,456。这种产生与RPP特异性结合的单克隆抗体的永生化B细胞系(或类淋巴母细胞系)可以通过如本文提供的免疫检测方法例如ELISA来鉴定，然后通过标准克隆技术分离。根据本领域公知的方法，通过将转化细胞系与小鼠骨髓瘤融合以产生小鼠人杂交细胞系，可以提高产生RPP的类淋巴母细胞系的稳定性(参见，例如，Glasky等，Hybridoma 8:37789(1989))。产生人单克隆抗体的又一种方法是体外免疫，其包括使用人RPP引发人脾脏B细胞。然后将引发的B细胞与异源杂交融合配偶体融合。参见，例如，Boerner等，1991J.Immunol.147:86 95。

在某些实施方式中，选择产生RPP的B细胞，并根据本领域公知(WO 92/02551；美国专利5,627,052；Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7843 48(1996))和本文所述的分子生物学技术从B细胞中克隆轻链和重链可变区。通过选择产生与抗原靶点特异性结合的抗体的细胞，可以从脾脏、淋巴结或外周血样品中分离来自免疫动物的B细胞。还可以从人(例如，从外周血样品)中分离B细胞。

检测产生具有所需特异性的抗体的单个B细胞的方法是本领域公知的，例如，通过噬斑形成、荧光激活细胞分选、体外刺激然后检测特异性抗体等。选择产生特异性抗体的B细胞的方法包括，例如，在含有抗原靶点的软琼脂中制备B细胞的单细胞悬液。B细胞产生的特异性抗体与抗原的结合导致复合物形成，其可以作为免疫沉淀物可见。

在一些实施方式中，通过使用允许鉴定天然配对抗体的方法来选择产生特异性抗体的B细胞。例如，可以使用在Adler等，A natively paired antibody library yieldsdrug leads with higher sensitivity and specificity than a randomly pairedantibody library,MAbs(2018)中描述的方法，其全部内容通过引用并入本文。该方法结合了微流体技术、分子基因组学、酵母单链可变片段(scFv)展示、荧光激活细胞分选(FACS)和深度测序。简言之，可以从免疫动物中分离B细胞，然后混合。将B细胞用oligo-dT珠子和裂解液包封在液滴中，从液滴中纯化出结合mRNA的珠子，然后注射到第二乳剂中，其中含有OE-RT-PCR扩增混合物，可生成编码具有天然重链和轻链Ig对的scFv的DNA扩增子。然后将天然配对的扩增子文库电穿孔到酵母中用于scFv展示。将FACS用于鉴定高亲和性scFv。最后，可以将深度抗体测序用于鉴定分选前和分选后scFv文库中的所有克隆。

在选择产生所述抗体的B细胞后，可以根据本领域公知和本文所述的方法通过分离和扩增DNA或mRNA来克隆特异性抗体基因。

获得本发明抗体的方法也可以采用本领域公知的各种噬菌体展示技术。参见，例如，Winter等，1994Annu.Rev.Immunol.12:433 55；Burton等，1994Adv.Immunol.57:191280。可以在噬菌体载体中建立人或小鼠免疫球蛋白可变区基因组合文库，可以对噬菌体载体进行筛选，以选择与RPP或其变体或片段特异性结合的Ig片段(Fab、Fv、sFv或其多聚体)。参见，例如，美国专利号5,223,409；Huse等，1989Science 246:1275 81；Sastry等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5728 32(1989)；Alting Mees等，Strategies in MolecularBiology 3:1 9(1990)；Kang等，1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4363 66；Hoogenboom等，1992J.Molec.Biol.227:381 388；Schlebusch等，1997Hybridoma 16:4752以及其中引用的参考文献。例如，包含多个编码Ig可变区片段的多核苷酸序列的文库可以与编码噬菌体衣壳蛋白的序列符合读框地插入丝状噬菌体如M13或其变体的基因组中。融合蛋白可以噬衣壳蛋白与轻链可变区结构域和/或与重链可变区结构域的融合。根据某些实施方式，还可以在噬菌体颗粒上展示免疫球蛋白Fab片段(参见，例如，美国专利号5,698,426)。

在一个实施方式中，在杂交瘤中，使用核苷酸引物扩增表达目标单克隆抗体基因的可变区。这些引物可以由本领域普通技术人员合成，或者可以从市售来源购买。(参见，例如，Stratagene(La Jolla,California)，该公司销售小鼠和人可变区引物，其中包括V_Ha、V_Hb、V_Hc、V_Hd、C_H1、V_L和C_L区的引物。)这些引物可以用于扩增重链或轻链可变区，然后可以将其分别插入载体，如ImmunoZAP^TMH或ImmunoZAP^TML(Stratagene)。然后可以将这些载体引入大肠杆菌、酵母或基于哺乳动物的表达系统。可以使用这些方法产生大量包含V_H和V_L结构域的融合蛋白的单链蛋白(参见Bird等，Science 242:423426,1988)。

一旦使用任何上述免疫和其他技术获得生产根据本发明所述的抗体的细胞，可以根据本文所述的标准程序通过从中分离和扩增DNA或mRNA来克隆特异性抗体基因。可以对由此产生的抗体进行测序并且鉴定CDR并且可以如先前描述的那样操作编码CDR的DNA以产生根据本公开内容的其他抗体。

本发明所述的RPP优选在本文所述的基于细胞的测定和/或本文所述的体内测定中具有活性和/或与本文所述的一个或多个结构域结合。因此，可以使用本文所述的测定鉴定此类结合剂。

根据本发明所述的其他抗体可以通过如本文所述和本领域公知的常规免疫和细胞融合程序获得。

抗体结合位点中心的互补性决定区(CDR)的分子进化也已用于亲和性增加的分离的抗体，例如，抗体针对c-erbB-2具有增加的亲和性，如在Schier等，1996,J.Mol.Biol.263:551中所描述的。

尽管人抗体、部分人抗体或人源化抗体适用于很多应用，特别是涉及将抗体施用于人受试者的那些应用，但其他类型的抗原结合蛋白也适用于某些应用。非人抗体可来源于任何产生抗体的动物，如小鼠、大鼠、家兔、山羊、驴或非人灵长类(如，猴(例如，食蟹猴或恒河猴)或猿(例如，黑猩猩))。本发明所述的非人抗体可以用于，例如，在体外或基于细胞培养的应用中，或其中对本发明抗体的免疫应答不发生、无关紧要、可以预防、不是问题或需要的任何其他应用。在一个实施方式中，将本发明所述的非人抗体施用于非人受试者。在另一个实施方式中，所述非人抗体不会在非人受试者中激发免疫应答。在另一个实施方式中，所述非人抗体来自与非人受试者相同的物种，例如，将本发明所述的小鼠抗体施用于小鼠。来自特定物种的抗体可以通过，例如，使用所需免疫原免疫该物种的动物或使用用于产生该物种的抗体的人工系统(例如，用于产生特定物种的抗体的基于细菌或噬菌体的展示系统)，或通过用来自其他物种的恒定区替换例如抗体的恒定区，或通过替换抗体的一个或多个氨基酸残基，将来自一个物种的抗体转化为来自另一物种的抗体，以使得其更接近于其他物种的抗体序列。在一个实施方式中，所述抗体是嵌合抗体，其包含来源于两个或更多个不同物种的抗体的氨基酸序列。

可以通过常规技术中的任何一种来制备抗原结合蛋白，并筛选所需特性。某些技术涉及分离编码目标RPP多肽链(或其部分)的核酸，并通过重组DNA技术操纵该核酸。例如，核酸可以与另一目标核酸融合，或改变(例如，通过诱变或其他常规技术)以添加、缺失或置换一个或多个氨基酸残基。此外，可以使用本领域公知的任何技术从天然表达其的细胞中纯化(例如，抗体可以从产生其的杂交瘤中纯化)或在重组表达系统中产生抗原结合蛋白。参见，例如，Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in BiologicalAnalyses,Kennet等(编著)，Plenum Press,New York(1980)；和Antibodies:ALaboratoryManual,Harlow和Land(编著)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,(1988)。

可以将本领域公知的任何表达系统用于制备本公开内容的重组多肽。表达载体已在上文中全面详述。在通常情况下，使用包含编码所需多肽的DNA的重组表达载体转化宿主细胞。可以使用的宿主细胞包括原核细胞、酵母或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括昆虫细胞和哺乳动物来源的已建立细胞系。适宜哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾细胞的COS-7细胞系(ATCC CRL1651)(Gluzman等，1981,Cell 23:175)、L细胞、293细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL163)中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系和来源于非洲绿猴肾细胞系CVI的CVI/EBNA细胞系(ATCC CCL 70)，如McMahan等，1991,EMBO J.10:2821所描述的。Pouwels等(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,New York,1985)描述了用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适宜克隆和表达载体。

单克隆抗体(mAb)的生产细胞系通常是通过将表达构建体随机插入哺乳动物生产细胞基因组(例如CHO基因组)中产生的(Rita Costa等，2010)。然而，这种经典方法产生的细胞系具有插入到CHO基因组中的多个mAb拷贝。如果我们将我们的多克隆抗体构建文库随机插入到CHO基因组中，许多克隆会表达多种抗体，这将导致重链和轻链Ig之间频繁出现非天然配对。此外，不同的基因组位置具有不同的转录活性水平(Kito等，2002)，这可导致异质、不一致和/或不稳定的生物产生。因此，在一些方面中，本发明提供一种CHO细胞系，其具有稳定地工程化到基因组中的Flp重组酶识别靶(FRT)着陆垫。然后将这种定点基因组整合细胞系用于稳定表达RPP。

