烟酰胺高效率转化为烟酸的菌种的方法
阅读说明：本技术 烟酰胺高效率转化为烟酸的菌种的方法 (Method for efficiently converting nicotinamide into nicotinic acid strains ) 是由 周媛 胡昊 齐勇 夏伟 李玉山 于 2021-08-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了烟酰胺高效率转化为烟酸的菌种的方法,包括如下步骤：S100：烟酰胺菌的筛选与鉴定；S200：生物催化反应条件探究；S300：催化反应条件确定及小试放大实验验证。筛选出可以将烟酰胺中的酰胺转化为羧酸的菌种,通过生物催化的方法,将烟酰胺转化为烟酸,告别了传统化学方法的高能耗和高污染,具有成本低、污染小、反应温和,适合工业化生产。(The invention discloses a method for efficiently converting nicotinamide into nicotinic acid strains, which comprises the following steps: s100: screening and identifying nicotinamide bacteria; s200: researching biocatalytic reaction conditions; s300: and (3) determining catalytic reaction conditions and verifying by a small-scale experiment. The strain capable of converting amide in nicotinamide into carboxylic acid is screened out, and nicotinamide is converted into nicotinic acid by a biocatalysis method, so that the method is distinguished from the high energy consumption and high pollution of the traditional chemical method, and has the advantages of low cost, small pollution, mild reaction and suitability for industrial production.)
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，特别涉及烟酰胺高效率转化为烟酸的菌种的方法。
背景技术
烟酸，又名尼古丁酸，是具有生物化学活性的全部吡啶-3-甲酸及其衍生物的总称。烟酸属于维生素B族，又称为维生素B3或维生素PP，是人体必需的13种维生素之一，目前被广泛应用于食品和饲料添加剂，此外烟酸也是一种重要的医药原料和化工中间体，有一定的经济价值。
在医学上，烟酸是生物有机体内氧化还原反应的重要参与者，主要以辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ形式作为脱氢酶的辅酶在生物氧化中起递氢体的作用，参与丙酮酸盐代谢、葡萄糖酵解、戊糖的生物合成和脂肪、氨基酸、蛋白质及嘌呤的代谢。烟酸在提高人体内锌和铁利用率中扮演着重要的角色。烟酸是人类抗糙皮病的重要因子。烟酸的许多酰类化合物还具有降低血脂的作用，增强细胞之间的新陈代谢作用，抑制胆固醇、血浆甘油三酯的形成，具有良好的防治心血管疾病效果。此外，烟酸的衍生物烟酰苯甲胺可作为高效的治疗血栓药物；烟酰羟甲胺可以作为保肝利胆抑菌的良药；烟酸对家禽的骨骼生长、抗应激反应、产蛋量及种蛋孵化率都有积极作用。是饲料中的重要添加剂。在染料工业中。烟酸可以合成多种活染料结合偶氮染料的中间体。烟酸还是PVC塑料和丙烯酰胺聚合的链转移剂的热稳定剂。总之，随着对烟酸及其衍生物在精细化工中的作用的不断深入研究，烟酸的应用日益广泛，重要性也逐渐为人们所认识。
