一种循环细胞外囊泡原位标记和快速分离方法
阅读说明：本技术 一种循环细胞外囊泡原位标记和快速分离方法 (Circulating extracellular vesicle in-situ labeling and rapid separation method ) 是由 陈刚 余自力 刘海明 吴敏 赵怡芳 于 2021-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种循环细胞外囊泡原位标记和快速分离方法,将磷脂聚乙二醇或其衍生物修饰的物质注射到受试者的血液循环系统,磷脂聚乙二醇或其衍生物修饰的物质在游离状态下自行组装至循环细胞外囊泡的细胞膜磷脂双分子层上。该标记方法可应用在循环细胞外囊泡代谢动力学监测和从活体中快速分离出循环细胞外囊泡等方面,将有助于循环细胞外囊泡的基础研究和临床应用。与现有的标记方法相比,本发明无需提前将循环细胞外囊泡从外周血中分离出来,可有效避免超速离心等方法对循环细胞外囊泡结构的破坏,最大限度地保持循环细胞外囊泡自身的理化性能,该方法具有普适性,适用于标记和快速分离多种动物、细胞来源的循环细胞外囊泡。(The invention discloses an in-situ labeling and rapid separation method of circulating extracellular vesicles, which comprises the steps of injecting phospholipid polyethylene glycol or a substance modified by derivatives thereof into a blood circulation system of a subject, and automatically assembling the substance modified by the phospholipid polyethylene glycol or the derivatives thereof on a cell membrane phospholipid bilayer of the circulating extracellular vesicles in a free state. The labeling method can be applied to aspects of monitoring the metabolism dynamics of the circulating extracellular vesicles and rapidly separating the circulating extracellular vesicles from living bodies, and is favorable for basic research and clinical application of the circulating extracellular vesicles. Compared with the existing labeling method, the invention does not need to separate the circulating extracellular vesicles from peripheral blood in advance, can effectively avoid the damage of ultracentrifugation and other methods to the circulating extracellular vesicle structure, and furthest keeps the physical and chemical properties of the circulating extracellular vesicles.)
技术领域
本发明涉及分子生物学和生物技术领域，更具体涉及一种活体标记循环细胞外囊泡(circulating extracellular vesicles,C-EVs)的方法，同时还涉及该方法在循环细胞外囊泡代谢动力学监测和从活体中快速分离出循环细胞外囊泡等方面的应用，将有助于循环细胞外囊泡的基础研究和临床应用。
背景技术