将意识到的是，本发明所述的抗体可以具有至少一个氨基酸置换，条件是该抗体保留结合特异性。因此，对抗体结构的修饰包括在本发明的范围内。这些可以包括氨基酸置换，其可以是保守的或非保守的，不会破坏抗体的RPP结合能力。保守氨基酸置换可包括非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而非通过生物系统中的合成来掺入。这些包括肽模拟物和其他反向或倒转形式的氨基酸部分。保守氨基酸置换还可以涉及用标准残基置换天然氨基酸残基，使得对该位置氨基酸残基的极性或电荷几乎没有影响或没有影响。

非保守性置换可能涉及将一类氨基酸或氨基酸模拟物的成员交换为具有不同物理性质(例如，尺寸、极性、疏水性、电荷)的另一类成员。可以将此类置换的残基引入人抗体与非人抗体同源的区域，或引入分子的非同源区域。

此外，本领域技术人员可以产生在每个所需氨基酸残基处含有单个氨基酸置换的测试变体。然后，可以使用本领域技术人员公知的活性测定筛选变体。此类变体可用于收集有关适宜变体的信息。例如，如果发现对特定氨基酸残基的改变导致活性破坏、活性不合需要的降低或不适宜的活性，则可以避免具有这种改变的变体。换言之，基于从此类常规实验收集的信息，本领域技术人员能够容易地确定应避免的单独或与其他突变组合的进一步置换的氨基酸。

本领域技术人员将能够使用众所周知的技术来确定本文所述多肽的适宜变体。在某些实施方式中，本领域技术人员可以通过靶向被认为对活性不重要的区域来鉴定可以在不破坏活性的情况下改变的分子的合适区域。在某些实施方式中，能够识别在相似多肽中保守的分子残基和部分。在某些实施方式中，甚至对生物活性或结构可能重要的区域也可以进行保守的氨基酸置换而不破坏生物活性或对多肽结构没有不利影响。

此外，本领域技术人员可以回顾结构-功能研究，以鉴定相似多肽中对活性或结构很重要的残基。鉴于这种比较，人们可以预测蛋白中氨基酸残基的重要性，该氨基酸残基对应于对相似蛋白中的活性或结构很重要的氨基酸残基。本领域技术人员可以选择化学上相似的氨基酸置换来替代这种预测的重要氨基酸残基。

本领域技术人员还可以分析类似多肽中与该结构相关的三维结构和氨基酸序列。鉴于这些信息，本领域技术人员可以针对其三维结构预测抗体的氨基酸残基的比对。在某些实施方式中，本领域技术人员可以选择不对预测在蛋白表面上的氨基酸残基进行彻底改变，因为这些残基可能涉及与其他分子的重要相互作用。

许多科学出版物都致力于预测二级结构。参见Moult J.,Curr.Op.in Biotech.,7(4):422-427(1996),Chou等，Biochem.,13(2):222-245(1974)；Chou等，Biochem.,113(2):211-222(1974)；Chou等，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.,47:45-148(1978)；Chou等，Ann.Rev.Biochem.,47:251-276和Chou等，Biophys.J.,26:367-384(1979)。此外，目前可以使用计算机程序来帮助预测二级结构。预测二级结构的一种方法是基于同源性建模。例如，序列同一性大于30％，或相似性大于40％的两种多肽或蛋白质往往具有相似的结构拓扑。蛋白结构数据库(PDB)最近的发展增强了二级结构的可预测性，包括多肽或蛋白质结构内的潜在折叠数。参见Holm等，Nucl.Acid.Res.,27(1):244-247(1999)。有人建议(Brenner等，Curr.Op.Struct.Biol.,7(3):369-376(1997))给定的多肽或蛋白的折叠数量有限，一旦确定了关键数量的结构，结构预测将变得更加准确。

预测二级结构的其他方法包括“穿线”(Jones,D.,Curr.Opin.Struct.Biol.,7(3):377-87(1997)；Sippl等，Structure,4(1):15-19(1996))、“性质分析”(Bowie等，Science,253:164-170(1991)；Gribskov等，Meth.Enzym.,183:146-159(1990)；Gribskov等，Proc.Nat.Acad.Sci.,84(13):4355-4358(1987))，和“进化连接”(参见Holm，同上(1999)，和Brenner，同上(1997))。

在某些实施方式中，所述抗体的变体包括糖基化变体，其中糖基化位点的数量和/或类型与亲本多肽的氨基酸序列相比已经改变。在某些实施方式中，变体包含与天然蛋白相比更多或更少数量的N连接糖基化位点。N连接糖基化位点可以通过以下序列表征：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸残基。氨基酸残基的置换以产生该序列为添加N-连接的碳水化合物链提供了潜在的新位点。或者，消除该序列的置换将去除现有N连接的碳水化合物链。还提供了一种N-连接的碳水化合物链的重排，其中一个或多个N-连接的糖基化位点(通常是天然存在的)被消除并产生一个或多个新的N-连接的位点。其他优选的抗体变体包括半胱氨酸变体，其中与亲本氨基酸序列相比，一个或多个半胱氨酸残基从另一氨基酸(例如，丝氨酸)中缺失或置换。当抗体必须重新折叠成生物活性构象时，例如在分离不溶性包涵体之后，半胱氨酸变体可能很有用。半胱氨酸变体通常具有比天然蛋白质更少的半胱氨酸残基，并且通常具有偶数以最小化由未配对的半胱氨酸导致的相互作用。

根据某些实施方式，优选的氨基酸置换是以下那些：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变蛋白复合物的结合亲和性，(4)改变结合亲和性，和/或(4)赋予或改变此类多肽的其他生理化学或功能性质。根据某些实施方式，单个或多个氨基酸置换(在某些实施方式中，保守性氨基酸置换)可以是在天然存在的序列中(在某些实施方式中，在形成分子间接触的一个或多个结构域外的多肽部分中)。在某些实施方式中，保守性氨基酸置换通常不会显著改变亲本序列的结构特征(例如，替换氨基酸不应倾向于破坏亲本序列中出现的螺旋，或破坏表征亲本序列的其他类型的二级结构)。在蛋白、结构和分子原理(Creighton,Ed.,W.H.Freeman and Company,New York(1984))；蛋白结构介绍(C.Branden和J.Tooze编著，Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；和Thornton等，Nature 354:105(1991)中描述了本领域公认的多肽的二级和三级结构的实例，其每一个通过引用并入本文。

在某些实施方式中，本发明所述的抗体可以与多聚体、脂质或其他部分化学键合。

结合剂可以包含并入生物相容性框架结构中的至少一种本文所述的CDR。在一个实例中，生物相容性框架结构包含足以形成构象稳定的结构支持物或框架或支架的多肽或其部分，其能够在局部表面区域展示一种或多种与抗原结合的氨基酸序列(例如，CDR、可变区等)。这样的结构可以是天然存在的多肽或多肽“折叠”(结构基序)，或者相对于天然存在的多肽或折叠可以具有一个或多个修饰，如氨基酸的添加、缺失或置换。这些支架可以源自任何物种(或多于一个物种)的多肽，如人、其他哺乳动物、其他脊椎动物、无脊椎动物、植物、细菌或病毒。

通常，生物相容性框架结构基于除免疫球蛋白结构域之外的蛋白支架或骨架。例如，可以使用基于纤连蛋白、锚蛋白、脂质运载蛋白、新制癌素、细胞色素b、CP1锌指、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1、Z结构域和tendamist结构域的那些(参见例如，Nygren和Uhlen,1997,Curr.Opin.in Struct.Biol.,7,463-469)。

将意识到的是本发明所述的抗体包括本文所述的人源化抗体。可以使用本领域公知的技术产生人源化抗体，如本文所述的那些(Zhang,W.等，Molecular Immunology.42(12):1445-1451,2005；Hwang W.等，Methods.36(1):35-42,2005；Dall’Acqua WF等，Methods 36(1):43-60,2005；和Clark,M.,Immunology Today.21(8):397-402,2000)。

当抗体包含如上所述的CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H、CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L中的一种或多种时，其可以通过从含有编码这些序列的DNA的宿主细胞中表达而获得。可以根据CDR的氨基酸序列确定编码每个CDR序列的DNA，并酌情使用寡核苷酸合成技术、定点诱变和聚合酶链反应(PCR)技术与任何所需的抗体可变区框架和恒定区DNA序列一起合成。本领域技术人员可从基因序列数据库如中广泛获得编码可变区框架和恒定区的DNA。

一旦合成，编码本发明的抗体或其片段的DNA可以根据用于核酸切除、连接、转化和转染的多种熟知程序中的任一种使用任何数量的已知表达载体增殖和表达。因此，在某些实施方式中，所述抗体片段的表达可以优选地在原核宿主中，如大肠杆菌(参见，例如，Pluckthun等，1989Methods Enzymol.178:497 515)。在某些其他实施方式中，所述抗体或其片段的表达可以优选地在真核宿主细胞中，包括酵母(例如，酿酒酵母、粟酒裂殖酵母和毕赤酵母)、动物细胞(包括哺乳动物细胞)或植物细胞。适宜动物细胞的实例包括但不限于骨髓瘤(如小鼠NSO细胞系)、COS、CHO或杂交瘤细胞。植物细胞的实例包括烟草、玉米、大豆和水稻细胞。