目前的主要产品烟酰胺通过化学-酶级联技术生产，3-氰基吡啶的工业生产过程中会产生3-氰废水，其中含有烟酸、烟酰胺以及吡啶、苯等其他物质，部分工艺路线的浓缩液循环套用后，其中副产物烟酸含量超标，对于成品存在一定影响。同时该工段排放的废水中含有大量的烟酰胺及烟酸，因此解决生产过程副产物烟酸并将其回收利用将尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供烟酰胺高效率转化为烟酸的菌种的方法，筛选出可以将烟酰胺中的酰胺转化为羧酸的菌种，通过生物催化的方法，将烟酰胺转化为烟酸，告别了传统化学方法的高能耗和高污染，具有成本低、污染小、反应温和，适合工业化生产，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
烟酰胺高效率转化为烟酸的菌种的方法，包括如下步骤：
S100：烟酰胺菌的筛选与鉴定；
S200：生物催化反应条件探究；
S300：催化反应条件确定及小试放大实验验证。
进一步地，S100的步骤如下：
S101：取3-氰车间废水，经富集筛选后获得可以将烟酰胺转化为烟酸的菌种；
S102：按照无菌操作的要求，将己筛选出的优势菌种接种于加富培养基斜面上30℃培养3天后取出，菌种生长，有菌落长出，再次将长出菌落进行扩大培养30℃培养3天后观察，效果较好，置于4℃冰箱保存；
S103：平板活化：取保藏的烟酰胺菌于K+抗性的LB平板上稀释涂布，37℃恒温培养箱中培养16h；
S104：转种子液：取出平板，挑取50个单克隆菌落转接于50支K+抗性的LB单管中，于37℃摇床220rpm培养16h；
S105：转发酵液：将培养后的单管取出，分别吸取1.5ml菌液接种于50个K+抗性的摇瓶中，37℃摇床220rpm培养约1.5h，观察到培养后的菌液呈絮状时，取出，加入诱导剂IPTG，于18℃摇床中220rpm培养22h；
S106：测酶活：将发酵液取出，通过HPLC法测量每瓶中的烟酰胺酶活、同时测量OD600值，HPLC检测参数如下：色谱柱：Aglient C18(4.6mm*250mm,5ul)、流速0.8ml/min、柱温30℃、流动相A：水+庚烷磺酸钠+三乙胺+冰乙酸＝80mL+0.1g+0.02mL+0.1mL；流动相：90％流动相A+10％乙腈，底物溶液：100ul 70g/L烟酰胺溶液+690ul pH 7.0、0.05mol/l磷酸盐缓冲溶液；
S107：将底物溶液放置在控温30℃混匀振荡器上进行振荡，向其加入10ul处理后的发酵液，反应10min后加入200ul 0.5mol/L的硫酸溶液终止反应，将反应后的溶液放置在12000；rpm的离心机上离心3min；
S108：取离心后的反应液上清液稀释6倍上样；
S109：计算：计算与结果。
进一步地，S109的计算公式：
粗酶液酶活(U/mL)＝C×V×X/123.1/T/v
c—液相色谱得出的烟酸浓度，μg/mL；
V—反应体积，这里是800μL反应液+200μL硫酸试液；
X—反应进样前的稀释倍数(6)；
T—反应时间，10min；
v—所加粗酶液体积，10μL
123.1—烟酸分子量，g/moL；
发酵液酶活(U/mL)＝粗酶液酶活×发酵液稀释倍数(N)。
进一步地，S200的步骤如下：
S201：最适底物浓度：设置底物为10％、20％、30％、40％烟酰胺浓度梯度，在温度25℃、pH 7.55、酶添加量为4.8U/ml条件下反应，一定时间(10h)后统计底物与酶促反应速率之间的关系，确定最适底物浓度；
S202：最优酶量：设置酶用量为6.0U/ml、7.2U/ml、8.4U/ml、9.6U/ml、10.8U/ml浓度梯度，在底物浓度为20％烟酰胺、温度25℃、pH 7.55条件下反应，一定时间后统计酶用量与烟酰胺转化率之间的关系，确定最优酶量；
S203：最适温度：设置25℃、30℃、35℃、40℃、45℃温度梯度，在底物浓度为20％烟酰胺、pH7.55、酶添加量为8.4U/ml条件下反应，一定时间(6h)后统计温度与酶促反应速率之间的关系，确定最适温度；
S204：最适pH：设置pH为5.0-9.0，每隔1.0一个梯度，在底物浓度为20％烟酰胺、温度为36-38℃、酶添加量为8.4U/ml条件下反应，一定时间(6h)后统计pH与酶促反应速率之间的关系，确定最适pH。
进一步地，S300的步骤如下：
S301：确定烟酰胺催化反应小试(2L)实验方案：20％烟酰胺溶液，加入6.6U/ml的烟酰胺酶，在36-38℃条件下进行反应，全程pH控制在7.4±0.2左右，反应过程每隔半小时监测烟酰胺和烟酸含量变化；
S302：催化实验小试放大实验验证：20％烟酰胺溶液，加入6.6U/ml的烟酰胺酶，在36-38℃条件下进行反应，全程pH控制在7.4±0.2左右，反应过程反应过程每隔半小时监测烟酰胺和烟酸含量变化。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明所选用的技术方案，成本较低，操作方便，反应温和，污染小，具有一定的工业化使用潜力。
