固相肽合成方法及装置
阅读说明：本技术 固相肽合成方法及装置 (Solid phase peptide synthesis method and device ) 是由 奥利弗·约翰内斯·克鲁泽 于 2020-02-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及进行固相肽合成的方法、自动并行的固相肽合成以及设计用于实施这种方法的装置。根据本发明,在进行固相肽合成的反应介质上的所述方法期间,频率超过25kHz的超声至少间歇地作用。(The present invention relates to a method for performing solid phase peptide synthesis, automated parallel solid phase peptide synthesis and apparatus designed for carrying out such method. According to the invention, ultrasound with a frequency exceeding 25kHz is applied at least intermittently during the process on a reaction medium for carrying out solid-phase peptide synthesis.)
技术领域
本发明涉及进行固相肽合成的方法、自动并行的固相肽合成以及适于实施这种方法的装置。
背景技术
固相肽合成(SPPS或也称为Merrifield合成)是由诺贝尔奖获得者Robert BruceMerrifield于1962年引入的一种肽合成方法，其中使用了不溶性聚合物载体。线性肽是通过逐步连接序列特异性的、临时保护的氨基酸来构建的，其中生长的多肽链的C端与合成树脂载体共价连接。为确保受控反应并避免副反应，氨基酸的反应性功能侧链必须由合适的保护基团封闭。虽然要连接的氨基酸的α-氨基只需要在实际的偶联反应期间受到保护，但永久性侧链保护基团仅在合成完成后才从肽中切割。与核糖体蛋白质生物合成相反，肽链的延伸从C端发生到N端。聚苯乙烯和1-2％的1,4-二乙烯基苯的共聚物已被证明是合适的聚合物载体。通过珠粒聚合获得的直径在20到100微米之间的树脂珠粒在用于合成的溶剂中溶胀，从而变得可渗透进试剂。叔丁氧羰基(Boc)和芴基-9-甲氧羰基(Fmoc)基团主要用作中间体α-氨基保护基团。Boc基团在催化氢化和碱水解方面是稳定的，并且可以通过温和的酸解(例如用50％三氟乙酸(TFA))分解。在各个偶联步骤后不断重复酸的解封闭反应会导致侧链保护基团的部分解封闭以及锚键与聚合物载体的轻微水解。Fmoc基团的优点是它可以通过用合适的碱(例如吗啉、2-氨基乙醇或哌啶)处理进行切割。如果将酸不稳定、耐碱基团用作聚合物载体上的锚定基团，并且为了保护相应氨基酸结构单元的第三功能，中间保护基团和永久保护基团可以有利地彼此独立地分开。
偶联反应(也称为缩合或肽增殖(peptide propagation)是合成中极其重要的步骤，因为完全转化是最终产品均匀性的基本要求。通常，试剂过量使用，优选酸酐、活性酯或所谓的原位活化剂，其中形成中间活化的酯衍生物。不断重复分解α-氨基保护基团和连接下一个Nα-保护氨基酸的反应步骤(偶联反应、缩合)使合成步骤和肽合成器的构建实现了广泛的自动化，其中大部分工作根据流通原理进行。树脂被放置在底部带有玻璃料的柱子中，以便试剂和溶剂可以自动加入，与载体材料混合，然后被提取出来。重复这些步骤直到达到要构建的肽的所需长度。最后，合成的肽与聚合物载体分离。从树脂基质上分离是通过试剂实现的，根据选择的保护基方案，选择性地切割C端氨基酸和载体之间的锚键，或同步引起合成肽的部分或完全解封。多种肽合成法是从固相肽合成发展而来的。[E.Athertonand R.C.Sheppard Solid-Phase Synthesis-A Practical Approach,Oxford UniversityPress,1989；H.-D.Jakubke Peptides:Chemistry and Biology,published by SpektrumAkademischer Verlag Heidelberg,1996]
自动化肽合成的一个主要挑战是避免交叉污染，因为在已知程序和自动化装置中，试剂通过相同的管道系统和套管。为了防止交叉污染，在已知的设备布置中，整个系统用大量冲洗剂冲洗。
DE 101 31 088 B4开创并提供了一种能够自动、同时、多重和并行合成的设备，其中可以排除交叉污染。这使得合成时间的显著减少。
在肽合成中缩短合成时间的另一种方法是在合成过程中将试剂暴露在微波辐射下。这使得可以将合成时间减少到十分之一。然而，微波辅助反应必须在特殊的保护空间中进行。因此，该方法仅限于较小的反应器，因此生产量较低。此外，已发现并非所有常用的保护基团对微波辐射都是稳定的，因此可能会出现收率降低和更多杂质。
1977年，CA 101 93 24发表了通过超声波辅助合成的尝试。然而，在接下来的几年中，很明显，这种方法，至少在所示出的形式中，并没有产生预期的结果。用通常的方法无法观察到合成时间的可再现加速。
现在本发明的目的是进一步加快固相肽合成的合成时间，同时保持或提高收率和纯度。该方法特别适用于自动化的并行方法。
发明内容
该目的通过一种用于进行自动平行固相肽合成的方法以及一种用于进行具有独立权利要求特征的所述方法的装置来实现。
因此，本发明的第一方面涉及进行固相肽合成(下文也称为合成或肽合成)的方法。根据本发明的方法包括如下步骤：
a)将在N端被保护基团保护的氨基酸通过氨基酸的C端结合到固体载体材料上，
b)切割保护基团，
c)进行至少一种肽增殖，以及
d)通过从载体材料上切割肽来终止反应，
其中步骤a)至d)发生在液体反应介质中，并且至少在各步骤中的一个期间，具有>25至2000kHz范围内的频率的超声至少间歇地作用于反应介质。