可以制备一种或多种含有编码抗体可变区和/或恒定区的DNA可复制表达载体，并将其用于转化合适的细胞系，例如，非生产性骨髓瘤细胞系，如小鼠NSO细胞系或细菌，如大肠杆菌，其中将进行抗体生产。为了获得有效的转录和翻译，在每个载体中的DNA序列应包含适宜的调控序列，特别是与可变结构域序列可操作地连接的启动子和前导序列。以这种方式产生抗体的具体方法通常是众所周知的并且是常规使用的。例如，在Maniatis等，(Molecular Cloning,ALaboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989；亦参见Maniatis等，3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork,(2001))中描述了基本分子生物学操作。可以根据Sanger等，(PNAS 74:5463,(1977))和Amersham International plc测序手册中所描述的进行DNA测序，并且根据本领域公知的方法进行定点诱变(Kramer等，Nucleic Acids Res.12:9441,(1984)；KunkelProc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488 92(1985)；Kunkel等，Methods in Enzymol.154:367 82(1987)；Anglian Biotechnology Ltd.手册)。此外，很多出版物描述了适用于通过操作DNA、创建表达载体以及转化和培养适当细胞来制备抗体的技术(Mountain A和Adair,J R，Biotechnology and Genetic Engineering Reviews(Tombs,M P编著,10,第1章,1992,Intercept,Andover,UK)；“Current Protocols in Molecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(ed.),Wiley Interscience,New York)。

当需要提高根据本发明所述的抗体的亲和性时，包含一个或多个上述CDR的抗体可以通过多种亲和性成熟方案获得，包括保持CDR(Yang等，J.Mol.Biol.,254,392 403,1995)、链改组(Marks等，Bio/Technology,10,779 783,1992)、使用大肠杆菌突变菌株(Low等，J.Mol.Biol.,250,350 368,1996)、DNA改组(Patten等，Curr.Opin.Biotechnol.,8,724733,1997)、噬菌体展示(Thompson等，J.Mol.Biol.,256,7 88,1996)和有性PCR(Crameri等，Nature,391,288 291,1998)。在Vaughan等，(Nature Biotech.,16,535 539,1998)中讨论了亲和性成熟的所有这些方法。

本领域技术人员将理解，一些蛋白(如抗体)可以经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用于表达蛋白的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可包括在糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺中的变化。一种常见的修饰是由于羧肽酶的作用失去了羧基末端的碱性残基(如赖氨酸或精氨酸)(如在Harris,R.J.Journal of Chromatography 705:129-134,1995中所描述的)。

7.8.药物组合物

还提供了包含本公开内容的蛋白和多肽的药物组合物。此类组合物包含与药学上可接受的材料和生理学上可接受的制剂材料混合的治疗或预防有效量的多肽或蛋白。

药物组合物可包含用于改变、维持或保存例如组合物的pH、渗透压、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的制剂材料。

适宜的制剂材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐、其他有机酸)；蓬松剂(如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；染色剂；调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐反离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克、PEG、脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯，如聚山梨酯20、聚山梨酯80、triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙帕)；稳定性增强剂(蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾、甘露醇、山梨糖醇)；递送载剂；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。中性缓冲盐水或与同种血清白蛋白混合的盐水是合适稀释剂的实例。根据适当的行业标准，还可以添加防腐剂，例如苯甲醇。可以使用合适的赋形剂溶液(如蔗糖)作为稀释剂将组合物配制成冻干物。在所采用的剂量和浓度下，合适的组分对受体是无毒的。药物制剂中可以使用的组分的其他实例可以参见Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th Ed.(1980)和20th Ed.(2000),Mack Publishing Company,Easton,PA。

任选地，所述组合物另外包含一种或多种生理学活性剂，例如，抗血管生成物质、化学治疗物质(如卡培他滨、5-氟尿嘧啶或多柔比星)、镇痛物质等，其中的非排他性实例在此提供。在各种特定实施方式中，除了RPP以外，组合物包含1、2、3、4、5或6种生理学活性剂。

在本发明的另一个实施方式中，可以将本文公开的组合物以中性或盐形式制剂加成盐。示例性的药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)，并且其与无机酸，例如，盐酸或磷酸，或诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在配制时，溶液将以与制剂相容的方式并且以治疗有效量施用。

载体还可包括任何和所有溶剂、分散介质、载剂、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规介质或药剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。还可以将补充活性成分加入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用于人时不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。

最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如预期的给药途径、递送形式和所需剂量来确定。参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，同上。此类组合物可影响多肽的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。例如，适宜的组合物可以是注射用水、胃肠外施用的生理盐水溶液。

7.8.1.药物活性成分的含量

在典型的实施方式中，活性成分(即，本公开内容的蛋白和多肽)以至少0.01mg/ml、至少0.1mg/ml、至少0.5mg/ml或至少1mg/ml的浓度存在于药物组合物中。在某些实施方式中，活性成分以至少1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml或25mg/ml的浓度存在于药物组合物中。在某些实施方式中，活性成分以至少30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml或50mg/ml的浓度存在于药物组合物中。

7.8.2.一般制剂

所述药物组合物可以是任何适用于人或兽药的形式，包括液体、油、乳剂、凝胶、胶体、气雾剂或固体。

所述药物组合物可以被配置成通过适合于人或兽药的任何施用途径施用，包括肠内和胃肠外施用途径。

在各种实施方式中，所述药物组合物被配制成用于吸入施用。在这些实施方式的某些中，所述药物组合物被配制成用于通过蒸发器施用。在这些实施方式的某些中，所述药物组合物被配制成用于通过雾化器施用。在这些实施方式的某些中，所述药物组合物被配制成用于通过气雾器施用。

在各种实施方式中，所述药物组合物被配制成用于口服施用、用于口腔施用或用于舌下施用。

在一些实施方式中，所述药物组合物被配制成用于静脉内、肌内或皮下施用。

在一些实施方式中，所述药物组合物被配制成用于鞘内或脑室内施用。

在一些实施方式中，所述药物组合物被配制成用于局部施用。

7.8.3.适于注射的药物组合物

对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在患病部位注射，活性成分将是无热原的，并具有合适的pH、等渗性和稳定性的肠胃外可接受的水溶液形式。本领域相关技术人员能够很好地使用例如等渗载体如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液制备合适的溶液。根据需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。

在各种实施方式中，所述单位剂型是小瓶、安瓿、瓶或预充式注射器。在一些实施方式中，所述单位剂型包含0.01mg、0.1mg、0.5mg、1mg、2.5mg、5mg、10mg、12.5mg、25mg、50mg、75mg或100mg药物组合物。在一些实施方式中，所述单位剂型包含125mg、150mg、175mg或200mg药物组合物。在一些实施方式中，所述单位剂型包含250mg药物组合物。

在典型实施方式中，所述单位剂型的药物组合物是液体形式。在各种实施方式中，所述单位剂型包含0.1mL至50ml之间的药物组合物。在一些实施方式中，所述单位剂型包含1ml、2.5ml、5ml、7.5ml、10ml、25ml或50ml药物组合物。

在特定实施方式中，所述单位剂型是小瓶，其含有浓度为0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的1ml药物组合物。在一些实施方式中，所述单位剂型是小瓶，其含有浓度为0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的2ml药物组合物。

在一些实施方式中，所述单位剂型的药物组合物是固体形式，如适合溶解的冻干物。

适用于皮下、皮内或肌肉内给药的单位剂型实施方式包括预装注射器、自动注射器和自动注射笔，各自含有预定量的上文所述的药物组合物。

在各种实施方式中，所述单位剂型是预负载注射器，其包含注射器和预定量的药物组合物。在某些预负载注射器的实施方式中，注射器适于皮下施用。在某些实施方式中，注射器适于自我施用。在特定实施方式中，预负载注射器是一次性注射器。

在各种实施方式中，预负载注射器含有约0.1mL至约0.5mL药物组合物。在某些实施方式中，注射器含有约0.5mL药物组合物。在特定实施方式中，注射器含有约1.0mL药物组合物。在特定实施方式中，注射器含有约2.0mL药物组合物。

在某些实施方式中，所述单位剂型是自动注射笔。自动注射笔包含含有如本文所述的药物组合物的自动注射笔。在一些实施方式中，自动注射笔递送预定体积的药物组合物。在其他实施方式中，自动注射笔被配置为递送由用户设定的一定体积的药物组合物。

在各种实施方式中，自动注射笔含有约0.1mL至约5.0mL药物组合物。在特定实施方式中，自动注射笔含有约0.5mL药物组合物。在特定实施方式中，自动注射笔含有约1.0mL药物组合物。在其他实施方式中，自动注射笔含有约5.0mL药物组合物。

7.8.4.血浆IVIg与重组超免疫的混合物

在一些实施方式中，将重组超免疫掺入常规血浆IVIg中以增加IVIg的抗病原体滴度。在一些实施方式中，将几种抗病原体重组超免疫掺入常规血浆IVIg中，例如，将针对Hib、肺炎链球菌、甲型流感病毒和破伤风的超免疫同时掺入血浆IVIg中以治疗原发性免疫缺陷患者。超免疫的掺入增加了针对病原体的抗体滴度，原发性免疫缺陷患者对这些病原体特别敏感。可以将任何数量的掺入物与血浆IVIg混合，以增加针对任何数量病原体的滴度。

