一种肝素钠的酶解工艺及精制工艺
阅读说明：本技术 一种肝素钠的酶解工艺及精制工艺 (Enzymolysis process and refining process of heparin sodium ) 是由 丛义国 纪红娟 岳鹏 李玲 于 2021-04-16 设计创作，主要内容包括：本发明具体涉及一种肝素钠的酶解工艺及精制工艺。酶解是粗品肝素钠精制过程中的重要步骤,酶解完成后的料液需要通过过滤获取精制肝素钠部分。现有复合酶解工艺中,多种酶之间会相互干扰导致酶解效率降低,并且酶解后反应液的粘度会明显上升,导致过滤工艺较大。本发明提供了一种酶解工艺,将蛋白酶依次加入反应体系中进行酶解以消除复合酶产品之间的干扰性,并且,采用该方式酶解后的料液粘度显著降低,可直接通过离子树脂分离,无需过滤的步骤,有效的简化了工艺的难度。(The invention particularly relates to an enzymolysis process and a refining process of heparin sodium. Enzymolysis is an important step in the refining process of crude heparin sodium, and the refined heparin sodium part needs to be obtained by filtering the feed liquid after enzymolysis is finished. In the existing composite enzymolysis process, the enzymolysis efficiency is reduced due to mutual interference among various enzymes, and the viscosity of reaction liquid after enzymolysis is obviously increased, so that the filtering process is larger. The invention provides an enzymolysis process, protease is sequentially added into a reaction system for enzymolysis so as to eliminate the interference among complex enzyme products, and the viscosity of the feed liquid subjected to enzymolysis is remarkably reduced, so that the feed liquid can be directly separated by ion resin without a filtering step, and the difficulty of the process is effectively simplified.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肝素钠的酶解工艺及精制工艺。
背景技术
公开该
背景技术
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。肝素钠是一种粘多糖硫酸基抗凝血药，在临床使用中广泛用于防治各种心脑血管疾病，一直是最有效的抗凝血药物，特别是对动静脉血栓、血塞具有独特疗效。肝素钠广泛存在于哺乳动物的肠粘膜、肺、肝中，特别是猪小肠粘膜中含量最高，并且从健康生猪小肠粘膜中提取出来的肝素与人体内的肝素分子结构基本一致。粗品中仍有一部分肝素钠与猪肠粘膜中的蛋白质结合而不能够体现出良好的药用价值。因此，在粗品精制的环节中，需要采用恰当的手段对粗品中结合状态的肝素钠与蛋白质成分进行分离。目前粗品肝素钠的常规生产主要以新鲜猪小肠粘膜为原料，通过清洗处理，酶解提取，树脂吸附、洗脱，醇沉和烘干得到肝素钠粗品，再通过盐解蛋白质工艺、酶解蛋白质工艺、去除硫酸皮肤素工艺、精制过滤工艺、沉淀提纯工艺等，对粗品肝素钠进行精制。