已经发现，超声波仅从超过40kHz频率对固相肽合成中所讨论的反应有加速作用。因此，根据本发明的方法能够可再现地减少固相肽合成的合成时间，从而使其至少在微波辅助肽合成中的合成时间范围内。然而，有利地，不必采取特殊的安全预防措施。此外，所需设备的采购和维护成本较低。这意味着该方法几乎可用于任何合成设备，尤其是并行和/或自动化合成设备。
步骤a)在本文被理解为是指将官能团直接或间接结合到合适的载体材料，例如用于固相肽合成的预加载或非预加载树脂或酰胺树脂。该官能团可以特别地通过Fmoc保护基团来保护。这里，预加载或未预加载是指至少一个第一和任选至少一个随后的氨基酸，即待合成的氨基酸序列中的一级氨基酸，已经直接结合到载体材料上的事实。
超过40kHz、优选超过50kHz、尤其超过75kHz、特别优选超过100kHz的频率已被证明是特别合适的，因为可以用更高的频率实现更显著的合成时间减少。已经发现，空化的形成对于肽合成有显著的积极影响，尤其是质量的提高。相关的空化从40kHz的频率开始，并随着频率的增加而增强。在20到40kHz的频率范围内，只发生振动激发。
优选地，根据本发明的方法的超声频率不超过2MHz，特别是1MHz。优选频率的进一步解释如下。
本文描述的超声辅助固相肽合成(USPS)属于化学合成中的声化学范畴。
超声波的化学效应不能是声场的直接效应，因为通常的频率太低，低了几个数量级，即使是简单的旋转运动也无法激发。
我们假定所述积极效果与由超声波触发的空化和由此产生的压力脉冲直接相关。空化发生在40kHz至2MHz的频率范围内。
假设了三种类型的声化学反应。
1.在由自由基或自由基离子中间体组成的均相系统中。在空化气泡中，极端压力和高温会产生例如在水相中的OH.和H.自由基，除了其他影响，这会导致气泡中形成H2O2。
2.在通过离子反应的非均相系统中。这些主要由溶剂中空化的机械效应辅助。在固体颗粒上形成不对称气泡。颗粒上不对称气泡的破裂会产生射向单侧破裂气泡的液体射流。这有助于将溶剂和溶解物质吸收到多孔材料中。另一方面，在其他液相中，发生各相的混合。
3.在非均相系统中，也可以发生自由基反应。与离子途径相比，自由基途径可能产生不同的产物，例如在Kornblum-Russell反应中。
空化气泡更有可能在较低频率范围内形成，然后也会变得更大且不对称。这导致更强但更不均匀的混合。另一方面，在更高的频率下，会产生更多的较小的、对称的气泡，并且在空化气泡和环境之间有更多的自由基交换。
空化是“液体中气泡的形成、生长和内爆破裂。空化坍塌会导致局部高温(～5000K)、高压(～1000atm)、巨大的加热和冷却速度(>109K/s)”和液体射流(～400km/h)。空化气泡是真空气泡(Suslick 1998)。真空由快速移动的表面和惰性液体产生。由此产生的压力差克服了液体内的内聚力和粘附力。
从110kHz和更高的频率，特别是从125kHz，优选在130kHz和更高的频率，可以观察到加速的反应过程和相关的缩短的反应时间以及收率的提高。已经发现，与标准系统相比，没有必要使用40倍过量的氨基酸，使用4倍过量已经可以获得相同的结果。这又导致反应物的数量显著减少，从而显著节省成本。此外，在110至500kHz的频率范围内没有观察到外消旋化，这得到了高收率。
在根据本发明方法的一个优选实施方案中，提供了超声波通过外部液体浴被传输到反应介质。这与将超声波直接或专门通过固体传输装置传输到反应介质的装置明显不同。已经发现，通过至少一种液体介质的传输提供了更加一致、可重复和温和的合成结果。与例如使用浸入反应介质中的探针的合成时间相比，当使用包含液体的传输介质时，必要的合成时间显示出更低的分散性。此外，测试设备比使用探针时要简单得多。探针的浸入将不可避免地导致探针的污染并且需要定期清洁探针，这将等于或至少显著减少合成时间的增益。
转化为空化的能量取决于几个因素，这些因素表明从空化产生设备转移到液体的运动。加速度的强度是影响能量有效转化为空化的最重要因素之一。更高的加速度产生更高的压差。这增加了在液体中产生真空气泡而不是波浪的可能性。这意味着加速度越高，转化为空化的能量比例就越高。在(超)声换能器的情况下，加速度的强度由振动的幅度决定。除了超声波的强度之外，液体被采用以下方式加速也很重要，即湍流、摩擦和波产生的损失尽可能低。单边运动方向的路径最适合于该种情况。
因此，传输介质的选择对肽合成的效果至关重要。除了状态的选择，传输介质的物质也必须进行优化。除了水作为传输介质之外，有机溶剂，特别是低级和中级醇，例如乙醇、丙醇和丁醇，也优选用作传输介质。
选择不同的传输介质进行组合也是有利的。测试设备应理解为浴中浴。换言之，反应在布置在(反应)容器中的反应介质中发生。该反应容器又被布置在具有第一传输介质的容器中，该第一传输介质又被布置在另外的传输介质中。超声波因此通过另外的传输介质被传输到第一传输介质并且从那里被传输到反应介质。
特别有利的是，第一传输介质由低级和中级醇构成，特别是前述类型的，和/或所述另外的传输介质由水构成。
使用高超声波频率，液体浴中的温度会按预期升高。然而，在高达500kHz的频率下，这种影响可以得到很好的控制，因为可以通过冷却装置轻松补偿出现的温度升高，例如借助连续冷却器(低温恒温器)冷却水浴或Peltier元件，因此这里也可能发生的外消旋化不会减少收率。
当使用明显高于500kHz至1000kHz或更高的频率时，很明显，出于质量保证的目的，抵消温度升高是有意义的，例如通过冷却浴槽。
超声波浴优选进行温度控制，更具体地控制在20至100℃，优选20至70℃，特别优选40至50℃的温度范围内。
在本发明的另一个优选实施方案中，提供了氨基酸在N-末端受到碱不稳定基团，特别是可以通过仲胺切割的临时(初级)保护基团，特别是芴甲氧羰基(Fmoc)的保护。与boc方法中使用的保护基团相比，这些保护基团被证明在根据本发明的频率下对超声波特别稳定，从而可以实现特别高的收率和高纯度。去保护优选使用合适的碱进行，如前文所述或在测试结果中描述的。优选地，使用在DMF(二甲基甲酰胺)中的20％哌啶。
到目前为止，超声辅助肽合成的优势仅在BocOC合成中得到证实。甚至已经发现超声辅助不适用于基于Fmoc的合成，因为所用的树脂在超声下粉碎。由于所使用的反应介质和侧链保护基团不同，因此假设只有与树脂的偶联才能通过超声波辅助。然而，令人惊讶的是，在使用本发明方法在所述频率范围内的各个合成步骤期间，通过超声辅助进行的基于Fmoc的肽合成也可以显示出在反应时间和收率方面的优势。