在一些实施方式中，由药剂师将掺入重组超免疫与血浆IVIg混合。在一些实施方式中，由生产厂商将掺入重组超免疫与血浆IgIg混合。

7.9.单位剂型

所述药物组合物可以方便地以单位剂型存在。

所述单位剂型通常适于药物组合物的一种或多种特定施用途径。

在各种实施方式中，所述单位剂型适于通过吸入施用。在这些实施方式的某些中，所述单位剂型适于通过蒸发器施用。在这些实施方式的某些中，所述单位剂型适于通过雾化器施用。在这些实施方式的某些中，单位剂型适于通过气雾器施用。

在各种实施方式中，所述单位剂型适于通过口服施用、通过口腔施用或通过舌下施用。

在一些实施方式中，所述单位剂型适于通过静脉内、肌内或皮下施用。

在一些实施方式中，所述单位剂型适于通过鞘内或脑室内施用。

在一些实施方式中，所述药物组合物被配制成用于局部施用。

可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的化合物的量。

8.RPP活性

RPP(例如，根据本发明所述的抗体)针对抗原靶点可以具有小于或等于5x10^-7M、小于或等于1x10^-7M、小于或等于0.5x10^-7M、小于或等于1x10^-8M小于或等于1x10^-10M、小于或等于1x10^-11M或小于或等于1x10^-12M的结合亲和性。

RPP的亲和力，以及抗体抑制结合的程度，可由本领域普通技术人员使用常规技术确定，例如，Scatchard等，(Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660 672(1949))描述的那些，或通过表面等离子体共振(SPR；BIAcore,Biosensor,Piscataway,NJ)。对于表面等离子体共振，将靶分子固化在固相上，并与流动池中流动相中的配体接触。如果配体与固定靶点发生结合，局部折射率会发生变化，从而导致SPR角度发生变化，这可以通过检测反射光强度的变化来实时监测。可以分析SPR信号的变化率以产生结合反应的结合和解离阶段的表观速率常数。这些值的比率给出了表观平衡常数(亲和性)(参见，例如，Wolff等，Cancer Res.53:2560 65(1993))。

9.治疗对RPP产生应答的疾病的方法

在另一个方面中，提出了用于治疗患有对RPP产生应答的疾病的受试者的方法。所述疾病可以是癌症、AIDS、阿尔茨海默氏病或者病毒或细菌感染。在某些方面中，所述RPP用于在器官、组织或细胞群体从供体移植到宿主期间诱导耐受。

术语“治疗”、“治疗”等在本文中用于一般意指获得期望的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病、病况或其症状而言，效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病或病况和/或副作用(如归因于疾病或病况的症状)而言，可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物，特别是人疾病或病况的任何治疗，并且包括：(a)在可能易患该疾病或病况但尚未被诊断为患有该疾病或病况的受试者中预防该疾病或病况的发生；(b)抑制疾病或病况(例如，阻止其进展)；或者(c)缓解疾病或病况(例如，使疾病或病况消退，改善一种或多种症状)。根据本领域已知的标准方法和技术，可以容易地评估任何条件的改善。通过疾病的方法治疗的受试者群体包括患有不希望的病症或疾病的受试者，以及处于发展成病况或疾病的风险中的受试者。

术语“治疗有效剂量”或“有效量”是指产生所施用的所需效果的剂量或量。确切的剂量或量将取决于治疗的目的，并且本领域技术人员可以使用已知技术确定(参见，例如，Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)。

术语“足够的量”指足以产生所需作用的量。

术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是治疗。

术语“改善”指在治疗疾病状态(例如，神经变性疾病状态)重的任何治疗上有益的结果，包括预防、减轻其严重性或进展、缓解或治愈。

可以任选地采用体内和/或体外测定来帮助确定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还取决于给药途径和病情的严重程度，应根据从业者的判断和每个受试者的情况来决定。有效剂量可以从体外或动物模型试验系统的剂量应答曲线中推断出来。

实际给药量、给药速率和时程将取决于所治疗的蛋白聚集疾病的性质和严重程度。治疗处方(例如，决定剂量等)由全科医生和其他医生负责，并且通常会考虑待治疗的病症、个体患者的状况、递送部位、施用方法和从业者已知的其他因素。上文提及的技术和方案的实例可以参见Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.(ed),1980。

在一些实施方式中，所述药物组合物通过吸入施用、口服、通过口腔施用、通过舌下施用、通过注射或通过局部应用。

在一些实施方式中，所述药物组合物以足以调节神经元存活或多巴胺释放的量施用。在一些实施方式中，以每剂低于1g、低于500mg、低于100mg、低于10mg的量施用主要大麻素。

在一些实施方式中，所述药物组合物每天施用一次、每天2-4次、每周2-4次、每周一次或每两周一次。

10.实施例

以下是用于实施本发明的具体实施方式的实施例。提供这些实施例仅用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。已努力确保所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但当然应允许一些实验误差和偏差。

除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的蛋白化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。这些技术在文献中被充分解释。参见，例如，T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,现行版)；Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编著，Academic Press,Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry，第3版(Plenum Press)A和B卷(1992)。

10.1.1.实施例1：产生具有针对人胸腺细胞或T细胞活性的RPP的文库

生成四个靶向人胸腺细胞或T细胞的RPP(即，重组人抗胸腺细胞球蛋白(rhATG))的文库。采用体外和体内研究两者来证明该rhATG与市售家兔-ATG(Thymoglobulin,Sanofi)之间的功能相似性。重链和轻链CDR3序列在上文表5的RPP 10-13中提供。

市售抗胸腺细胞球蛋白(ATG，(Thymoglobulin,Sanofi))可用于诱导移植耐受，且是通过用人胸腺细胞对新西兰兔进行免疫而制备的；血是从数千只动物中采集的，且抗体是从血浆中纯化的。本文公开的RPP的文库(即，rhATG)将多克隆ATG的功效优势与全人重组RPP文库的安全性优势结合。

首先，用人胸腺细胞或人T细胞免疫携带插入的人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。在三周内每周两次对两只Trianni小鼠进行足垫注射，然后在接下来的两周内进行强化。在每个时间点向将一至两百万个胸腺细胞注射至每只小鼠内。在最后一次强化之前，通过流式细胞术，使用每只动物血清的稀释系列(从1:200开始至1:145,000结束)来评估胸腺细胞抗体的血清滴度。我们在这两只动物中观察到强烈的血清应答，其中一只动物表现出稍强的应答。处死后，手术取出淋巴结(腘窝、腹股沟、腋窝和肠系膜)。通过手动破坏和然后通过70μm过滤器来制备每只动物的单细胞悬液。接下来，我们使用EasySep^TM小鼠泛B细胞分离试剂盒(Stemcell Technologies)阴性选择试剂盒来从每个样品中分离B细胞。通过在C-Chip血细胞计数仪(Incyto)上计数来定量淋巴结B细胞群体，并使用台盼蓝评估存活。然后，在有12％OptiPrep^TM密度梯度培养基(Sigma)的磷酸盐缓冲液(PBS)中将细胞稀释至5,000–6,000个细胞/mL。将该细胞混合物用于微流体包封。通过我们的乳剂液滴微流体平台运行大约一百万个来自六只动物中的每一只的B细胞。

使用乳剂液滴微流体平台或涡流乳剂产生天然重-轻Ig配对完整的编码来自单细胞RNA的scFV的DNA文库。将用于产生所述DNA文库的方法分为1)poly(A)+mRNA捕获，2)多路复用重叠延伸逆转录酶聚合酶链反应(OE-RT-PCR)，和3)巢式PCR，以去除人工物并添加用于深度测序或酵母展示文库的衔接子。所述scFV文库由来自达到阳性ELISA滴度的每只动物的大约一百万个B细胞产生。

对于poly(A)+mRNA捕获，使用由玻璃(Dolomite)制造的定制设计的共流乳剂液滴微流体芯片。所述微流体芯片具有两个用于氟碳油(Dolomite)的输入通道，一个是上述细胞悬液混合物的输入通道，和一个是细胞裂解缓冲液(20mM Tris pH 7.5、0.5M NaCl、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5％吐温-20和20mM二硫苏糖醇)中1.25mg/ml oligo-dT珠子(NEB)的输入通道。对于大多数芯片长度，将输入通道蚀刻至50μm乘150μm，将液滴汇合处收窄至55μm，并用疏水性Pico-Glide(Dolomite)涂覆输入通道。使用三个Mitos P-Pump压力泵(Dolomite)来泵送液体通过芯片。液滴尺寸取决于压力，但通常直径～45μm的液滴是稳定性最佳的。将乳剂收集至冷却的2mL微量离心管内，并在40℃下孵育15分钟以进行mRNA捕获。使用Pico-Break(Dolomite)从液滴中提取珠子。在一些实施方式中，使用涡旋制备类似的单细胞分区乳剂。

对于多路复用OE-RT-PCR，使用玻璃Telos液滴乳剂微流体芯片(Dolomite)。将mRNA结合的珠子重悬至OE-RT-PCR混合物内，并在产生27μm液滴的压力下用矿物油基表面活性剂混合物(可从GigaGen购买获得)注射至微流体芯片内。所述OE-RT-PCR混合物包含2x一步RT-PCR缓冲液、2.0mM MgSO₄、SuperScript III逆转录酶和Platinum Taq(ThermoFisher Scientific)，加上针对IgK C区、IgG C区和所有V区的引物的混合物。重叠区是编码富含Gly-Ser的scFv接头序列的DNA序列。使用液滴破碎溶液(可从GigaGen购买获得)从液滴中回收DNA片段，然后使用QIA快速PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。在一些实施方式中，使用涡旋制备类似的OE-RT-PCR乳剂。

