一种杏果胶多糖及其制备方法
阅读说明：本技术 一种杏果胶多糖及其制备方法 (Apricot pectin polysaccharide and preparation method thereof ) 是由 吴彩娥 孙文娟 索安迪 范龚健 李婷婷 李晓静 周丹丹 于 2021-07-08 设计创作，主要内容包括：一种杏果胶多糖及其制备方法,杏果和活性水按料液比1:(1-3)打浆得浆液,所述料液比为质量体积比,单位g/mL,浆液与黑曲霉发酵液混合酶解,酶解结束后离心浓缩2-4倍,加2-5倍体积无水乙醇醇沉,冷冻干燥12-24h,获得杏果胶多糖。本发明极大的简化了天然植物多糖的提取步骤,且利用能够从自然界分离提取的黑曲霉菌种,很大程度上降低了提取费用,提高了天然植物多糖的提取量和纯度,且避免使用乙醚、氯仿等有毒有害试剂,有利于天然水果多糖的大量应用。(A preparation method of apricot pectin polysaccharide comprises the steps of pulping apricot fruits and active water according to a material-liquid ratio of 1 (1-3) to obtain slurry, mixing the slurry and Aspergillus niger fermentation liquor for enzymolysis, after enzymolysis is finished, centrifugally concentrating by 2-4 times, adding 2-5 times of volume of absolute ethyl alcohol for alcohol precipitation, and freeze-drying for 12-24 hours to obtain the apricot pectin polysaccharide. The invention greatly simplifies the extraction steps of the natural plant polysaccharide, utilizes the aspergillus niger strains which can be separated and extracted from the nature, greatly reduces the extraction cost, improves the extraction amount and the purity of the natural plant polysaccharide, avoids using toxic and harmful reagents such as ether, chloroform and the like, and is beneficial to the mass application of the natural fruit polysaccharide.)
技术领域
本发明属于生物工程领域，是关于一种杏果胶多糖及其制备方法。
背景技术
杏，为蔷薇科植物(Armeniaca vulgaris Lam)。其味甘、酸、性平，微温，具有生津止渴，润肺定喘的功效。杏不仅具有一般水果的特点，在药用方面也有着较好的开发利用前景：杏适宜于降血脂、急慢性气管炎咳嗽、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌患者及其放疗、化疗后食用。国内外对杏的研究多集中于探讨杏仁中的苦杏仁甙的生物活性，对杏果肉中多糖的研究报道比较少，水果多糖一般具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抑菌、抗病毒、降血糖和降血脂等生物活性。
目前，常见的多糖的提取方式主要有热水浸提法、超声提取法和酶提取法等。不同的提取工艺有各自的优缺点，多糖的收率也差异较大。热水浸提法的耗时长且多糖提取率低；酶提取法虽然可以获得较高的多糖收率，但酶的成本高，限制了它的广泛应用；超声提取法是在热水浸提的基础上，增加超声浸提步骤，提取收率相对较高，因此具有相对的优势。果胶多糖因分子量大，难溶，导致发展受限。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种高纯度杏果胶多糖及其制备方法，该方法极大的简化了天然植物多糖的提取纯化步骤，提高了天然植物多糖的提取效率、纯度，同时也增加了果胶多糖的溶解性以及热稳定性。
技术方案：一种杏果胶多糖的制备方法，步骤为：杏果和活性水按料液比1:(1-3)打浆得浆液，所述料液比为质量体积比，单位g/mL，浆液与黑曲霉发酵液混合酶解，酶解结束后离心浓缩2-4倍，加2-5倍体积无水乙醇醇沉，冷冻干燥12-24h，获得杏果胶多糖。
上述活性水由以下方法制得：利用射流型大气低温等离子体表面处理机的射流放电模式，在室温，相对湿度＜93％，大气压力86-106Kpa，300-500w的功率下，处理500mL水20-120s。