通过根据本发明方法合成的肽的反应性侧链优选也被(二级)保护基团保护。根据要保护的官能团，酸稳定的保护基团，特别是选自由S-2,4,6-三甲氧基苄基(Tmob)、三苯甲基(Trt)、叔丁基(tBu)、叔丁氧羰基(Boc)、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)组成的组的基团已被证明在根据本发明的肽合成中利用在提到的频率范围内的超声而特别稳定。
参考根据本发明的方法，例如，选自以下组中的Fmoc氨基酸特别适合于肽增殖，其中所述氨基酸以单字母代码或三字母代码列出：Fmoc-A-OH、Fmoc-C(Trt)-OH、Fmoc-D(OtBu)-OH、Fmoc-E(OtBu)-OH、Fmoc-F-OH、Fmoc-G-OH、Fmoc-H(Trt)-OH、Fmoc-I-OH、Fmoc-K(Boc)-OH、Fmoc-L-OH、Fmoc-M-OH、Fmoc-N(Trt)-OH、Fmoc-P-OH、Fmoc-Q-Trt–OH、Fmoc-R-Pbf–OH、Fmoc-S-tBu–OH、Fmoc-T-tBu–OH、Fmoc-V-OH、Fmoc-W(Boc)-OH、Fmoc-Y-(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Tmob)-OH、Fmoc-Asn(Tmob)-OH。这指的是氨基酸的L型和D型。
此外，还可以使用特殊的侧链保护的翻译后修饰氨基酸，比如：
对于Ser/Thr的磷酸化：
Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)、Fmoc-Thr(PO(OBzl)OH)、Fmoc-Tyr(PO(OMe)2)、Fmoc-Tyr(PO(OBzl)OH)、Fmoc-Tyr(PO(OBzl)2)-OH、Fmoc-Tyr(PO3H2)-OH、Fmoc-Tyr(PO(NMe2)2)、Fmoc-Tyr(PO(NMe2)2)、Fmoc-Ppa(Bzl)-OH、Fmoc-Pmp-OH、Fmoc-F2Pmp-OH,
对于Tyr的硫酸化：
Fmoc-Tyr(SO3nP)-OH、Fmoc-Tyr(SO3DCV)-OH,
对于Arg的甲基化：
Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OH、Fmoc-ADMA(Pbf)-OH、Fmoc-SDMA(Boc2)-ONa,
对于Lys的甲基化：
Fmoc-Lys(Me,Boc)-OH、Fmoc-Lys(Me2)-OH、Fmoc-Lys(Me3Cl)-OH，
对于瓜氨酸化：
Fmoc-瓜氨酸-OH(Fmoc-citrulline-OH)，
对于Asn的糖基化：
Fmoc-Asn(β-DGlcNAc(Ac)3)-OH、Fmoc-Asn(β-DGlcNAc(Ac)3-(1-4)-β-DGlcNAc(Ac)2)-OH，
对于Ser/Thr的糖基化：
Fmoc-Ser/Thr(α-DGlnNAc(Ac)3)-OH、Fmoc-Ser/Thr(β-DGal(Ac)4-(1-3)α-DGlnNAc(Ac)2)-OH、Fmoc-Ser/Thr(sialylOMe(Ac)4-(1-6)-α-D-GlnNAc(Ac)2)-OH、Fmoc-Ser/Thr(sialylOMe(Ac)4-(1-3)-β-D-Gal(Ac)3-(1-3)α-DGlnNAc(Ac)2)-OH。
同样，可以使用为合成复杂肽序列而开发的合成构建块，例如FmocPseudoProline(Fmoc假脯氨酸)二肽，所谓的Dmb构建块：例如Fmoc-(Dmb)Gly-OH，或二肽FmocXaaDmbGly，Hmb构建块：FmocHmbXaa，以及Hmsb构建块、Hnb构建块、Mmsb构建块，非天然氨基酸，比如：
萘丙氨酸、Fmoc-L-2Nal-OH
鸟氨酸、Fmoc-L-Orn(Aloc)-OH以及甲基化变体
聚乙二醇、Fmoc-O1Pen-OH、Fmoc-AEEP、Fmoc-TTDS-OH和所有其他受Fmoc保护的氨基聚乙二醇酸。
特别衍生的氨基酸，比如：
Fmoc-Lys(生物素)-OH、FMOC-Lys(Cy5)-OH。
一般而言，所有具有临时保护的胺官能团(优选Fmoc保护的)和可转化为活性酯或胺反应性基团的羧酸官能团的构建块均可用于USPS。
有利地，超声波仅在一个步骤中作用于反应介质，特别是在步骤c)中。替代地或另外地，超声在至少一个另外的步骤中，优选在步骤a)、b)和/或步骤d)中，作用于反应介质。在提到的每个步骤中都可以观察到根据本发明的超声的反应加速特性。
在这里特别优选的是，在各个步骤之间或在各个步骤中不中断超声波的作用，因为中断会导致收率降低。
迄今为止，当在整个合成过程中，即也在洗涤、脱保护、缩合和偶联过程中对反应介质施加超声波时，能实现最大的合成时间减少以及高收率。相比之下，超声波在作为准备步骤的预溶胀期间或在最终洗涤期间不一定有利。
固相肽合成包括几个可以相互区分的洗涤步骤。各个类型的洗涤步骤可以通过它们各自的上游反应来区分。因此，可以提及的是在第一个氨基酸与树脂偶联之后的至少一次洗涤(初始洗涤)、在步骤b)保护基团的去偶联(以下称为步骤Wb)之后的洗涤、在氨基酸偶联用于延伸肽链(以下为步骤Wc)之后的洗涤，以及在步骤d)将终肽的最后一个临时保护基团从载体材料上切割(以下为步骤Wd)之后的最终洗涤。
在各个洗涤步骤期间，超声波也优选对反应有影响并且使得必要的清洗剂和清洗时间的显著减少。因此，仅使用一个利用超声波的清洗步骤的洗涤已经达到与标准合成中通常冲洗四次相同的结果。洗涤步骤Wc，即在步骤c)之后的洗涤，对于提高收率和质量特别重要。研究表明，甚至可以完全省去洗涤步骤Wb。然而，优选地，所有洗涤步骤都在根据本发明的方法中实施。