对于巢式PCR，首先在1.7％琼脂糖凝胶上，在150V下运行纯化的OE-RT-PCR产物80分钟。切下对应于连接产物的1200-1500个碱基对(bp)处的条带，并使用NucleoSpin凝胶和PCR净化(Clean-up)试剂盒(Macherey Nagel)纯化。然后进行PCR以添加用于Illumina测序或酵母展示的衔接子；对于测序，添加七个核苷酸的随机物以在随后的下一代测序步骤中增加碱基呼叫准确度。用具有包含Illumina衔接子的引物或用于克隆至酵母表达载体内的引物的2x NeBNext高保真扩增混合物(NEB)进行巢式PCR。在1.2％琼脂糖凝胶上，在150V下运行巢式PCR产物50分钟。切下800-1100bp处的条带，并使用NucleoSpin凝胶和PCR净化试剂盒(Macherey Nagel)纯化。

为了将GigaLink^TMscFv文库转化为全长CHO表达文库，使用巢式外部PCR引物将带具有用于Gibson组装的悬突的接头添加至scFv文库的5’和3’末端。然后，使用NEBuilderHiFi DNA Assembly Master Mix(NEB,Ipswich,MA,USA)将scFv文库插入包含单个启动子、轻链Ig的分泌前导序列和IgG1恒定区的剩余部分的载体中，建立克隆的scFv文库。将该中间文库转化到大肠杆菌中，涂布到LB-氨苄西林板上，刮取0.5-1百万个菌落并合并以使用ZymoPURE II Plasmid Maxiprep试剂盒(Zymo Research,Irvine,CA,USA)进行质粒纯化。为了建立全长抗体文库，通过使用BamHI-HF(NEB,Ipswich,MA,USA)线性化GA1的产物并使用其作为载体插入合成的扩增子来进行第二Gibson组装，所述合成的扩增子包含轻链Ig恒定区中的一部分、轻链Ig的poly(A)信号、IgG基因的启动子和IgG基因的分泌前导序列。然后，将全长文库转化到大肠杆菌中并涂布在LB-氨苄西林板上。刮取超过50万个菌落，并使用ZymoPURE II Plasmid Maxiprep试剂盒(Zymo Research)纯化质粒以制备用于转染的全长重组超免疫maxiprep文库。

使用基因组整合的FRT位点(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)改造贴壁Flp-In^TM-CHO细胞系使其适于悬浮培养。对于改造过程中的所有步骤，“Ham’s F-12”指Ham’s F-12(具有L-谷氨酰胺，Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)加10％FBS(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)，且“BalanCD”指具有4mM Glutamax(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)的BalanCD CHO Growth A(IrvineScientific)。为了改造这种细胞系使其适于悬浮，首先将细胞传代到方瓶中的50％Ham’sF-12加50％BalanCD的混合物中。接下来将细胞传代到25％Ham’s F-12加75％BalanCD中，并转换到振荡锥形瓶中。然后，将细胞传代到10％Ham’s F-12、90％BalanCD+0.2％抗结块剂(Irvine Scientific,Santa Ana,CA,USA)中，并储存以备将来使用。

每个重组超免疫文库使用Amaxa Nucleofector 4D(SG缓冲液，脉冲DU133；Lonza,Basel,Switzerland)转染1亿个经改造的Flp-In CHO细胞。将这些细胞接种到振荡锥形瓶中，并在37℃和125rpm下的培养箱中恢复48小时。48小时后，对细胞计数以确定存活，以100万个细胞/mL接种细胞，并在新鲜培养基中使用600μg/mL潮霉素B(Gemini Bio,WestSacramento,CA,USA)开始选择。在7天选择期间，对细胞进行计数并每2-3天更换一次培养基。在扩增期间将文库保持在600μg/mL潮霉素-B(Gemini Bio,West Sacramento,CA,USA)上，直到存活超过95％为止。当细胞存活>95％并且每24小时倍增时，则储存细胞系以用于液氮储存。

在由90％BalanCD CHO Growth A培养基(Irvine Scientific,Santa Ana,CA)、9％Ham’s F-12(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)、1％FBS(ThermoFisherScientific)、4mM Glutamax(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)、0.2％抗结块剂(Irvine Scientific,Santa Ana,CA,USA)组成的培养基中培养稳定表达抗体文库的CHO细胞。对于小规模产生，将细胞以1×10⁶个细胞/mL接种到250mL锥形瓶中的50mL培养基中，并在37℃、5％CO₂、125rpm下生长。使细胞在这些条件下持续生长，并在生产运行的第2、4和7天补充7.5mL CHO Feed 1(Irvine Scientific,Santa Ana,CA,USA)。在第8天通过离心收集上清液，随后通过带有1μm预滤器(EMD Millipore,Burlington,MA,USA)的0.22μm 250mL滤瓶(EMD Millipore,Burlington,MA,USA)过滤。将收集的细胞培养液(HCCF)储存在4℃下直到进行蛋白A纯化为止。对于浆细胞重组超免疫的大规模产生，使细胞在相同培养基中生长，但是对生产条件进行一些修改。使用种子列车培养在37℃下将培养物从2×10⁷个细胞扩增到1.2×10¹⁰个细胞。然后，在5L瓶中以1×10⁶个细胞/mL、2L接种细胞(一式三份；第0天)。在第2天，温度从37℃变为33℃。在培养的第2、4、6、8、10和13天，向每个瓶中添料300mLCHO Feed 1(Irvine Scientific,Santa Ana,CA,USA)。在第14天收集上清液。

收集后，使用以下缓冲液，用MabSelect SuRe蛋白A树脂(GE Life Sciences,Marlborough,MA,USA)纯化HCCF：平衡、追踪、洗涤2(25mM Tris,150mM NaCl,pH 7.4)，洗涤1(25mM Tris,1M NaCl,pH 7.4)，洗脱(20mM柠檬酸，pH 3.0)，中和(小规模的是100mMTris,pH 8.0，大规模的是1M Tris,pH 9.0)。在使用之前和之后用0.1N NaOH对色谱柱进行消毒。对于浆细胞重组超免疫的大规模产生，使用由0.5M精氨酸(pH 7.4)组成的另外的洗涤3，然后在洗脱前用洗涤2进行另外的洗涤。纯化步骤的顺序为：平衡，上样，追踪，洗涤1，洗涤2(大规模：洗涤3、洗涤2)，洗脱，中和(手动添加到用于收集洗脱组分的管中)。使用Vivaspin 20、30kDa截留分子量自旋浓缩器(Sartorius,Germany)浓缩重组超免疫(RPP)，并在PBS(小规模产生)或0.2M甘氨酸(pH 4.5)(大规模产生)中配制，然后进行0.22μm过滤。

使用ELISA以检测rhATG的结合，即，抗T细胞和抗胸腺细胞RPP与已知表达在T细胞和胸腺细胞表面上的抗原的结合。ELISA显示与CD4、CD45和CD81的结合。以1μg/mL将抗原包被在ELISA板上。从100μg/mL的每种抗体开始，使用1/3逐步稀释来进行滴定曲线以确定EC50。由于使用不同第二检测抗体，因此无法直接比较兔-ATG和rhATG之间的EC50值。但是，确定在每个文库中具有比其各自背景更强的结合的抗原。抗体应答对rhATG和兔-ATG两者的许多T细胞抗原具有广泛的反应性，两者与CD45和CD5的结合非常强，而与CD4、CD11和CD81的结合较弱(未显示数据)。

进行了体内验证研究。使用GvHD(移植物抗宿主病)的体内模型以证明ATG治疗诱导的GvHD延迟的功能功效。将来自单个供体的1x10^7个人PBMC移植到NSG小鼠中。该研究使用每组6只小鼠静脉(IV)输注测试的药物：rhATG(RPP)、市售兔-ATG和载剂对照。在移植后7天的单一时间点治疗动物(6mg/kg)。此外，阳性对照组(8只小鼠)接受阿巴西普，常用于预防GvHD的药物，并且其从第5天到研究结束每隔一天腹腔(IP)给药。通过流式细胞术测量免疫细胞的扩增，其表示进展为GvHD，并且监测动物的体重减轻和GvHD导致死亡的临床表现。

PBMC移植后四十二天，记下仍然存活的任何动物，并完成每个治疗组的存活分析。rhATG(p＝0.2,Mantel-Cox)没有显著延迟，且兔-ATG(p＝0.01,Mantel-Cox)仅观察到GvHD的轻微延迟(未显示数据)。在治疗前、治疗后2天和治疗后9天使用流式细胞术测量移植的PBMC。rhATG和兔-ATG消耗了CD45+细胞，如治疗后2天所见，导致CD45+细胞的完全移植中的延迟，但是到第9天，任何组之间没有显著差异(未显示数据)。

结果表明，rhATG(RPP的文库)与目前可用的市售兔-ATG具有相似的抗原特异性抗体结合特征，尽管观察到一些差异。此外，在使用不同给药方案的小鼠中，rhATG在延迟进展为GvHD方面也表现出与市售兔-ATG的相似性。