上述精制工艺中，酶解蛋白主要通过加入具有解离效果的酶使肝素钠与蛋白分离再对杂蛋白进行过滤去除。目前采用的酶包括单一酶及复合酶。发明人在生产过程中发现，酶解工艺中，蛋白质经过酶解后料液的粘度很大，致使过滤有一定的难度，并且复合酶解工艺中，两种酶会相互干扰导致酶解效率降低。上述因素导致酶解工艺生产难度大，并且影响精制肝素钠产品的效价，降低经济收益。
发明内容
针对上述研究背景，本发明目的在于改善酶解过程中复合酶效率低下的问题，简化生产工艺。为了实现该技术目的，本发明经过大量的实验研究发现，将两种蛋白酶顺序分次使用，可以解决复合酶间相互干扰致使效率低下的问题，而且经过二次酶解后的酶解液可以直接进入离子交换树脂进行吸附，省略了过滤工艺，解决了酶解后过滤困难的问题，工艺操作性得到很大提高。
基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案:
本发明第一方面，提供一种肝素钠的酶解工艺，所述酶解工艺包括依次采用胰酶及碱性蛋白酶对粗品肝素钠进行酶解。
针对现有技术中复合酶相互干扰的问题，本发明首先联想到将复合酶产品分别加入体系进行酶解，基于技术思路，本发明考察后发现，上述两种蛋白酶基于本发明的条件下能够不再互相干扰，发挥更高的酶解效率。并且酶解反应的进行次序对酶解收率也具有显著的影响，依照上述次序进行酶解后肝素钠收率效果较为理想。进一步的，本发明还发现上述酶解工艺获取的料液粘度明显的下降，可直接通过离子树脂进行后续纯化和精制的步骤，因此，本发明第二方面，提供一种肝素钠的精制工艺，所述精制工艺包括第一方面所述酶解工艺所记载的步骤。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
本发明利用二次酶解工艺过程，提升了酶解效率，有效的去除产品中的杂质蛋白质，同时使体系的流动性得到很大改善，省略了酶解后过滤的步骤。不仅可以大大提高终产品的澄清度，产品的收率及效价也获得了很大的提升。本发明的方法简单、操作方便、实用性强，适合工业化生产。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，精品肝素钠是由粗品肝素钠精制加工而成。和粗品肝素钠的提取精制类似，其生产工艺也都围绕着去除蛋白质等杂质而展开的。蛋白质等杂质不能够有效去除，肝素钠的效价就不能够很好地体现。所以,本发明意在提供一种高效的杂蛋白去除的精制工艺。
本发明第一方面，提供一种肝素钠的酶解工艺，所述酶解工艺包括依次采用胰酶及碱性蛋白酶对粗品肝素钠进行酶解。
上述技术方案中，能够在碱性条件下应用于肝素钠水解的酶均可满足本发明的生产需求，具体的实例比如2709蛋白酶。
优选的，所述粗品肝素钠配制成浓度为13～17％(w/v)的溶液；进一步的，所述肝素钠溶液中还具有盐。
采用恰当浓度的肝素钠溶液有助于提高酶解反应中酶与粗品肝素钠的反应效率，同时还有助于确保酶解结束后杂蛋白能够通过过滤的方式顺利被去除。经本发明探究证实，上述浓度范围的肝素钠能够实现高效酶解的效果，并且反应料液能够方便的被过滤。为了进一步提高酶解反应效率，所述粗品肝素钠中可以预先加入盐进行盐解，所述盐优选为食用盐，进一步节约成本，可采用肠衣盐。
具体的实施方式中，所述肠衣盐浓度为2～4％(w/v)。
优选的，所述酶解工艺包括以下步骤：调节粗品肝素钠溶液pH至8.5-9.0，加入胰酶控制反应温度49-52℃反应4～6h完成第一次酶解，升温去除杂蛋白；再次调节反应体系的pH至8.5-9.0，再加入碱性蛋白酶控制反应温度49-52℃反应4～6h完成第二次酶解，再次进行升温去除杂蛋白获得酶解液。
进一步的，所述酶解工艺的具体步骤如下：向肝素钠溶液中加入碱液调节pH，之后加入粗品肝素重量0.4～0.6％的胰酶或碱性蛋白酶进行酶解。
为了不引入杂质，所述碱液优选35～45％的氢氧化钠溶液。
进一步的，酶解完成后，首先加入酸液调节反应体系pH至pH6.5±0.5，通过蒸汽使反应体系温度快速上升至85-90℃，保温一段时间后冷却离心，获取液体部分。
为了酶解反应的充分进行，所述酶解过程还包括搅拌的步骤，所述搅拌的方式不限于通过机械或人工的方式进行，根据本发明研究，搅拌的频率对酶解反应的效率具有一定的影响，效果较好的技术方案中，所述搅拌方式如下：间隔18～22min搅拌一次，每次搅拌9～11min，转速60-70rpm.