优选地，特别是对于该洗涤步骤，超声波频率在100至500kHz的范围内，优选在100至200kHz的范围内，特别是在120至140kHz的范围内。在这些范围内，洗涤或清洗所需的溶剂量，例如DMF，在洗涤步骤的单独清洗循环中，可以以这样的方式减少，使得每个洗涤步骤Wb仅需要一个单独的清洗步骤。
特别有利的是，在肽合成a)至d)的所有步骤期间，包括洗涤步骤Wb、Wc和Wd期间，超声波在前文所述频率范围内作用于反应介质，特别是不会完全中断。
已经发现，根据要合成的肽，不同的频率对于各个步骤a)到d)是最佳的，特别是对于步骤Wb、c和d，就提高质量和减少反应时间而言，即它们显示出更有益的效果。因此，优选地，超声波在各个步骤中以不同频率作用于反应介质。特别地，优选地，各步骤之间的频率发生改变和/或具有不同频率的超声波相互叠加。
载体材料是肽合成技术领域技术人员基本上已知的材料。这些是人造树脂/合成树脂，其中来自以下组的树脂特别有利：
Knorr Amid树脂LS 1％DVB、王氏树脂、氯三苯甲基树脂、PRG树脂、Tentagel树脂、Chemmatrix树脂。
通常用于固相合成的预加载或非预加载和/或功能化树脂。
非顺磁性的合成树脂是首选，因为通过磁性分离合成的肽比通过过滤的方式分离要复杂得多，并且已经表明顺磁性树脂在低频(高达40kHz)的超声波中会被压碎形成非常细小的颗粒并在此过程中堵塞过滤材料。
在本发明的上下文中，优选使用的溶剂是DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、NMP(N-甲基-2-吡咯烷酮)或DMA(N,N-二甲基乙酰胺)。
用于催化缩合反应的碱优选为在DMF或另一种溶剂中的NMP、4-甲基吗啉或DIPEA、二异丙基乙胺。
用于切割临时Fmoc保护基团的溶液优选为在DMF中的20％哌啶。其他切割方法是本领域技术人员原则上已知的。
优选地，所用的偶联剂为HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)、HCTU(2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸盐)、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷鏻六氟磷酸盐)、DCC、二环己基碳二亚胺；DIC，二异丙基碳二亚胺；或EDC，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺。
将所有氨基酸/试剂溶解在所用的溶剂中，从而得到反应介质(reactionmedium)/反应物介质(reactant medium)/试剂溶液。当在方法和装置的上下文中提及试剂时，这也被理解为包括试剂的溶液。
所用氨基酸的浓度始终取决于合成规模及其在所用溶剂(如DMF、NMP或DMA)中的溶解度。
为了获得良好的合成结果，待偶联的氨基酸(AA)和用于形成活性酯的试剂(活化剂)优选各自至少与合成规模等摩尔地使用。然而，通常以等摩尔量一起使用AA和活化剂并且使用它们都超过合成规模。过量的范围为从4倍到100倍。为了获得与现有技术固相肽合成的本发明方法相当的质量，需要至少40倍过量，这取决于肽序列。原因是反应物的高度过量有利于产物的形成，即延长的肽链。此处氨基酸的浓度主要取决于被保护的AA在所用溶剂中的溶解度，优选在0.2M-0.6M之间。
在本申请中描述的实验中，氨基酸的使用浓度为0.4M。
同样，有利的是，在连续的(超声辅助)步骤a)-d)之间永远不会完全中断超声，而仅改变频率。有利地，设想该方法半自动/自动和/或并行地执行。在并行自动化方法与根据本发明的超声辅助的组合中，有可能能以使具有新抗原的特定形式癌症治疗可惠及大量患者的规模和生产能力生产单独的肽，即针对特定个体定制的肽。新抗原是肿瘤细胞蛋白质的突变诱导变化。它们可以通过下一代测序(NGS)技术进行识别。通常，不同新抗原的数量在100到200之间。相应数量的合成肽可以在体外模拟这些新抗原，并用于患者的肿瘤特异性免疫。每个患者的新抗原的数量、组成和氨基酸序列都是个体化的。因此，相应肽的复制也必须因人而异，换句话说即个性化。为了使这种有前途的疗法在医学上完全可用，必须能够在合理的时间内在相同条件下对大量患者进行研究。这就要求在极短的时间内提供大量的个性化抗原。因此，所描述的个性化癌症治疗形式对肽合成的速度、并行性和质量提出了很高的要求。根据本发明的方法可以满足这些要求。
根据本发明的方法特别适用于大规模应用。术语“大规模应用”是指1升至50升的规模，尤其是100至500升的批量大小。
因此，本发明的另一方面是自动并行的固相肽合成，包括在所述实施方案之一中的根据本发明的方法。
根据本发明的方法在室温下或在适度的温度升高下能以特别有利的方式进行。特别优选20至100℃范围内的反应温度，优选20至70℃的范围内，特别是40至60℃的范围内。温度控制优选至少在步骤a)、b)和/或d)中进行。
已经发现，根据本发明的方法尤其适用于利拉鲁肽(Litraglutid)和司美格鲁肽(Semaglutid)的大规模生产，特别是超过100g产品的规模。
本发明的另一方面涉及一种用于进行固相肽合成的装置，该装置被设计为在所描述的实施方案之一中实施根据本发明的方法。为此，根据本发明的装置包括超声换能器，该超声换能器优选地将频率为25kHz至2MHz的超声波，特别是在40kHz至1MHz的范围内的超声波，优选在100至500kHz的范围内的超声波经由液体传输介质传输到反应介质。
该装置优选具有用于接收一个或多个合成容器的装置，该合成容器具有至少一个用于填充反应物介质的开口，特别是具有96、384、1536或3456个反应室的微量滴定板形式的合成板，一合成圆筒或合成烧瓶或合成反应器，以及包含传输液体的超声波浴，其中所述合成容器可以布置在超声波浴中，放置方式为使得合成容器被超声波浴的传输液体润湿至最小高度。
有利地，最小高度应理解为确保超声波从超声波装置的超声换能器传输到反应介质的高度，其方式为使得声音(Schall)几乎仅通过液体传输介质发生。为此，合成容器外表面上的传输介质表面的高度对应于合成容器中反应介质的弯液面(Meniskus)高度的至少一半，优选地为在从一半高度到全高的范围内的高度，优选为四分之三到全高的高度。