2.本发明所选用的技术方案筛选出蛋白表达较高的菌株，可作为工业生产中将烟酰胺转化为烟酸的催化剂，能够使烟酰胺的转化率达到99.99％以上，转化率较高，且性能稳定。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
烟酰胺高效率转化为烟酸的菌种的方法，包括如下步骤：
S100：烟酰胺菌的筛选与鉴定
S101：取3-氰车间废水，经富集筛选后获得可以将烟酰胺转化为烟酸的菌种；
S102：按照无菌操作的要求，将己筛选出的优势菌种接种于加富培养基斜面上30℃培养3天后取出，菌种生长，有菌落长出，再次将长出菌落进行扩大培养30℃培养3天后观察，效果较好，置于4℃冰箱保存；
S103：平板活化：取保藏的烟酰胺菌于K+抗性的LB平板上稀释涂布，37℃恒温培养箱中培养16h；
S104：转种子液：取出平板，挑取50个单克隆菌落转接于50支K+抗性的LB单管中，于37℃摇床220rpm培养16h；
S105：转发酵液：将培养后的单管取出，分别吸取1.5ml菌液接种于50个K+抗性的摇瓶中(每个摇瓶50ml LB液体培养基)，37℃摇床220rpm培养约1.5h，观察到培养后的菌液呈絮状时，取出，加入诱导剂IPTG(终浓度100uM)，于18℃摇床中220rpm培养22h；
S106：测酶活：将发酵液取出，通过HPLC法测量每瓶中的烟酰胺酶活、同时测量OD600值，HPLC检测参数如下：色谱柱：Aglient C18(4.6mm*250mm,5ul)、流速0.8ml/min、柱温30℃、流动相A：水+庚烷磺酸钠+三乙胺+冰乙酸＝80mL+0.1g+0.02mL+0.1mL；流动相：90％流动相A+10％乙腈，底物溶液：100ul 70g/L烟酰胺溶液+690ul pH 7.0、0.05mol/l磷酸盐缓冲溶液；
S107：将底物溶液放置在控温30℃混匀振荡器上进行振荡，向其加入10ul处理后的发酵液，反应10min后加入200ul 0.5mol/L的硫酸溶液终止反应，将反应后的溶液放置在12000；rpm的离心机上离心3min；
S108：取离心后的反应液上清液稀释6倍上样；
S109：计算：计算与结果。
S200：生物催化反应条件探究
S201：最适底物浓度：设置底物为10％、20％、30％、40％烟酰胺浓度梯度，在温度25℃、pH 7.55、酶添加量为4.8U/ml条件下反应，一定时间(10h)后统计底物与酶促反应速率之间的关系，确定最适底物浓度；
底物与酶促反应速率之间的关系
S202：最优酶量：设置酶用量为6.0U/ml、7.2U/ml、8.4U/ml、9.6U/ml、10.8U/ml浓度梯度，在底物浓度为20％烟酰胺、温度25℃、pH 7.55条件下反应，一定时间后统计酶用量与烟酰胺转化率之间的关系，确定最优酶量；
烟酰胺酶用量与转化率之间的关系
S203：最适温度：设置25℃、30℃、35℃、40℃、45℃温度梯度，在底物浓度为20％烟酰胺、pH7.55、酶添加量为8.4U/ml条件下反应，一定时间(6h)后统计温度与酶促反应速率之间的关系，确定最适温度；
反应温度与酶促反应速率之间的关系
S204：最适pH：设置pH为5.0-9.0，每隔1.0一个梯度，在底物浓度为20％烟酰胺、温度为36-38℃、酶添加量为8.4U/ml条件下反应，一定时间(6h)后统计pH与酶促反应速率之间的关系，确定最适pH。
反应pH与酶促反应速率之间的关系
细化催化反应pH与酶促反应速率之间的关系
S300：催化反应条件确定及小试放大实验验证。
S301：确定烟酰胺催化反应小试(2L)实验方案：20％烟酰胺溶液，加入6.6U/ml的烟酰胺酶，在36-38℃条件下进行反应，全程pH控制在7.4±0.2左右，反应过程每隔半小时监测烟酰胺和烟酸含量变化，反应在4h左右结束，烟酰胺转化率99.99％以上，烟酸含量在20％左右。
反应各阶段烟酰胺烟酸含量变化及转化率统计
S302：催化实验小试放大实验验证：20％烟酰胺溶液，加入6.6U/ml的烟酰胺酶，在36-38℃条件下进行反应，全程pH控制在7.4±0.2左右，反应过程反应过程每隔半小时监测烟酰胺和烟酸含量变化，反应在4h左右结束，烟酰胺转化率99.99％以上，烟酸含量在20％左右。
反应各阶段烟酰胺烟酸含量变化及转化率统计
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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