细胞外囊泡是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的具有双层膜性结构的囊泡状小体，直径介于40-1000nm之间，其广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中。外周血中的细胞外囊泡，又被称为循环微囊泡(C-EVs)，是由血小板、红细胞、淋巴细胞、内皮细胞等多种细胞分泌的细胞外囊泡混合物。细胞外囊泡继承母细胞丰富的生物信息分子，如蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，并在多种病理生理学行为中充当细胞间信息传递载体，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。另外，基于其天然的运载属性和良好的生物安全性，细胞外囊泡被认为是极具前景的基因或药物递送载体，用于多种疾病的治疗。
尽管前景良好，但目前关于循环细胞外囊泡基本性能方面的认识仍然严重不足，尤其是其在体内的代谢动力学、组织分布规律和清除规律，以及不同亚型细胞外囊泡的比较等仍有待进一步研究。目前，循环细胞外囊泡体内生物学行为的研究需要先将血液循环细胞外囊泡通过超速离心等方法进行分离纯化，在体外标记后再回输入人体内进行后续研究。尽管该策略为研究循环细胞外囊泡的体内生物学行为发挥了重要作用，但其存在诸多缺陷：1.体外超速离心分离的强大离心力会造成循环细胞外囊泡结构破坏；2.体外标记策略如荧光染料标记、量子点标记，体外载体构建如电化学转染等会改变循环细胞外囊泡物理化学性质，进而影响循环微囊泡客观的清除效率；3.体外标记策略稳定性差，荧光染料如DiI、DiO和PKH等光漂性强、光强度弱，量子点易造成泄漏等，造成信号流失或者扩散等不利影响；4.体外标记只能实现对血液总循环细胞外囊泡的表征。因此，为了研究循环细胞外囊泡代谢动力学、体内分布规律，急需开发一种生物友好、简便快捷的，且可以实现循环细胞外囊泡无损标记的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种循环细胞外囊泡原位标记和快速分离方法，该原位标记方法不需要体外冗长的离心分离和静态孵育，直接将磷脂-聚乙二醇-生物素(DSPE-PEG-Biotin)注入血液循环系统中去即可完成循环细胞外囊泡的原位标记，标记效率高，且受血液中其他成分干扰较小；更重要的是，该原位标记方法不影响循环细胞外囊泡的物理性质(大小、形态)以及特征性分子表达；该原位标记方法不是基于免疫亲和方式，因此来源于不同细胞或者是不同物种的细胞外囊泡都可以和DSPE-PEG-Biotin发生作用，应用范围广，该方法具有普适性。另外，DSPE-PEG-Biotin具有较好的生物友好性，对机体主要代谢器官如肝、肾等无明显毒副作用。
本发明提供的技术方案具体如下：
第一方面，本发明提供一种非医学目的的活体标记循环细胞外囊泡的非侵害性方法，将磷脂聚乙二醇或其衍生物修饰的物质注射到受试者的血液循环系统，磷脂聚乙二醇或其衍生物修饰的物质在游离状态下自行组装至循环细胞外囊泡的细胞膜磷脂双分子层上。
第二方面，本发明提供磷脂聚乙二醇或其衍生物修饰的物质在制备用于活体标记受试者循环细胞外囊泡的产品中的用途，该产品用于使磷脂聚乙二醇或其衍生物修饰的物质进入血液循环系统中。
作为上述技术方案的优选，受试者为人或非人哺乳动物。
作为上述技术方案的优选，磷脂聚乙二醇或其衍生物修饰的物质为磷脂-聚乙二醇-生物素、磷脂-聚乙二醇-叶酸、磷脂-聚乙二醇-生物素-荧光剂、磷脂-聚乙二醇-纳米颗粒、磷脂-聚乙二醇-药物、磷脂-聚乙二醇-多肽中的至少一种。
作为上述技术方案的优选，磷脂聚乙二醇或其衍生物修饰的物质进入血液循环系统中的量为5～300mg/kg。
作为上述技术方案的优选，磷脂聚乙二醇或其衍生物修饰的物质通过静脉注射或腹腔注射的方式注射到非人哺乳动物体内或人体内。
作为上述技术方案的优选，磷脂聚乙二醇或其衍生物修饰的物质先用二甲亚砜溶解，再用无菌盐水稀释，得到磷脂聚乙二醇或其衍生物修饰的物质的注射液。
第三方面，本发明提供一种非医学目的的非侵害性循环细胞外囊泡体内追踪方法，包括如下步骤：
(1)将磷脂-聚乙二醇-生物素注射到受试者体内；
(2)在不同时间点，对受试者动脉取血，从血液中分离出循环细胞外囊泡；
(3)利用链霉亲和素偶联的荧光染料和不同分化抗原的流式抗体标记循环细胞外囊泡；
(4)利用流式细胞仪检测步骤(3)的标记产物。
作为上述技术方案的优选，从血液中分离出循环细胞外囊泡的步骤为：将血液于4℃、1550g条件下离心，收集上层血浆，至少重复两次以去除细胞及细胞碎片；将上清在4℃离心20,000g条件下离心，所得沉淀即为循环细胞外囊泡。