合成容器优选设计为合成板，例如微量滴定板，特别是平行和并列的合成圆筒，例如以烧杯或注射器的形式，或设计为合成烧瓶，例如圆底烧瓶或一个反应器(例如根据或Syringe)。特别是，将合成容器设计为圆底烧瓶或反应器更适合用于大规模半自动/自动固相肽合成，因为烧瓶中1-50升或反应器中100-500升的规模可以处理。
另一方面，微量滴定板或平行合成圆筒的使用特别优选用于并行、自动的固相肽合成，而上述提到的更常用于单独的肽的大规模应用，例如利拉鲁肽和司美格鲁肽。本发明提出一种装置，该装置完全无需稀释剂和用于合成构建块的供应和定量(dosierte)输送的管道系统。为各个合成构建块提供单独的合成笔(Synthesestifte)，合成笔放置在用于合成的合成装置的支架中并由装置的夹臂从该支架上抓握和拾取，以将定量剂量的构建块输送到位于合成容器(特别是合成板)的反应室中的支撑材料上。
试剂容器和定量装置因此形成一个独立的单元。这消除了以往在改变合成构建块和试剂分布时需要的所有清洗过程和相关的缺点。
一区域被限定用于并行合成(图2)。工作区域的尺寸设计成使得由夹臂移动的合成笔可以到达工作区域的每个点。优选地，在该工作区域上特别是对称地布置多达10个合成站。合成站的尺寸优选基于标准微量滴定板。合成站可以是模块化设计并且可以包括具有用于提取溶剂的连接的基础部件和用于保持合成板的暴露的框架。根据所用合成板的细分，在一个合成板中可以并行进行例如6、12、24、48、96、384、1536或3456个单独的合成。对于较大的合成规模，可以在特殊容器中使用合成圆筒或注射器体。
根据本发明的进一步特征，合成板的反应室在开口侧用可渗透材料例如用玻璃料封闭。用于接收切割反应后溶解的肽的样品板可以布置在框架下方。使用所提出的固相合成装置，可以在没有人工干预的情况下进行合成和从载体材料、合成树脂中切割所获得的化合物。
样品板配备有单独的保持室，其布置和设计与合成板中反应室的网格相对应。以这种方式，确保了特定化合物在从载体材料或合成树脂上切割后的无错误且容易的分配。因此很容易将反应产物直接转移到高通量筛选管道。
合成笔(图3和图4)具有可通过螺旋盖封闭的空心圆柱形主体(试剂容器)和适配于反应室的自由开口在底端的吸嘴，同时配有出口开口。所述出口开口由带有截止阀的阀针关闭，所述截止阀由主体中的活塞杆和活塞引导并通过作用在活塞上的压缩弹簧可释放地固定在其关闭位置。活塞下方的气缸空间用于容纳单个合成构建块和惰性气体，通过简单地将吸嘴放置在覆盖反应室开口侧的可渗透材料上，即可实现试剂的定量输送。同时，通过压入阀针，截止阀从阀座上释放，出口开口被释放。分配的试剂量由吸嘴放置在可渗透材料上的时间长度决定。当吸嘴被提起时，出口开口会自动再次关闭。
在合成笔的进一步设计中(图6)，试剂容器的螺旋盖被带有卡口盖的可移动盖子所取代。活塞杆优选设置在盖子的中心，特别是压入的活塞杆，穿过整个合成笔进入定量筒。定量筒在底部关闭，例如使用止回阀。通过按下盖子，借助活塞分配规定量的试剂。安装在合成笔中的复位装置，例如弹簧，使活塞复位。同时或这之后，定量筒再次被填充。在脚侧吸嘴中的合适的执行器(例如止回阀)可确保只能通过主动输送来分配溶液。合成笔的这种设计允许无接触分配到反应室中。带有封闭试剂容器的合成笔的封闭设计确保了高度的试剂稳定性。
有利地，根据本发明的装置的超声波浴可以降低或升高。这使得反应容器能够在超声波浴中下降，优选分几步或连续下降到预定高度。
此外，超声波浴可用于不同的测试装置，尤其是不同的合成容器。
超声波浴还有利地是温度可控的，特别是设计成实现20至100℃的受控温度范围，优选20至70℃的范围，特别是40至60℃的范围。特别地，该装置具有用于降低所述浴的温度(例如作为通过高超声频率加热的结果)的冷却系统。这在使用从500kHz起，尤其是从1000kHz起的频率时特别有利。
此外，根据本发明的装置的超声波浴或其超声波发生器被设计成能产生可变频率，特别是至少一种在低频范围内(40-75kHz)和一种在高频范围内(100到2000kHz，优选100到500kHz)并将它们传输到液体浴中。为此目的，如果不同的频率可以彼此交替地或附加地切换，则是有利的。
在一个优选的实施方案中，超声波浴，或者说超声波浴的超声波发生器，配备有在40到100W范围内，特别是在50到70W标称功率范围内的必要功率，可以实现峰值在100到300W的范围，优选地在170到280W的范围内，对于大规模应用，峰值在250到700W的范围内，特别是在500到600W的范围内。
通过为每个合成构建块使用单独的合成笔并在开口侧覆盖合成板中的反应室，污染风险显著降低，交叉污染几乎被消除。如经常发生在不充分的冲洗过程中的合成构建块的残留不再可能。
由于省略了冲洗过程，不仅有机溶剂的消耗量大大减少，而且合成速度也加快了许多倍。
所描述的实施例可以有利地相互组合，除非在个别情况下另有说明。本发明的实施例在其他方面同样适用于所述方法和设备。
附图说明
在下文中，将通过仅用于说明目的的实际实施例和结果更详细地解释本发明。附图中示出了：
图1是根据本发明的用于合成肽的装置的示意图；
图2是图1装置的工作区域的平面图；
图3是本发明优选实施例中用于单独进料、定量和试剂储存的合成笔的示意图；
图4是图3的合成笔的纵向剖面图；
图5是通过具有根据本发明形成的反应室的合成板的图2的AA截面图；
图6是本发明另一优选实施例中合成笔的纵向截面示意图；
图7是根据本发明优选实施例的固相肽合成方法的顺序的示意图；
图8是基于合成内吗啡肽的本发明方法的色氨酸稳定性的图示；
图9是使用根据本发明的方法的酰基载体蛋白质(ACP)的稳定性的图示；
图10是使用现有技术对比方法的酰基载体蛋白质(ACP)的稳定性的图示；
图11是考虑到合成策略的ACP肽的平均合成质量的比较图；
图12是根据图11的合成质量的图示；
图13是对不同溶液持续时间的氨基酸进行储备溶液测试的图示；
图14是单偶联和双偶联的比较图；
图15是单偶联和双偶联以及氨基酸过量的比较图；以及
图16是使用不同超声频率的肽的平均合成质量的对比图。
具体实施方式