优选的，上述发酵酶液的接入量为浆液质量的20％-40％，酶解温度为40-55℃，酶解时间为6-10h。
上述制备方法制得的杏果胶多糖。
上述制得的杏果胶多糖，在室温去离子水中溶解度比苹果果胶高50％以上，分解温度较苹果果胶不低于140℃。
有益效果：本发明提供的一种高纯度杏果胶多糖的制备方法，将天然植物与活性水融合，融合后的植物样品与含有细胞壁降解酶的产酶发酵培养基混合孵育过程中，细胞壁降解酶会水解植物细胞壁中富含的纤维素或木质素，从而破坏植物细胞壁，使位于细胞内的天然植物多糖快速溶出。在该方法中，所用活性水富含活性氧(ROS)、活性氮(RNS)等活性成分，并具有低pH、高氧化还原电位、高电导率等特殊理化性质；所使用的细胞壁降解酶是直接通过产酶菌发酵所得，细胞壁降解酶的活性好，催化效率高，从而有助于进一步提高天然植物多糖的提取效率。同时对大分子多糖进行降解修饰，把大分子果胶降解为聚合度更低的小分子果胶多糖，获得降血脂活性、降血糖活性、热稳定活性和纯度更高且更均一的果胶多糖。该提取方法极大的简化了天然植物多糖的提取步骤，且利用能够从自然界分离提取的黑曲霉菌种，很大程度上降低了提取费用，提高了天然植物多糖的提取量和纯度，且避免使用乙醚、氯仿等有毒有害试剂，有利于天然水果多糖的大量应用。
附图说明
图1为两种不同制备方式多糖电镜图比较，其中a水法提取，b微生物发酵提取；
图2为两种不同制备方式多糖热力学性质比较。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例及其说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
为了进一步提高杏果胶多糖的提取收率、纯度和活性，本发明采用活性水辅助微生物发酵法提高杏果胶多糖提取率和纯度，利用微生物发酵对氮源和碳源的消耗，提高纯度的同时，微生物对多糖的降解，增加了可溶性多糖的溶解；利用活性水对多糖的修饰提高多糖的活性。同时对大分子多糖进行降解修饰，把大分子降解为聚合度更低的小分子且均一多糖。
样品粗多糖的含量测定
1.测定方法：
a.总糖标准曲线的制作
准确吸取葡萄糖标准使用液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL置于25mL比色管中，补水至1mL，加入5wt.％苯酚溶液1mL，充分混匀，快速加入浓硫酸5mL，静置10min，使用漩涡振荡器混匀溶液，将试管放置于30℃水浴锅中反应20分钟，用分光光度计在490nm波长处测定吸光度。以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
所得标准曲线的方程式为：y＝5.3319x+0.0755，R2＝0.9967，符合标准曲线的要求。
b.样品总糖的测定
准确吸取待测多糖溶液1mL置于25mL比色管中。然后按a步骤的方法测定吸光度值。再根据标准曲线算出葡萄糖质量。
a.还原糖的测定
准确吸取1.00mg/mL的葡萄糖标准溶液0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL、1.20mL依次加入到25mL比色管中，补足蒸馏水至2mL，再分别加入1.5mL的3,5-二硝基水杨酸溶液，摇匀，分别置于沸水浴中煮沸5min显色。取出，立即冷却，加入蒸馏水稀释至刻度线。用0号管作为参比调零。在540波长下用分光光度计测量上述各溶液的吸光度。
以葡萄糖含量(微克数)为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，所得标准曲线的方程式为：y＝0.5918x+0.0283，R2＝0.9996，符合标准曲线的要求。
b.样品还原糖含量的测定
吸取上述待测多糖溶液2mL置于25mL比色管中，向其中加入1.5mL的3,5-二硝基水杨酸溶液，采用同样的方法，于最大吸收波长540nm处测定吸光度。利用标准曲线的线性方程可以求出样品中还原糖的含量。
样品多糖的含量
由于样品粗多糖中可能含有一定数量的还原糖，会干扰最后的结果，所以将样品粗多糖的质量减去其中还原糖含量，即为样品多糖的含量。
热水浸提法制备杏果胶多糖
杏果洗净去核后，用高压均质机将杏果与蒸馏水按照料液比(w/v，g/mL)1:1的比例混合匀成浆状物质，取约10g杏浆按照料液比(w/v，g/mL)1:10的比例与蒸馏水混合，80℃热水搅拌提取，提取时间4h。滤液用4000r/min离心15min后倒出上清液，定容到100mL。减压旋转蒸发浓缩，倒出，加入无水乙醇至乙醇质量分数为80％，静置过夜后倒去上层清液。下层沉淀用无水乙醇洗涤，挥干乙醇后复溶于水，利用大孔树脂进行脱色，脱色后的多糖冷冻干燥，得杏果胶多糖。
微生物发酵制备杏果胶多糖
a菌种的培育
取冷冻保藏于-80℃冰箱的甘油管菌种接种于PDA培养基，每个培养基吸取200μL的菌液均匀涂布在培养基上，培养7d。
b孢子液的制备
用灭菌的无菌水冲洗孢子进150mL锥形瓶中，并用无菌水调整浓度为1.55×107个/mL。
c发酵培养基的制备