第四方面，本发明提供一种非医学目的的从活体中快速分离出循环细胞外囊泡的非侵害性方法，包括如下步骤：
将磷脂-聚乙二醇-生物素注射到受试者体内；
对受试者动脉取血，离心，除去血液中的细胞和细胞碎片，上清中加入链霉亲和素偶联的氧化铁纳米颗粒，混匀后37℃孵育；
利用磁铁吸附，分离出膜表面经氧化铁纳米颗粒修饰的循环细胞外囊泡。
本发明与现有技术相比，具有以下优势：
1.本发明基于膜磷脂替换策略对活体内血液循环系统中循环细胞外囊泡进行直接标记，避免了体外离心、荧光染料标记后再回输入体内这一冗长繁琐的方法，具有简便、快捷、高效的优势，并且有效避免了循环细胞外囊泡结构破坏、荧光信号易光漂等不利影响，便于准确研究循环细胞外囊泡体内循环规律。
2.本发明提供的活体原位标记方法生物友好性强，在循环细胞外囊泡表面上稳定引入标记剂的同时不影响循环细胞外囊泡的物理化学性质，对人体主要代谢器官如肝、肾等无明显毒性，便于开展人体研究以及临床成果转化。
3.本发明提供的活体标记方法适用于不同对象的研究分析，普适性强，适用于其他物种或其他体液来源的细胞外囊泡。
附图说明
图1展示了DSPE-PEG-Biotin的化学结构式，其中O代表氧原子，HO代表羟基，N代表氮原子，NH代表亚氨基，NH2代表氨基，NH4 +代表铵根，C代表碳原子，P代表磷原子，S代表硫原子，n代表-OCH2CH2-的数量。
图2展示了小鼠经注射DSPE-PEG-Biotin后的情况，图2(a)为体重变化曲线，图2(b)为肝脏重量变化情况，图2(c)为肾脏重量变化情况。
图3展示了小鼠经注射DSPE-PEG-Biotin后血液生化指标变化(PLT，血小板；RBC，红细胞；WBC，白细胞；HGB，血红蛋白；Lymph，淋巴细胞；MCH，平均红细胞血红蛋白含量、MCHC，平均红细胞血红蛋白浓度；MCV，平均红细胞容积；PDW，血小板分布宽度；Gran，粒细胞)，结果显示无显著差异。
图4展示了流式细胞术检测循环细胞外囊泡生物素化水平与DSPE-PEG-Biotin剂量的关系。
图5展示了DSPE-PEG-Biotin对循环细胞外囊泡外形、粒径分布的影响，图5(a)、图5(b)依次为DSPE-PEG-Biotin标记前、后循环细胞外囊泡的透射电镜图，图5(c)为NTA分析的粒径分布图，图5(d)为DSPE-PEG-Biotin标记前、后循环细胞外囊泡的平均粒径。
图6展示了DSPE-PEG-Biotin标记对循环细胞外囊泡分布表达的影响；图6(a)为流式细胞术检测结果，图6(b)为免疫印迹技术检测结果。
图7展示了DSPE-PEG-Biotin注射入血液循环后，循环细胞外囊泡上生物素水平的动态变化。
图8展示了DSPE-PEG-Biotin注射入血液循环后，利用链霉亲和素偶联的氧化铁纳米颗粒分离所得的循环细胞外囊泡。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作更进一步地解释。其中，实施例和附图仅用于示例性说明，但并不用来限定本发明的实施范围。对本领域相关专业人员来说，实施例及附图中某些公知的结构及其说明可能忽略是可以理解的。
我们的前期研究发现，DSPE-PEG-Biotin为生物素功能化的磷脂酰乙醇胺，在游离状态下即可自行组装至细胞膜磷脂双分子层上，却不影响循环细胞外囊泡的生物学行为。因此，通过将一定剂量的DSPE-PEG-Biotin通过尾静脉或者腹腔注入动物体内，在活体内实现了循环细胞外囊泡的高效、无损生物素标记，并在此基础上首次研究了循环细胞外囊泡体内代谢时间及规律。
另一方面，本发明解决了循环细胞外囊泡分离难的瓶颈。目前分离循环细胞外囊泡最常用的方法是超速离心法。超速离心法不仅耗时费力，没有标准化的操作流程需要大型的超速离心设备，不利于临床推广应用；更重要的是，超速离心法分离细胞外囊泡的效率不足30％，导致循环细胞外囊泡产率较低。此外，大量研究已经证实，超速离心法分离的循环细胞外囊泡纯度较低，外周血中大量的蛋白聚合物在超速离心过程中会随着细胞外囊一起被分离出来，进而对循环细胞外囊泡的纯度造成极大的干扰。本发明利用活体标记循环细胞外囊泡的方法，实现了循环细胞外囊泡的原位生物素标记，在此基础上，通过生物素特异性结合磁性纳米颗粒，即可实现循环细胞外囊泡的快速磁分离。从而避免了当前超速离心诸多不足，为循环细胞外囊泡的分离提供了简单、快捷的方法。