图1中示意性示出的合成装置1基于实验室移液机器人并且具有可以在x、y和z轴上移动的夹臂2。在工作区域3中存在合成容器，特别是合成板5，其关于反应室9的网格和布置源自本身已知的微量滴定板并且具有反应室9的6、12、24、48、96、384、1536或3456个网格，由此实现合成的高度并行化。合成板5放置在阀块6上并且在底侧具有多孔材料的膜28，用于通过连接到抽吸泵的阀块6将用过的试剂和冲洗液从反应室9吸出并进入废物中。
合成板5与阀块6和样品板27一起布置在超声波浴50中，特别是高度可调节并且能够以可控方式打开和关闭的超声波浴。超声波浴50具有带有液体传输介质的容器，合成容器5布置在该容器中。根据超声波浴50的位置，反应介质的合成容器5的弯液面至少高达超声波浴50的超声波传输介质的填充水平的一半，优选至少高达超声波浴50的超声波传输介质的填充水平的四分之三，特别是完全低于超声波浴50的超声波传输介质的填充水平。超声波浴50被设计成通过传输介质传输频率在至少25kHz至2MHz范围内的超声波。
合成装置1还配备有一个或多个冲洗梳8，其通过清洗剂供应管线10连接到相应的冲洗剂储存器。为了冲洗位于反应室9中的已经偶联了构建块的样品，在反应时间已经过去并且用过的反应溶液已经被排出之后，挑选具有所需冲洗剂的冲洗梳8由夹臂2向上移动并在合成板5的反应室9上方移动，以定量输送冲洗液。冲洗后，另一个冲洗梳8用于提供切割偶联合成构建块的临时保护基团所需的溶液，如上文所述。在经过一段培养时间后，在抽吸泵7的帮助下通过阀块6排出切割溶液并洗涤样品。洗涤后，开始一个新的合成循环，与另一个合成构建块偶联。
根据本发明，为每个合成构建块提供单独的合成笔11，在各个笔中试剂20被放置在封闭空间中并且可以用惰性气体21包围。具有相应合成构建块的单个合成笔11设置在合成装置1的支架4中，并由夹臂2带到合成板5的反应室9，夹臂2在夹臂固定部30处夹住合成笔11，进行试剂的定量输送。
根据本发明使用的合成笔11由在脚端处具有吸嘴14的中空圆柱形主体12和紧密封闭圆柱空间的螺旋盖13组成。在吸嘴14中有一个出口开口，该出口开口由阀针15和截止阀16关闭，该截止阀在关闭位置抵靠在密封件29上。阀针15和截止阀16由活塞18通过活塞杆17引导。截止阀16所需的关闭压力由压缩弹簧19产生，该弹簧位于活塞18上并支撑抵靠在螺旋盖13的内端面上。活塞18下方的自由空间用于展示相关的合成构建块20，其有利地被惰性气体21包围。通过这种方式，高反应性试剂可以在惰性气体气氛下长时间保持稳定，从而显著提高合成产品的质量。
为了在吸嘴14与样品直接接触的情况下可靠地排除交叉污染，根据本发明，反应室9在开口侧覆盖有可渗透材料25，例如玻璃料，其中样品或固相26(例如合成树脂)位于反应室9中。为了将合成构建块20偶联到样品或合成树脂上，合成笔11的吸嘴14被放置在可渗透材料25上以关闭反应室，由此阀针15逆着关闭压力向内移动压缩弹簧19且截止阀16被释放。这之后，试剂溶液可以自由流出，流出的溶液剂量由吸嘴14放置在材料25上的时间段确定。
随着最后临时保护基的切割和样品的洗涤，与固相26偶联的合成构建块20发生切割。为此，通过冲洗梳8将切割溶液添加到样品中并引发切割反应。在温育时间过去之后，阀块6以这样的方式切换，使得溶解在切割溶液中的化合物进入样品板27的接收室，根据本发明的另一个特征，样品板27被布置在阀块6下方并连接到提取系统。样品板27在其构造和设计方面与合成板5相对应。随着从固相26溶解的化合物转移到样品板27中，合成完成。
图6示出了合成笔11的另一个优选实施例，其中相同的附图标记相互对应。在该设计中，试剂容器的螺旋盖由具有卡口盖的可移动盖子13a代替。活塞杆17优选地布置在盖子的中心，特别是压入的活塞杆，通过整个合成笔进入剂量筒31。剂量筒31向下关闭，例如利用止回阀32。通过按压盖子13a，借助活塞分配规定量的试剂。安装在合成笔11中的复位装置，例如弹簧33、33a、33b，使活塞复位。同时或在下游，定量筒再次被填充34。脚侧吸嘴14中合适的调节装置，例如止回阀，确保溶液只能通过主动输送来进行定量。合成笔11的这种设计允许无接触分配到反应室中。带有封闭试剂容器的合成笔11的封闭设计确保了高度的试剂稳定性。
图7示出了根据本发明的装置的示意图。
根据本发明的方法是固相肽合成的一部分，如由根据本发明的装置进行或可以由根据本发明的装置进行。为此，氨基酸的N端被保护基团保护以免发生不希望的反应。以这种方式保护的氨基酸通过其C端(I)与固体载体材料结合。随后，将N端脱保护(II)，以便通过肽增殖(III)将在N端受保护的另一个氨基酸与前一个氨基酸的N端结合。重复步骤II至III，直到达到所需的氨基酸链长。当达到链长时，在步骤IV中通过从载体材料上切割肽来终止反应。至少在最后，用合适的溶剂洗涤肽(步骤V)。任选地，在方法开始时进行固体载体材料(通常是树脂)的预溶胀(步骤O)。根据本发明，所述各步骤中的至少一个是至少临时超声辅助的(X)。这应理解为至少暂时地将频率至少大于25kHz的超声(X)施加到发生合成的反应介质上。已经发现通过容器将反应介质引入其中的超声波浴特别适合于传输。在制备和合成时间方面，进一步发现如果超声(X)在几个步骤中作用于反应介质是有利的，优选在各步骤之间不关闭。特别是关于步骤I至IV，根据本发明实施的超声可以使合成时间减少约一个数量级。
表1比较了没有超声作用的现有技术方法和根据本发明具有50至150kHz范围内的超声作用的重复单元的各个步骤的合成时间。很明显，根据本发明的方法比没有超声波的类似方法快十倍。
表1：根据现有技术和根据本发明的方法所需合成时间的比较。
除了与N端或C端结合的保护基团外，氨基酸还可以具有其他保护基团以封闭反应性侧链。这里必须注意肽合成过程中对化学和物理环境的要求，例如超声波和碱或酸的稳定性。用于本发明方法的反应性侧链的合适保护基团为例如酸不稳定保护基团，例如S-2,4,6-三甲氧基苄基(Tmob)、三苯甲基(Trt)、叔丁基(tBu)、叔丁氧羰基(Boc)和2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)。