在本发明一种具体的实施方式中，所述粗品肝素钠的酶解工艺如下：
(1)取粗品肝素钠10kg，按15％浓度(w/v)溶解，加入3％(w/v)肠衣盐，升温至49-52℃，搅拌至溶解；
(2)用40％的氢氧化钠溶液将(1)中溶液调pH8.5-9.0。然后加入粗品肝素重量0.5％胰酶，开始酶解；酶解过程中控制pH在8.5-9.0范围内，控制温度49-52℃，每间隔20min搅拌一次，每次搅拌10min，转速60-70rpm，酶解5h
(3)酶解完成后，用4mol/L的盐酸调pH6.5±0.5，夹层通蒸汽快速升温至85-90℃，保温20min，之后夹层通冷水10分钟内降温至50℃；离心：料液用管式离心机进行离心，转速约为12000转/min，收集料液；
(4)用40％的氢氧化钠溶液将(3)中收集的料液调pH8.5-9.0；然后加入粗品肝素重量0.5％，开始酶解；酶解过程中控制pH在8.5-9.0范围内，控制温度49-52℃，每间隔20min搅拌一次，每次搅拌10min，转速60-70rpm，酶解5h；
(5)酶解完成后，用4mol/L的盐酸调pH6.5±0.5，夹层通蒸汽快速升温至85-90℃，保温20min，之后夹层通冷水，约10分钟内降温至50℃。
本发明第二方面，提供一种肝素钠的精制工艺，所述精制工艺包括第一方面所述酶解工艺所记载的步骤。
优选的，所述精制工艺中，还包括对所述酶解液进行树脂洗脱分离的步骤。
进一步的，所述树脂为强阴离子树脂。
更进一步的，所述洗脱的具体步骤如下：调节上述酶解后料液的pH至8.5±0.5，控制所述料液温度为30～45℃，通过强阴离子树脂进行洗脱，所述洗脱液氯化钠溶液。
进一步优选的，所述精制工艺中，还包括对上述洗脱液进行氧化处理的步骤。
在上述优选技术方案的一些实施方式中，所述氧化处理步骤具体如下：向上述洗脱液中加入过氧化氢进行氧化；氧化完成后，料液经钛过滤器过滤，加入酸液调pH6.5±0.5，按1.5％加药用氯化钠，搅拌溶解，加入料液0.5～0.7倍体积的药用乙醇沉淀，搅拌30min，控制沉淀温度10±5℃，沉淀5～7h后获取沉淀部分即为肝素钠。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例中，提供一种肝素钠的精制工艺，所述精制工艺包括以粗品肝素钠为为了进行的酶解过程，所述酶解过程如下：
(1)粗品溶解：取粗品肝素钠10kg，按15％浓度(w/v)溶解，加入3％(w/v)肠衣盐，升温至49℃，搅拌至溶解。
(2)粗品一次酶解：用40％的氢氧化钠溶液将(1)中溶液调pH8.5。然后加入粗品肝素重量0.5％胰酶，开始酶解。酶解过程中控制pH在8.5-9.0范围内，控制温度49℃，每间隔约20min搅拌一次，每次搅拌10min，转速60-70rpm，酶解5h，每30min记录一次温度、pH。
(3)升温去杂蛋白：酶解完成后，用4mol/L的盐酸调pH6.5±0.5，夹层通蒸汽快速升温至85-90℃，保温20min，之后夹层通冷水，约10分钟内降温至50℃。离心：料液用管式离心机进行离心，转速约为12000转/min。收集料液。
(4)粗品二次酶解：用40％的氢氧化钠溶液将(3)中溶液调pH8.5。然后加入粗品肝素重量0.5％2709蛋白酶，开始酶解。酶解过程中控制pH在8.5-9.0范围内，控制温度49-52℃，每间隔约20min搅拌一次，每次搅拌10min，转速60-70rpm，酶解5h，每30min记录一次温度、pH。
(5)升温去杂蛋白：酶解完成后，用4mol/L的盐酸调pH6.5±0.5，夹层通蒸汽快速升温至85-90℃，保温20min，之后夹层通冷水，约10分钟内降温至50℃。所述肝素钠精制工艺中，酶解结束后还包括后续步骤：