10.1.2.实施例2：从人供体中产生具有针对乙型流感嗜血杆菌(Hib)活性的RPP的文库

进行体外和体内研究两者，测试具有针对乙型流感嗜血杆菌(Hib)活性的多克隆抗体池(pAb)(即，RPP的文库)。测试的是由四种不同B细胞亚型制成的抗Hib pAb，所述B细胞亚型是从接种Pedvax-HIB结合疫苗的供体收集的。测试的四种亚型是CD43+浆母细胞、CD27+记忆B细胞、外周CD138+浆细胞和泛B细胞(所有B细胞)。首先在体外测试所有四种pAb。由CD138+浆细胞制成的pAb在体外最有效，因此随后在体内攻击模型中测试了该产品相对于IVIG的情况。

在上文表5的RPP 3-6中提供了RPP的重链和轻链CDR3序列的SEQ ID NO。

使用CRO(BloodCenter Wisconsin,Milwaukee,WI,USA)与PedvaxHIB疫苗(Merck,Kenilworth,NJ,USA)接种两个供体(供体1是26岁的白人女性，和供体2是21岁的亚裔男性)。八天或九天后进行白细胞去除术以获得PBMC。同时，在白细胞去除术当天和接种疫苗之前从单独的抽血中分离血浆。对血浆样品进行的针对Hib的ELISA(Alpha Diagnostics,San Antonio,TX,USA；参见下文的方法)证实了与疫苗接种前相同供体的血浆相比对疫苗的应答。样品收集方案由机构审查委员会(Institutional Review Board，IRB)方案#PRO00028063(Medical College of Wisconsin/Froedtert Hospital IRB)批准给GigaGen。获得了所有参与者的知情同意，并将样品运送到GigaGen去标识化。

为了分离泛B细胞，我们使用了人EasySep泛B细胞富集试剂盒(Stemcell#19554,Vancouver,BC,Canada)。为了分离CD43+细胞，我们使用了泛B细胞和CD34的阳性选择珠子(Miltenyi#130-091-333,Bergisch Gladbach,Germany)。为了分离CD27+细胞，我们将CD27阳性选择珠子(Miltenyi#130-051-601,Bergisch Gladbach,Germany)应用于来自CD43+选择的阴性部分。对于浆细胞，我们将EasySep人CD138阳性选择试剂盒(Stemcell#18357,Vancouver,BC,Canada)应用于PBMC。分离后，使用CS10(StemcellTechnologies,Vancouver,BC,Canada)冷冻保存产生抗体的细胞。在生成配对的重链和轻链文库之前，将细胞解冻，在冷的DPBS+0.5％BSA中洗涤，在Countess^TM细胞计数器(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)上用台盼蓝评估其存活，然后以5,000-6,000个细胞/μl重悬于12％OptiPrep^TM密度梯度培养基(Sigma,St.Louis,MO,USA)中。这种细胞混合物用于下节所述的微流体封装。

从产生抗体的细胞中生成scFv文库(Adler等，Mabs 9,1282-1996,2017)包括三个步骤：(i)poly(A)+mRNA捕获，(ii)多路复用重叠延伸逆转录聚合酶链反应(OE-RT-PCR)，和(iii)巢式PCR以去除人工物并添加用于深度测序或酵母展示文库的接头序列。

为了将GigaLink^TMscFv文库转化成全长CHO表达文库，我们首先使用巢式外部PCR引物以将具有用于Gibson组装的悬突的接头添加至scFv文库的5’和3’末端。然后，使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB,Ipswich,MA,USA)将scFv文库插入包含单个启动子、轻链Ig的分泌前导序列和IgG1恒定区的剩余部分的载体中，建立克隆的scFv文库。将该中间文库转化到大肠杆菌中，涂布到LB-氨苄西林板上，刮取0.5-1百万个菌落并合并，以使用ZymoPURE II Plasmid Maxiprep试剂盒(Zymo Research,Irvine,CA,USA)进行质粒纯化。为了建立全长抗体文库，通过使用BamHI-HF(NEB,Ipswich,MA,USA)线性化GA1的产物并使用其作为载体插入合成的扩增子中，所述扩增子包含轻链Ig恒定区的一部分、轻链Ig的poly(A)信号、IgG基因的启动子和IgG基因的分泌前导序列。然后，将全长文库转化到大肠杆菌中并涂布在LB-氨苄西林板上。我们通常刮取>50万个菌落，并使用ZymoPUREII Plasmid Maxiprep试剂盒(Zymo Research)纯化质粒以制备用于转染的全长重组超免疫maxiprep文库。

使用基因组整合的FRT位点(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)改造贴壁Flp-In^TM-CHO细胞系使其适于悬浮培养。对于改造过程的所有步骤，“Ham’s F-12”指Ham’s F-12(含L-谷氨酰胺，Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)加10％FBS(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)，且“BalanCD”指具有4mM Glutamax(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)的BalanCD CHO Growth A(IrvineScientific)。为了改造这种细胞系使其适于悬浮，首先将细胞传代到方瓶中的50％Ham’sF-12和50％BalanCD的混合物中。接下来将细胞传代到25％Ham’s F-12和75％BalanCD中，并转换到振荡锥形瓶中。然后，将细胞传代到10％Ham’s F-12、90％BalanCD+0.2％抗结块剂(Irvine Scientific,Santa Ana,CA,USA)中，并储存以备将来使用。

每个重组超免疫文库使用Amaxa Nucleofector 4D(SG缓冲液，脉冲DU133；Lonza,Basel,Switzerland)转染1亿个经改造的Flp-In CHO细胞。将这些细胞接种到振荡锥形瓶中，并在37℃和125rpm下的培养箱中恢复48小时。48小时后，对细胞计数以确定存活，以100万个细胞/mL接种细胞，并在新鲜培养基中使用600μg/mL潮霉素B(Gemini Bio,WestSacramento,CA,USA)开始选择。在7天选择期间，对细胞进行计数并每2-3天更换一次培养基。在扩增期间将文库保持在600μg/mL潮霉素-B(Gemini Bio,West Sacramento,CA,USA)中，直到存活超过95％为止。当细胞存活>95％并且每24小时倍增时，则储存细胞系以用于液氮储存。

在由90％BalanCD CHO Growth A培养基(Irvine Scientific,Santa Ana,CA)、9％Ham’s F-12(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)、1％FBS(ThermoFisherScientific)、4mM Glutamax(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)、0.2％抗结块剂(Irvine Scientific,Santa Ana,CA,USA)组成的培养基中培养稳定表达抗体文库的CHO细胞。对于小规模产生，将细胞以1×10⁶个细胞/mL接种到250mL锥形瓶中的50mL培养基中，并在37℃、5％CO₂、125rpm下生长。使细胞在这些条件下持续生长，并在生产运行的第2、4和7天补充7.5mL CHO Feed 1(Irvine Scientific,Santa Ana,CA,USA)。在第8天通过离心收集上清液，随后通过带有1μm预滤器(EMD Millipore,Burlington,MA,USA)的0.22μm 250mL滤瓶(EMD Millipore,Burlington,MA,USA)过滤。将收集的细胞培养液(HCCF)储存在4℃下直到进行蛋白A纯化为止。对于浆细胞重组超免疫的大规模产生，使细胞在相同培养基中生长，但是对生产条件进行一些修改。使用种子培养在37℃下将培养物从2×10⁷个细胞扩增到1.2×10¹⁰个细胞。然后，在5L瓶中以1×10⁶个细胞/mL、2L接种细胞(一式三份；第0天)。在第2天将温度从37℃变为33℃。在培养的第2、4、6、8、10和13天，向每个瓶中添加300mL CHOFeed 1(Irvine Scientific,Santa Ana,CA,USA)。在第14天收集上清液。

收集后，使用以下缓冲液，使用MabSelect SuRe蛋白A树脂(GE Life Sciences,Marlborough,MA,USA)纯化HCCF：平衡、追踪、洗涤2(25mM Tris,150mM NaCl,pH 7.4)，洗涤1(25mM Tris,1MNaCl,pH 7.4)，洗脱(20mM柠檬酸，pH 3.0)，中和(小规模100mM Tris,pH8.0，大规模1M Tris,pH 9.0)。在使用之前和之后用0.1N NaOH对色谱柱进行消毒。对于浆细胞重组超免疫的大规模产生，使用由0.5M精氨酸，pH 7.4组成的另外的洗涤液3，然后在洗脱前用洗涤液2进行另外的洗涤。纯化步骤的顺序为：平衡，上样，追踪，洗涤1，洗涤2(大规模：洗涤3、洗涤2)，洗脱，中和(手动添加到用于收集洗脱组分的管中)。使用Vivaspin20、30kDa截留分子量自旋浓缩器(Sartorius,Germany)浓缩重组超免疫(RPP)，并在PBS(小规模产生)或0.2M甘氨酸pH 4.5(大规模产生)中配制，然后进行0.22μm过滤。

使用Maurice成像cIEF分析仪(Protein Simple,San Jose,CA,USA)进行成像毛细管等电聚焦(iCIEF)。在还原和非还原条件下使用LabChip GX II Touch HT(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)进行毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS)。使用Endosafenexgen-PTS(Charles River,Wilmington,MA,USA)测量内毒素水平。