参考根据本发明的方法，例如，选自以下组的Fmoc氨基酸，其被标记为氨基酸的单字母代码，特别适用于肽增殖：Fmoc-A-OH、Fmoc-C(Trt)-OH、Fmoc-D(OtBu)-OH、Fmoc-E(OtBu)-OH、Fmoc-F-OH、Fmoc-G-OH、Fmoc-H(Trt)-OH、Fmoc-I-OH、Fmoc-K(Boc)-OH、Fmoc-L-OH、Fmoc-M-OH、Fmoc-N(Trt)-OH、Fmoc-P-OH、Fmoc-Q-Trt–OH、Fmoc-R-Pbf–OH、Fmoc-S-tBu–OH、Fmoc-T-tBu–OH、Fmoc-V-OH、Fmoc-W(Boc)-OH、Fmoc-Y-(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Tmob)-OH、Fmoc-Asn(Tmob)-OH(TMOB＝2,4,6-三甲氧基-苄基)。
Fmoc氨基酸可以L型和D型两种形式存在。
通过使用这些，与现有技术相比，合成时间可以减少十倍以上，而没有收率损失。
表2显示了在优选实施例中基于使用内吗啡肽的示例的移液方案的本发明方法的典型合成过程。这基本上包括上文提到的步骤(O-V)，然而，在以下示例中更详细地描述了这些步骤并带有子步骤。第一步骤是树脂(O)的预溶胀，然后是树脂的脱保护，例如用在DMF中的20％哌啶，随后用溶剂洗涤，例如DMF或DCM，偶联氨基酸(I)，再次用溶剂洗涤，例如DMF或DCM，氨基酸的脱保护，最后用溶剂洗涤，优选DMF或DCM。
此处的循环顺序始终相同。在最后一个氨基酸(AA)偶联后，将其脱保护、洗涤并用溶剂(例如DMF或DCM)冲洗。在各个循环期间，使用频率在25kHz至2MHz范围内的超声波作用于所示实施例中的反应介质。在本示例中，超声波(X)在各步骤之间也不中断。或者，可以在各步骤之间或在各步骤期间中断超声波。然而，在40kHz至2MHz范围内，尤其是50kHz至200kHz范围内的测试频率中，连续超声显示特别有利。
在所示示例中，预溶胀和用溶剂(优选二氯甲烷(DCM))最终清洗的步骤在没有超声的情况下进行。然而，这仅是优选实施例，因此实际上可以在所有步骤中提供超声波。
表2：在一个优选实施方案中使用根据本发明的方法进行固相肽合成的合成序列。
根据本发明的方法可以作为所谓的短期或长期合成进行。两者的区别如表3所示：
短期合成
长期合成
有超声波脱保护
有超声波脱保护
脱保护持续时间：30s
脱保护持续时间：1min
脱保护步骤数目：1
脱保护步骤数目：2
无超声波洗涤
每次有30秒超声波的洗涤
每个洗涤步骤：洗涤5x
每个洗涤步骤：洗涤3x
AA的单偶联
AA的双偶联
表3：短期和长期合成的描述
短期合成与长期合成的主要区别在于脱保护的持续时间减半。此外，减少了洗涤和脱保护步骤的数量。尽管长期合成需要更长的合成时间，但与现有技术相比，它还提供了减少十分之一的合成时间。
超声合成中双偶联合成方案(单一频率)
表4
双偶联循环的总持续时间：11min
重复此循环，直到合成整个序列(例如ACP：H-VQAAIDYING-NH2→10种氨基酸→10个循环)。
预溶胀和洗涤等准备步骤以及最后的洗涤步骤在此不一一列举。
超声合成中单偶联合成方案(单一频率)
表5
单偶联循环的总持续时间：8min
重复此循环，直到合成整个序列(例如ACP：H-VQAAIDYING-NH2→10种氨基酸→10个循环)。
预溶胀和洗涤等准备步骤以及最后的洗涤步骤在此不一一列举。
超声波合成中单偶联合成方案(若干个频率，例如132kHz和470kHz)
表6
脱保护：2*0.5有132+470→在132kHz下0.5min，然后在470kHz下0.5min
添加AA(+HCTU、DIPEA):
1+2有132+470→在132kHz下1min，然后在470kHz下2min
单偶联循环的总持续时间：8min
重复此循环，直到合成整个序列(例如：H-PYLFWLAAI-NH2→9种氨基酸→9个循环)。
预溶胀和洗涤等准备步骤以及最后的洗涤步骤在此不一一列举。
LIPS合成的合成方案(3倍偶联(3fach-Kopplung))
表7
具有3倍偶联的循环的总持续时间：约122min
重复此循环，直到合成整个序列(例如：H-VQAAIDYING-NH2→10种氨基酸→10个循环)。
分配笔所需的时间取决于几个因素，因此这里仅给出近似值。
不进行加帽(乙酰化)的ABI合成(1倍偶联(1fach-Kopplung))的合成方案
表8
具有1倍偶联的循环的总持续时间：约80min
时间只能用近似值给出，因为各个模块可以有不同的长度，而这又取决于要合成的序列。此外，内部传感器在脱保护过程中测量脱保护Fmoc基团的比例。
重复此循环，直到合成整个序列(例如：H-VQAAIDYING-NH2→10种氨基酸→10个循环)。
在各模块内，包括额外的洗涤步骤，因此这些没有单独显示。
进行加帽(乙酰化)的ABI合成(2倍偶联(2fach-Kopplung))的合成方案
表9
具有2倍偶联的循环的总持续时间：约130min
时间只能用近似值给出，因为各个模块可以有不同的长度，而这又取决于要合成的序列。此外，内部传感器在脱保护过程中测量脱保护Fmoc基团的比例。
重复此循环，直到合成整个序列(例如：H-VQAAIDYING-NH2→10种氨基酸→10个循环)。
在各模块内，包括额外的洗涤步骤，因此这些没有单独显示。
ACP H-VQAAIDYING-NH2 M＝1063.2Da
合成规模：25μmol
合成树脂：Knorr Amid树脂LS 1％DVB
活化剂：HCTU
碱：DIPEA
使用的氨基酸：
游离氨基官能树脂：氨基酸：活化剂：碱的比例：1:4:3.9:8
图11比较了ACP肽H-VQAAIDYING-NH2的平均合成质量，同时考虑了合成策略：660-SL3 LIPS：微量滴定板(MTP)LIPS机器人中的ACP 3倍偶联(标准方案)持续时间：22.5h
USPS 132kHz 50％功率：超声波中的ACP，132kHz 1倍偶联(2个批次的平均值)持续时间：2.5h
USPS 470kHz 50％功率：超声波中的ACP，470kHz 1倍偶联(2个批次的平均值)持续时间：2.5h