(6)离子交换以及后续纯化
①用40％的氢氧化钠溶液调(5)中料液pH8.5±0.5，料液温度控制在30～45℃，将料液用强阴离子树脂吸附后经过洗涤、洗脱。
②将洗脱液浓缩用等倍体积的乙醇沉淀6-8h。上清液抽入废乙醇储罐，沉淀物用水溶解，浓度约为10％(w/v)。
③过氧化氢氧化料液进行氧化，：用40％的氢氧化钠溶液调节上述溶解的溶液pH9.5，调节温度28℃。向料液中加入1％(v/v)过氧化氢(原浓度为30％，加入前先按1:3稀释)，分三次加入(每隔30min加入1次，每次加入三分之一量)，1小时加完，间歇搅拌，从第一次加入开始共氧化3小时。
氧化完成后，料液经钛过滤器过滤，用4mol/L的盐酸溶液调pH6.5±0.5，按1.5％加药用氯化钠，搅拌溶解，加入料液0.6倍体积的药用乙醇沉淀，搅拌30min，控制沉淀温度10±5℃，沉淀6h。
④沉淀溶解过滤后，料液冻干成精品肝素钠。
实施例2
本实施例中，提供一种肝素钠的精制工艺，所述精制工艺包括以粗品肝素钠为为了进行的酶解过程，所述酶解过程如下：
(1)粗品溶解：取粗品肝素钠10kg，按14％浓度(w/v)溶解，加入2％(w/v)肠衣盐，升温至52℃，搅拌至溶解。
(2)粗品一次酶解：用40％的氢氧化钠溶液将(1)中溶液调pH8.5。然后加入粗品肝素重量0.4％胰酶，开始酶解。酶解过程中控制pH在8.5-9.0范围内，控制温度52℃，每间隔约18min搅拌一次，每次搅拌9min，转速60-70rpm，酶解4h，每30min记录一次温度、pH。
(3)升温去杂蛋白：酶解完成后，用4mol/L的盐酸调pH6.5±0.5，夹层通蒸汽快速升温至90℃，保温20min，之后夹层通冷水，约10分钟内降温至50℃。离心：料液用管式离心机进行离心，转速约为12000转/min。收集料液。
(4)粗品二次酶解：用40％的氢氧化钠溶液将(3)中溶液调pH8.5。然后加入粗品肝素重量0.4％2709蛋白酶，开始酶解。酶解过程中控制pH在8.5-9.0范围内，控制温度49℃，每间隔约18min搅拌一次，每次搅拌9min，转速60-70rpm，酶解5h，每30min记录一次温度、pH。
(5)升温去杂蛋白：酶解完成后，用4mol/L的盐酸调pH6.5±0.5，夹层通蒸汽快速升温至85-90℃，保温20min，之后夹层通冷水，约10分钟内降温至50℃。所述肝素钠精制工艺中，酶解结束后还包括后续步骤：
(6)离子交换以及后续纯化
①用40％的氢氧化钠溶液调(5)中料液pH8.5±0.5，料液温度控制在30～45℃，将料液用强阴离子树脂吸附后经过洗涤、洗脱。
②将洗脱液浓缩用等倍体积的乙醇沉淀6-8h。上清液抽入废乙醇储罐，沉淀物用水溶解，浓度约为10％(w/v)。
③过氧化氢氧化料液氧化：用40％的氢氧化钠溶液调节上述溶解的溶液pH9.5，调节温度28℃。向料液中加入1％(v/v)过氧化氢(原浓度为30％，加入前先按1:3稀释)，分三次加入(每隔30min加入1次，每次加入三分之一量)，1小时加完，间歇搅拌，从第一次加入开始共氧化3小时。氧化完成后，料液经钛过滤器过滤，用4mol/L的盐酸溶液调pH6.5±0.5，按1.5％加药用氯化钠，搅拌溶解，加入料液0.6倍体积的药用乙醇沉淀，搅拌30min，控制沉淀温度10±5℃，沉淀6h。
④沉淀溶解过滤后，料液冻干成精品肝素钠。
实施例3
本实施例中，提供一种肝素钠的精制工艺，所述精制工艺包括以粗品肝素钠为为了进行的酶解过程，所述酶解过程如下：