我们在蛋白A步骤中观察到92.2％的HBV RPP收率。在非还原条件下，我们用CE-SDS在166.2kDa处观察到单峰(>99％)。在还原条件下，RPP显示>99％纯IgG单体和<1％其他蛋白质，而血浆IVIg显示大约3.1％未知蛋白质，这表明重组超免疫可以在比血浆IVIg更高的IgG纯度下产生。通过iCIEF对纯化的重组超免疫的分析揭示了广泛的等电物种，尽管血浆IVIg显示了相当广泛的等电物种。我们推测血浆IVIg具有更广泛的等电物种，因为其包含更广泛的抗体多样性，还包括不同的IgG同种型(重组超免疫仅IgG1)以及IgL。最后，内毒素水平<0.5内毒素单位(EU)/mg，这是重组mAb疗法的典型基准。

使用定量PCR Illumina文库定量试剂盒(KAPA,Wilmington,MA,USA)对深度抗体测序文库进行定量并稀释至17.5pM。根据生产厂商的说明书，使用500循环MiSeq试剂试剂盒v2在MiSeq(Illumina,San Diego,CA,USA)上对文库测序。为制备测序文库，我们使用尾端PCR将Illumina测序接头添加到目标构建体的5’和3’末端。然后，我们获得了340个循环的正向读数和162个循环的反向读数。这产生了在CDR3-H和部分VH基因重叠的正向和反向读取，这增加了对核苷酸检测的置信度。使用我们之前报道的生物信息学管线进行序列分析(Adler等，Mabs 9,1282-1996,2017)。使用R版本3.4.2中的cor函数执行Pearson相关。

四个HBV RPP中的每一个都来自112-139万个输入细胞。在所述库经过我们的文库生成管线后，重组超免疫的克隆多样性都小于2,000个抗体克隆(范围：880至1,659)，捕获了输入抗体多样性的相当一部分。所有四种重组超免疫均具有93％的中位种系IgHV同一性，这表明没有细胞类型产生具有显著更高亲和性的抗体，这与此前对Hib疫苗接种个体的分析一致(Truck等，2015)。克隆多样性并不强烈偏向于任何混合物中最常见的抗体。最常见的抗体以3.5％的频率存在(浆细胞超免疫)。泛-B重组超免疫的克隆多样性偏差最小(前20种抗体占所有抗体的12.7％)，并且浆细胞重组超免疫的克隆多样性偏差最大(前20种抗体占所有抗体的26.6％)。

我们考察了四个重组超免疫文库的遗传多样性。重叠分析显示，任何给定的两个重组超免疫文库之间共享的克隆不超过11.8％。Pearson相关分析在任何两个配对比较之间均不显著(p<0.01)。全部四个重组超免疫文库都包含多种IgGV-J基因配对，包括带有IgHV3-23和IgHJ4基因的高频率抗体，这在抗Hib文库的其他地方已经看到(Silverman&Lucas,1991；Adderson等，1993；Lucas等，2003；Trück等，2015)。其他常见IgHV基因包括IgHV3-30、IgHV1-69和IgHV3-7。所有文库还包含互补决定区(CDR)3序列，其中包含之前在抗Hib文库中观察到的肽GYGFD或GYGMD(Lucas等，2003；Trück等，2015)。我们得出结论，所有四个文库都包含典型的抗Hib序列以及与种系和遗传多样性相似的差异水平。然而，这四个文库确实包含不同的抗体混合物，其可具有不同的功能特征。

将人抗-Hib-PRP IgG ELISA试剂盒(Alpha Diagnostics#980-100-PHG,SanAntonio,TX,USA)用于抗-Hib ELISA滴度。在低NSB(非特异性结合)样品稀释剂中进行抗体制剂的连续稀释。在酶标仪(Molecular Devices,Fremont,CA,USA)上在450nm处进行定量测量。使用SoftMax Pro(Molecular Devices,Fremont,CA,USA)计算EC50值。我们还确定了在接种Hib活性疫苗以及IVIg之前和之后来自两个供体的血浆混合物的抗Hib PRP抗体滴度。浆细胞、泛-B和浆母细胞重组超免疫产生比IVIg高得多的Hib结合滴度(范围：160×至2,323×)，其中浆细胞超免疫产生最高滴度。接种后血浆仅为IVIg抗Hib滴度的3.7倍，且在测试条件下，记忆B细胞重组超免疫未检测到抗Hib滴度。总之，这些数据表明我们的生产工艺可以通过从接种疫苗的供体中选择合适的细胞类型来显著提高抗Hib滴度。

在CRO(ImQuest Frederick,MD,USA)进行了体外中和研究。乙型流感嗜血杆菌Eagan菌株从Zeptometrix(#0801679,Buffalo,NY,USA)获得，其作为冷冻甘油原液并储存在-80℃。流感嗜血杆菌菌株ATCC 10211作为冻干原液从美国典型培养物保藏中心(ATCC,Frederick,MD,USA)获得，并按照供应商的建议进行繁殖。将在巧克力琼脂板上过夜孵育的菌落接种到生长培养基(Brain Heart Infusion，或BHI肉汤，BD BBL 299070,San Jose,CA,USA,2％Fildes富集，Remel#R45037,San Diego,CA,USA)，并允许实现约0.4的625nm(OD₆₂₅)光密度。将培养物调整为OD₆₂₅为0.15，这相当于大约5×10⁸个菌落形成单位(CFU)/mL。将培养物在稀释缓冲液(Hanks平衡盐溶液，Gibco,Waltham,MA,USA#14025-092,2％Fildes富集)中进一步稀释至5×10⁴个CFU/mL。在测定中使用的细菌培养物的密度通过将50μL 5×10³和5×10²的稀释液一式两份铺在巧克力琼脂上并在37℃/5％CO₂下孵育24小时后计数菌落来确认。

从200μg/mL开始，将待测物在稀释缓冲液中稀释三倍，以便评价十个总稀释度。将10μL待测物的每个稀释液一式两份添加到96孔微量滴定板中。然后，以约5×10⁴个CFU/mL的浓度以20μL体积将Eagan或ATCC 10211细菌添加到板中，以使得总的孔内细菌密度将为1×10⁴个CFU/20μL。在37℃/5％CO₂下孵育15分钟后，将25μL幼兔补体(Pel-Freez#31061-1,Rogers,AR,USA)和25μL稀释缓冲液添加到每个孔中。将板在37℃/5％CO₂下孵育60分钟。孵育后，将5μL的每种反应混合物在45μL的稀释缓冲液中稀释，并将整个50μL涂布在巧克力琼脂板上。将板在37℃/5％CO₂下孵育约16小时。孵育后，计数细菌菌落。杀死>50％细菌的待测物浓度是SBI。

如ELISA数据所预期的那样，记忆B细胞重组超免疫无法中和任何测试浓度的Hib菌株。浆细胞重组超免疫再次产生最高滴度，Eagan和ATCC10211菌株的SBI分别是81和243。泛-B和浆母细胞重组超免疫的效力是浆细胞重组超免疫的1/9。在任何测试浓度下均未检测到IVIg的中和作用。我们得出结论，浆细胞重组超免疫是测试的四种细胞类型中效力最高的。

所有脊椎动物实验均在美国密苏里州辛克莱研究中心有限责任公司的机构动物护理和使用委员会的监督和批准下进行，根据《动物福利法案》和《实验动物护理和使用指南》(国家科学院国家研究委员会，第八版)或丹麦国家动物伦理委员会中的标准，符合欧盟指令2010/63/EU的标准(许可号：2014-15-0201-00171)。

对于急性毒性，由CRO(Sinclair Research,Auxvasse,MO,USA)将Balb/cJ小鼠(Charles River,Wilmington,MA,USA)随机分成7组，每组6只动物。三组以30mg/kg、100mg/kg或300mg/kg的单剂量施用重组超免疫。阴性对照组以单剂量施用盐水载剂。剩余三个组以30mg/kg、100mg/kg或300mg/kg的单剂量血浆IVIg(Gammagard；Grifols,Sant Cugat,Catalonia)施用。将待测物样品在0.2M甘氨酸，pH 4.5中稀释。通过尾静脉静脉内进行待测物施用。根据每个单独动物最近的体重计算给药体积。然后，每天观察小鼠两次，共8天，观察总体健康状况、待测物施用部位的反应、发病率和死亡率、体重和总体身体检查(皮肤、粘膜、眼睛、耳朵、鼻子和呼吸)。3天后用CO₂气体对动物实施安乐死，并且进行终末血清化学检查，包括白蛋白、球蛋白、葡萄糖、总蛋白、血液尿素氮和其他几个指标。

对于任何测试组，我们都没有观察到与待测物相关的发现。我们得出结论，单次静脉给予浆细胞重组超免疫的无可见不良反应水平(NOAEL)为300mg/kg。在免疫缺陷患者中，IVIg通常以300mg/kg左右的剂量给药，以保护免受Hib和其他病原体的侵害，而Hib超免疫产品的效力要高数千倍，因此我们得出结论，浆细胞重组超免疫对于最低有效剂量没有可观察到的毒性。