USPS 1000kHz 60％功率：超声波中的ACP，1000kHz 1倍偶联(2个批次的平均值)持续时间：2.5h
可见，频率的水平提高了产品的质量。
图12以图形方式示出了根据图11合成的H-VQAAIDYING-NH2 25μmol的质量。
因此，可以说持续超声提高了产品质量，而频率的增加也提高了产品质量。
图13显示了对不同溶液持续时间的氨基酸的储备溶液的测试。
对于不同的储备溶液，ACP肽的合成是使用1000kHz的超声波进行的，所用氨基酸的溶解时间不同。
可以看出，所用氨基酸的更短溶解时间提高了产品质量。
图14是在不同频率H-VQAAID下就偶联数(Kopplungszahl)而言的收率和质量比较的图示。
可以看出，在低频(132kHz)下，LCMS质量随着偶联数的增加而增加。
在高频(470kHz)下，LCMS质量几乎没有任何差异。
然而，与频率无关，收率随着偶联数的增加而增加。
对于实验(图15)，选择了与之前测试不同的肽。序列为PYLFWLAAI-NH2，这也是一种难以合成的肽。
ACP H-PYLFWLAAI-NH2 M＝1092.6Da
合成规模：25μmol
合成树脂：Knorr Amid树脂LS 1％DVB
活化剂：HCTU
碱：DIPEA
使用的氨基酸：
游离氨基官能树脂：氨基酸：活化剂：碱的比例：1:4:3.9:8
图15示出了该肽的单偶联和双偶联以及氨基酸过量的比较。
在相同频率下，合成质量没有显著差异。
然而，当偶联数增加时，相对收率明显增加。
图16示出了使用不同超声频率的肽的平均合成质量的对比图。
其显示了肽PYLFWLAAI-NH2的合成，它是在不同的超声频率下使用单偶联合成的。
无超声波：
常规ABI合成，氨基酸过量40倍。
常规ABI合成，氨基酸过量4倍。
氨基酸过量越少，常规ABI合成中的LCMS质量越差。
简单的超声波频率4倍过量的氨基酸
频率：40kHz、132kHz、470kHz
随着频率的增加，LCMS质量提高。
偶联的超声波频率(去保护、偶联)，仅在较低频率洗涤
偶联的频率：40kHz+470kHz和132kHz+470kHz
频率之间的切换导致合成质量的显著恶化。
超声VS传统ABI合成
为了在常规ABI合成中实现良好到非常好的LCMS质量，需要非常高过量的氨基酸(40倍)。
在超声波的帮助下，4倍过量的氨基酸就足够了。在这里，使用的频率越高，LCMS的质量就越高。
等效结果显示以下参数：
ABI(40x过量)和470kHz(4x过量)。
通过超声波合成，可以在更短的时间内并减少溶剂和氨基酸的使用，获得至少等效且通常更好的结果。
图8至图10分别显示了通过固相肽合成法合成的肽的组成。图8至9中所示的肽是通过根据本发明的方法制备的，而图10基于根据现有技术通过Tetras合成的肽。所有方法均使用根据本发明的装置进行。
通过HPLC分离从各种方法获得的产物，并通过质谱法和紫外-可见光谱法指定各个峰。使用具有以下参数的设备：
HPLC MS系统
Dionex Binary HPLC泵
运行介质A：水+0.1％甲酸
运行介质B：乙腈+0.1％甲酸
流速：0.5ml/min
用于多达4个微量滴定板的Gilson自动进样器
Dionex柱温箱
温度:30℃
Dionex紫外检测器
在220nm下测量
Dionex/Thermo Finnigan Surveyor MSQ单四极杆质谱仪
电离模式：ESI
样品温度：350℃
锥体电压：50V
HPLC分离柱：Merk，Chromolith WP300，RP18，100-4.6mm
图8显示上述用于封闭反应性侧链的保护基团在根据本发明的方法中是稳定的。为此，针对三个最常见的保护基团显示了根据本发明方法的肽合成结果。
图8显示了根据本发明的方法在长期合成程序的基础上进行的内吗啡肽合成的分析结果。最初的理论考虑表明，氧化敏感性色氨酸可以在合成过程中被超声波氧化。然而，这并未得到证实。相反，合成成功，纯度为83％。只鉴定出少量副产品。
甲硫氨酸、三苯甲基和Tmob保护基团在根据本发明的方法期间在个别测试中也证明是稳定的。
图9显示了具有序列VQAAIDYING-OH的酰基载体蛋白(ACP)的合成，其根据具有长期合成的本发明的方法制备。
使用了保护基团Fmoc-Q(Tmob)-OH和Fmoc-N(Tmob)-OH。由于其强疏水性，所述合成的肽基本上很难制备。然而，通过根据本发明的方法可以生产纯度为82％该合成肽。与使用图10所示的现有技术Tetras方法合成相同肽(其只能达到79％的纯度)相比，可以看出，根据本发明的方法除其他优点外，可以实现收率的提高。此外，根据本发明的方法生产的肽的合成时间在2.5小时内完成，而根据现有技术的对比方法需要25小时。因此，根据本发明的方法时间缩短了十倍。
根据本发明的方法和根据本发明的装置的使用有利地使得合成时间减少至对于没有微波辅助的根据现有技术的方法的合成时间的最多十分之一。可以表明，这绝不与收率的降低相一致，而是可以通过与标准方法的直接比较表明，根据本发明的方法生产出更高纯度的目标肽，特别是当使用根据本发明的装置时。
附图标记列表
1 合成装置
2 夹臂
3 工作区域
4 支架
5 合成板
6 阀块
7 抽吸泵
8 冲洗梳
9 反应室
10 冲洗剂供应管道
11 合成笔
12 主体，中空圆柱体
13、13a 盖、螺旋盖、带卡口盖的活动盖
13b 锁定卡口盖
14 吸嘴
15 阀针
16 截止阀
17 活塞杆
18 活塞
19 压缩弹簧
20 合成构建块
21 惰性气体
23 出口开口
25 可渗透材料/玻璃料
26 固相
27 样品板
28 膜
29 密封件
30 夹臂固定部
31 定量筒
32 出口阀
33 复位弹簧
33a 复位弹簧的紧固件
33b 复位弹簧，螺钉紧固件
34 用于定量筒填充的间隙
35 联管螺母
36 定量管引导
37 定量管
50 超声波浴
O 预膨胀
I 将在N端被保护基团保护的氨基酸通过氨基酸的C端结合到固体载体材料上，
II 切割保护基团
III 进行至少一种肽增殖
IV 通过从载体材料上切割肽来终止反应
V 洗涤
X 超声作用
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