(1)粗品溶解：取粗品肝素钠10kg，按17％浓度(w/v)溶解，加入4％(w/v)肠衣盐，升温至49℃，搅拌至溶解。
(2)粗品一次酶解：用40％的氢氧化钠溶液将(1)中溶液调pH8.5。然后加入粗品肝素重量0.6％胰酶，开始酶解。酶解过程中控制pH在8.5-9.0范围内，控制温度49℃，每间隔约18min搅拌一次，每次搅拌11min，转速60-70rpm，酶解6h，每30min记录一次温度、pH。
(3)升温去杂蛋白：酶解完成后，用4mol/L的盐酸调pH6.5±0.5，夹层通蒸汽快速升温至90℃，保温20min，之后夹层通冷水，约10分钟内降温至50℃。离心：料液用管式离心机进行离心，转速约为12000转/min。收集料液。
(4)粗品二次酶解：用40％的氢氧化钠溶液将(3)中溶液调pH8.5。然后加入粗品肝素重量0.4％2709蛋白酶，开始酶解。酶解过程中控制pH在8.5-9.0范围内，控制温度52℃，每间隔约22min搅拌一次，每次搅拌11min，转速60-70rpm，酶解5h，每30min记录一次温度、pH。
(5)升温去杂蛋白：酶解完成后，用4mol/L的盐酸调pH6.5±0.5，夹层通蒸汽快速升温至85-90℃，保温20min，之后夹层通冷水，约10分钟内降温至50℃。所述肝素钠精制工艺中，酶解结束后还包括后续步骤：
(6)离子交换以及后续纯化
①用40％的氢氧化钠溶液调(5)中料液pH8.5±0.5，料液温度控制在30～45℃，将料液用强阴离子树脂吸附后经过洗涤、洗脱。
②将洗脱液浓缩用等倍体积的乙醇沉淀6-8h。上清液抽入废乙醇储罐，沉淀物用水溶解，浓度约为10％(w/v)。
③过氧化氢氧化料液氧化：用40％的氢氧化钠溶液调节上述溶解的溶液pH9.5，调节温度28℃。向料液中加入1％(v/v)过氧化氢(原浓度为30％，加入前先按1:3稀释)，分三次加入(每隔30min加入1次，每次加入三分之一量)，1小时加完，间歇搅拌，从第一次加入开始共氧化3小时氧化完成后，料液经钛过滤器过滤，用4mol/L的盐酸溶液调pH6.5±0.5，按1.5％加药用氯化钠，搅拌溶解，加入料液0.6倍体积的药用乙醇沉淀，搅拌30min，控制沉淀温度10±5℃，沉淀6h。
④沉淀溶解过滤后，料液冻干成精品肝素钠。
本发明针对实施例1-3中所述方法制备的多个批次的精制肝素钠产品进行了效价及纯度测定，测定结果如下表1所示：
表1
编号
效价(iu/mg)
效价收率(％)
光吸收260nm
光吸收280nm
1#
210
95
0.03
0.05
2#
208
94
0.05
0.02
3#
205
94
0.09
0.07
4#
206
96
0.08
0.07
5#
200
92
0.10
0.08
6#
212
93
0.04
0.05
7#
206
92
0.07
0.06
8#
209
95
0.06
0.08
对比例
本发明研究过程中针对酶解工艺所使用的酶及酶解次序也进行了考察，对比例1中将实施例1中所述酶解的次序进行调换，其余设置方式相同；对比例2和3中采用单一酶进行分段酶解，与实施例1的区别点主要在于依据酶的种类调节pH的方式有所不同，结果如下表2所示：
表2
从上述对比结果中可以看出，采用胰酶与2709蛋白酶进行组合酶解的实施方式中，制备得到的低分子肝素钠在效价、收率、纯度方面全面的优于对比例，并且采用该方式制备得到的低分子肝素钠粘度也显著降低，有利于纯化步骤的进行。上述结果表明，复合酶分段酶解的方式中，复合酶显著优于单一酶的效果，并且复合酶解次序对于酶解效果也具有重要的意义。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。