对于药代动力学，CRO(Sinclair Research,Auxvasse,MO,USA)给予20只雄性Balb/cJ小鼠(Charles River,Wilmington,MA,USA)一个100mg/kg静脉尾静脉剂量的浆细胞重组超免疫。遵循稀疏的血液取样程序，使得没有小鼠接受预定的七次PK血液取样中的两次以上。然后，我们使用夹心配体结合测定(LBA)和中尺度发现(MSD；Rockville,MD,USA)电化学发光(ECL)技术，以测量血清人IgG。将捕获抗体(SouthernBiotech#2049-01,Birmingham,AL,USA)包被到96孔板(MSD,Rockville,MD,USA)上。在含有1％BSA(PBS/T/BSA)的PBS/T中将血清样品稀释至1:100的最低要求稀释度(MRD)。接下来，将稀释的样品加入指定的孔中。在另一个洗涤步骤之后，用含有1mg/mL生物素化山羊抗人IgG(SouthernBiotech#2049-08,Birmingham,AL,USA)的PBS/T/BSA接种孔。孵育后，添加链霉亲和素-SULFO-TAG，然后添加2×读取缓冲液T(MSD,Rockville,MD,USA)。ECL单位是使用MSD QuickPlex SQ 120仪器测量的。使用基于浆细胞的重组超免疫为每次运行额外生成标准曲线。Discovery Workbench软件(MSD,Rockville,MD,USA)用于使用平均ECL单位与标称IgG标准值的四参数逻辑(4PL)曲线拟合来拟合数据。在假设静脉内给药失败的情况下，我们从进一步分析中去除了在1小时时间点读数为1100ng/mL或更低的两只动物。然后我们使用R中的PKNCA包(Denney等，2015)对浓度-时间数据应用非房室分析来估计最大观察到的血浆浓度(C_最大)、最大观察到的血浆浓度的时间(T_最大)和半衰期(t_1/2)。

在给药后一小时(T_最大)观察到的最大血浆浓度为12,360ng/mL(C_最大)。重组超免疫的半衰期(t_1/2)为约34.5小时。将这些数据与ELISA滴度数据相结合，我们估计单次100mg/kg静脉给药的最大抗Hib谷水平为861IU/mL。

将流感嗜血杆菌菌株ATCC10211在巧克力琼脂板上在35℃和5％CO₂下生长过夜。使单个过夜菌落在无菌盐水中重悬至1.5×10⁸个CFU/mL。该悬浮液在含有5％粘蛋白和2％血红蛋白的BHI肉汤中稀释至约1×10⁶个CFU/mL，并进一步稀释10倍至10CFU/mL。

使用单次0.5mL腹腔内剂量的10⁴、10⁵或10⁶个CFU/mL Hib细菌(菌株ATCC10211)接种Balb/cJ小鼠(Taconic,Denmark；n＝6/组)。接种前约1小时，小鼠口服45μL Nurofen(20mg布洛芬/mL，相当于约30mg/kg)以缓解疼痛。接种前24小时，给予小鼠300mg/kg重组Hib超免疫、300mg/kg血浆IVIg或盐水。接种后1小时，给予小鼠20mg/kg环丙沙星抗生素作为阳性对照治疗。每2-6小时对小鼠的感染临床体征进行评分，并在受到感染严重影响时处死。再过72小时后，任何活体动物都用Zoletil混合物麻醉，并通过腋下切开收集血液。颈椎脱臼处死小鼠，腹腔注射2mL无菌生理盐水，轻轻按摩腹部，开腹前用移液管取液。每个样品在盐水中稀释10倍，然后将20μL点涂在巧克力琼脂板上。所有琼脂板在35℃环境空气中孵育18-22小时。

在载剂对照组中的所有接种剂量下，Hib感染对除一只小鼠外的所有小鼠都是致命的。相比之下，在重组超免疫治疗组(10⁶CFU接种组)中，18只小鼠中只有一只受到严重影响。IVIg的保护作用远低于重组超免疫，10⁵CFU和10⁶CFU接种组中有5/6只小鼠受到感染，10⁴CFU接种组中有2/6只小鼠受到感染的严重影响。血液中细菌负荷的分析表明，重组超免疫从所有动物的血流中消除了Hib，而IVIg治疗仅在一个接种组中导致相比于载剂对照显著更低的细菌载量，并且在两个接种组中没有显著减少(Dunnett多重比较检验，p<0.05)。在腹膜灌洗中，重组超免疫相比于载剂对照组再次显著降低了细菌负荷(Dunnett多重比较检验，p<0.05)。然而，虽然在用环丙沙星治疗的存活动物的腹膜灌洗液中检测不到Hib细菌，但在用重组超免疫治疗的6/17存活动物的腹膜灌洗液中可检测到Hib细菌(范围：23-77CFU/mL)。这表明腹膜和血液之间重组超免疫的功效存在差异，这可能是由于腹膜中药物或补体的生物利用度所致。

在一些实施方式中，将Hib超免疫加入常规血浆IVIg中以增加IVIg的抗Hib滴度。在一些实施方式中，将几种抗病原体超免疫加入常规血浆IVIg中，例如，将针对Hib、肺炎链球菌、甲型流感病毒和破伤风的超免疫加入血浆IVIg中以治疗原发性免疫缺陷患者。超免疫的峰值增加了针对病原体的抗体滴度，原发性免疫缺陷患者对这些病原体特别敏感。可以将任何数量的掺入物与血浆IVIg混合，以提高针对任何数量病原体的滴度。

使用一系列体外和体内实验，确定了以下内容。对于Hib，接种疫苗后的浆细胞产生最有效的RPP。浆细胞Hib RPP的效力(通过ELISA)比血浆IVIG强2,300倍以上。在体内攻击模型中，浆细胞Hib RPP对Hib感染具有很强的保护作用。使用浆母细胞和泛-B细胞也导致有效的体外RPP，但其不如浆细胞有效。对于这种抗原，由记忆B细胞制成的RPP在体外试验中具有无法检测到的效力水平。

10.1.3.实施例3：产生具有针对肺炎链球菌荚膜多糖活性的RPP文库

肺炎链球菌引起肺炎链球菌肺炎。产生了对肺炎链球菌具有活性的重组多克隆抗体(pAb)，即RPP文库，“GG-Pnc”。在体外检测GG-Pnc。结果证明了具有抗肺炎链球菌荚膜多糖活性的GG-Pnc的体外功能功效和效力。通过大量肺炎链球菌多糖ELISA、血清型特异性ELISA和血清型特异性调理吞噬试验对该文库进行分析。

在上文表5(RPP1)中提供了GG-Pnc的重链和轻链CDR3序列的SEQ ID NO。

使用在实施例1和实施例2中描述的重组技术，制备了GG-Pnc，即，RPP文库。该文库由使用Pneumovax-23疫苗免疫接种的三个供体制备。Pneumovax-23由来自23种肺炎链球菌血清型的荚膜多糖组成。如通过ELISA所测量的，免疫接种后全部三个供体均显示出针对肺炎链球菌荚膜多糖增加的滴度。rpAb由从供体分离的所有B细胞亚型的混合物制成。

Alpha Diagnostics ELISA测量对Pneumovax-23疫苗中存在的23种肺炎链球菌多糖的大量多糖特异性抗体反应，并用于测量RPP文库的EC50。进行了8步、3倍系列稀释，并进行了4点logistic分析以计算EC50。RPP文库GG-Pnc比IVIG有效约100倍。

进行血清型多重ELISA以评估GG-Pnc RPP文库与IVIG相比的抗体多样性。通过ELISA测量了二十种肺炎链球菌血清型。使用肺炎链球菌特异性反应的国际标准，测量了GG-Pnc和IVIG(Gamunex)中的抗体特异性反应。GG-Pnc对除血清型6A外的所有血清型具有相似或高于IVIG的浓度。

进行血清型特异性调理吞噬测定以评估抗体诱导的杀伤功能。使用GG-Pnc和IVIG(Gamunex)通过调理吞噬反应测量了14种肺炎链球菌血清型。与多路复用ELISA一致，GG-Pnc对于除6A以外的所有血清型都与IVIG相似或更有效。

进行了血清型2特异性ELISA以确定GG-Pnc与该血清型结合的能力，因为其不包括在先前的分析中，但其是体内小鼠模型的一个可用选项。进行了8步、3倍系列稀释，并将4点logistic分析用于计算EC50；只有GG-Pnc具有价值，因为IVIG与血清型2的结合最小，即使在非常高的浓度下也是如此。

GG-Pnc RPP文库与一系列不同的肺炎链球菌血清型紧密结合，并且能够中和所有基于体外调理吞噬试验测试的血清型。GG-Pnc对于除一种血清型外的所有血清型(结合和杀伤)都类似于或比IVIG更有效，没有执行血清型特异性的富集程序并使用从接种疫苗的供体中分离的所有B细胞。GG-Pnc也与血清型2强结合。

10.1.4.实施例4：产生具有针对甲型流感抗原活性的RPP文库

使用本文所述的重组方法产生具有针对甲型流感抗原(RPPI)活性的RPP文库。

在上文表5(RPP1)中提供了RPP1的重链和轻链CDR3序列的SEQ ID NO。

10.1.5.实施例5：产生具有针对乙型肝炎病毒抗原(Engerix,GSK)活性的RPP文库

使用上文所述的重组方法产生具有针对乙型肝炎病毒抗原(RPP8和RPP9)活性的两个RPP文库。

在上文表5(RPP1)中提供了RPP9和RPP9的重链和轻链CDR3序列的SEQ ID NO。

11.通过引用并入

本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文件出于所有目的通过引用整体并入本文，就如同每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文件都被单独指明为针对所有目的以引用方式并入一样。

12.等同物

尽管已经说明和描述了各种特定实施方式，但上述说明书不是限制性的。应当理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下可以进行各种改变。在阅读本说明书后，本领域技术人员将意识到很多变化。