称取10g未加活性水匀浆的杏浆加入50mL的蒸馏水于250mL锥形瓶中，黑曲霉孢子液按照6％的接种量接种于发酵培养基，培养基其他组成成分为磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁1.5g/L，CMC-Na 10g/L，蛋白胨0.5g/L，调节pH值到6.0，121℃，15min备用，在140rpm下孵育5天，获得发酵酶液。
实施例1微生物发酵法制备杏果胶多糖
杏浆制备：用低温等离子体射流放电模式，在350w的功率下，处理500mL体积的蒸馏水30s。按照料液比(w/v，g/mL)1:1的比例混合匀浆。
称取10g杏浆按照料液比(w/v，g/mL)1:10比例加入蒸馏水入锥形瓶，调节pH值6.0，将黑曲霉发酵酶液按照杏浆质量的20％的量加入，混匀后，于40℃、120rpm下孵育6h，得到酶解液。
提取多糖：将发酵液在90℃下灭酶10min，离心后，取上清液，定容到100mL。在45℃下用旋蒸仪浓缩至1/2的体积，用3倍体积无水乙醇醇沉，置于4℃下静置过夜，将所得沉淀经离心后，用无水的乙醇洗涤3次，挥干乙醇后复溶于水，利用大孔树脂进行静态吸附脱色，冷冻干燥12h后得到浅灰白色杏多糖。使用苯酚硫酸法测定定容体积液中杏多糖的总糖含量，使用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量。发酵法多糖糖含量(mg/g)＝(总糖-还原糖)/10g。经计算多糖提取率可以达到5.0％，纯度可以达到69.3％，溶解度为85.0％，α-糖苷酶抑制率70.8％，胆酸盐结合率为60.3％。
实施例2微生物发酵法制备杏果胶多糖
杏浆制备：用低温等离子体射流放电模式，在400w的功率下，处理500mL体积的蒸馏水60s。按照料液比(w/v，g/mL)1：2的比例混合匀浆。
称取10g杏浆按照料液比(w/v，g/mL)1:10比例加入蒸馏水入锥形瓶，调节pH值6.0，将黑曲霉发酵酶液以杏浆质量的30％的量加入，混匀后，于50℃、100rpm下孵育8h，得到酶解液。
提取多糖：将发酵液在90℃下灭酶10min，离心后，取上清液，定容到一定体积。在45℃下用旋蒸仪浓缩至1/3的体积，用4倍体积无水乙醇醇沉，置于4℃下静置过夜，将所得沉淀经离心后，用无水的乙醇洗涤3次，挥干乙醇后复溶于水，利用大孔树脂进行静态吸附脱色，挥干乙醇冷冻干燥18h后得到浅灰白色杏多糖。使用苯酚硫酸法测定定容体积液中杏多糖的总糖含量，使用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量。发酵法多糖糖含量(mg/g)＝(总糖-还原糖)/10g。经计算多糖提取率可以达到6.1％，纯度可以达到71.5％，溶解度为86.3％，α-糖苷酶抑制率65.6％，胆酸盐结合率为55.5％。。
实施例3微生物发酵法制备杏果胶多糖
杏浆制备：用低温等离子体射流放电模式，在450w的功率下，处理500mL体积的蒸馏水90s。按照料液比(w/v，g/mL)1：3的比例混合匀浆
称取10g杏浆按照料液比(w/v，g/mL)1:10比例加入蒸馏水入锥形瓶，调节pH值6.0，将黑曲霉发酵酶液按照杏浆质量的40％加入，混匀后，于55℃、100rpm下孵育10h，得到酶解液。
提取多糖：将发酵液在90℃下灭酶10min，离心后，取上清液，定容到一定体积。在45℃下用旋蒸仪浓缩至1/4的体积，用5倍体积无水乙醇醇沉，置于4℃下静置过夜，将所得沉淀经离心后，用无水的乙醇洗涤3次，挥干乙醇后复溶于水，利用大孔树脂进行静态吸附脱色，冷冻干燥24h后得到浅灰白色杏果胶多糖。使用苯酚硫酸法测定定容体积液中杏多糖的总糖含量，使用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量。发酵法多糖糖含量(mg/g)＝(总糖-还原糖)/10g。经计算多糖提取率可以达到5.2％，纯度可以达到64.6％，溶解度为90.5％，α-糖苷酶抑制率50.2％，胆酸盐结合率为92.6％。
表1两种不同制备方式各项指标比较
综上所述，采取微生物发酵法不仅使得杏果胶多糖的提取率变高，纯度较水法提高百分之25％以上，且电镜图片显示多糖结构更均一。同时，因杏多糖中主要以果胶为主，经过测定半乳糖醛酸的含量，在微生物发酵过程中对果胶进行了降解，增加了果胶多糖的溶解度。与苹果果胶相比，发酵法多糖在常温去离子水中易于溶解，而苹果果胶在室温去离子水中难溶，溶解度比苹果多糖高50％以上。对两种不同提取方式多糖进行降血糖活性和降血脂活性研究，发现都有不同程度的降血糖和降血脂活性。最后，对两种不同提取方式的多糖进行了热力学性质探究，微生物发酵法的得到的多糖在150℃附近左右开始进行分解，热水浸提法得到的多糖分解初始温度分别为140℃，在600℃的加热下，微生物发酵法、热水浸提法分别还有38％和31％的残余质量，且质量损失最多的阶段所对应的温度分别为248℃和215℃说明微生物发酵法得到的多糖具有很好的持水性和热稳定性，同时与苹果果胶相比，苹果果胶初始分解温度为90℃，质量损失最多的温度是230℃左右。综合对比苹果果胶，微生物发酵法得到的多糖具有作为耐热新型材料的潜能。
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