本发明使用的DSPE-PEG-Biotin购于Avanti Polar Lipids公司，CAS号：385437-57-0，分子式：C142H280N5O56PS，分子量：3016.815。本发明的磷脂-聚乙二醇-叶酸、磷脂-聚乙二醇-荧光剂、磷脂-聚乙二醇-纳米颗粒、磷脂-聚乙二醇-药物、磷脂-聚乙二醇-多肽依次指图1中生物素被叶酸、荧光剂、纳米颗粒、药物、多肽替代的物质。
本发明的术语“非医学目的”指的是“非治疗目的且非诊断目的”。
以下通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明：
实施例1
本实施例提供一种活体标记循环细胞外囊泡的方法：
(1)配制DSPE-PEG-Biotin注射液：55℃水浴加热溶解DSPE-PEG-Biotin(结构式如图1所示)于二甲基亚砜(DMSO)中，无菌0.9％生理盐水涡旋稀释DSPE-PEG-Biotin，4℃保存。
(2)将C57BL/6小鼠经分组、称重、麻醉及固定，然后以尾静脉注射的方式将DSPE-PEG-Biotin溶液按照25mg/kg、75mg/kg、150mg/kg的剂量标准注射入C57BL/6小鼠体内，每只小鼠注射溶液总体积不超过200μL，对照组注射200μL无菌0.9％生理盐水。
(3)取不同时间点称量小鼠体重，麻醉小鼠后经内眦动脉取血0.5-1mL，处死后收获主要组织器官。
(4)取步骤(3)获得的部分血液进行常规血液分析，组织器官包埋后切片，切片经常规苏木精-伊红染色法(HE)染色后用普通光学显微镜观察。结果显示原位生物素标记法对小鼠的体重(见图2(a))、肝肾功能(见图2(b)、图2(c))、血常规(图3)、组织形态等指标均无明显的影响，证明DSPE-PEG-Biotin具有良好的生物友好性。
(5)取步骤(3)中所获得血液在4℃、1550g条件下离心20min收集上层血浆，重复两次以去除细胞及细胞碎片；将上清在4℃离心20,000g条件下离心2h，保留上清备用，沉淀即为循环细胞外囊泡，用适量无菌PBS重悬，置于-80℃储存。
(6)步骤(5)获得的上清经PBS稀释后，加入到异硫氰酸荧光素标记链霉亲和素(SA-FITC)溶液中(2.5μg/mL)，室温孵育10min，用荧光分光光度计在511-515nm测量荧光强度，结果显示荧光强度与DSPE-PEG-Biotin注射剂量呈正相关，且DSPE-PEG-Biotin在12h内即可有效结合。
(7)取步骤(3)中获得的主要组织器官如肝、肾、心脏等标本经Cy3标记链霉亲和素(SA-Cy3)标记后在荧光显微镜下观察，image J软件计算相对荧光强度。结果显示游离DSPE-PEG-Biotin主要分布于肝、肾和心脏等，提示DSPE-PEG-Biotin主要由肝、肾代谢。
(8)利用透射电镜、荧光显微镜、纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术、免疫印迹及流式细胞仪对步骤(5)中获取的循环细胞外囊泡进行形态和粒径的表征、膜表面生物分子和生物素化效率的检测，结果显示循环细胞外囊泡表面生物素化效率与注射的DSPE-PEG-Biotin剂量呈正相关(图4)。此外，原位生物素化标记不影响循环细胞外囊泡的形态(见图5(a)、图5(b))、粒径(见图5(c)、图5(d))和特征性分子的表达(图6)。
实施例2
本实施例提供一种活体标记循环细胞外囊泡的方法在研究循环细胞外囊体内生物学行为中的应用：
(1)配制DSPE-PEG-Biotin注射液：55℃水浴加热溶解DSPE-PEG-Biotin于DMSO中，无菌盐溶液涡旋稀释DSPE-PEG-Biotin，4℃保存。
(2)将小鼠经分组、称重、麻醉及固定，然后以尾静脉注射的方式将DSPE-PEG-Biotin溶液按照150mg/kg的剂量标准注射入C57BL/6小鼠体内，每只小鼠注射溶液总体积不超过200μL。
(3)在不同时间点麻醉小鼠后经内眦动脉取血0.5-1mL，所得血液于4℃、1550g条件下离心20min收集上层血浆，重复两次以去除细胞及细胞碎片；将上清在4℃离心20,000g条件下离心2h，沉淀即为循环细胞外囊泡，用适量无菌PBS重悬，置于-80℃储存。
(4)步骤(3)中所得循环细胞外囊泡利用SA-FITC和针对不同表面标志分子的流式抗体标记后，流式细胞仪检测总循环细胞外囊泡循环寿命及各细胞亚群循环细胞外囊泡所占比例及循环寿命。结果显示，总循环细胞外囊泡代谢时间约3天(图7)；红细胞来源循环细胞外囊泡比其他细胞来源细胞外囊泡更长的循环寿命。
实施例3
本实施例提供一种从活体中快速分离出循环细胞外囊泡的方法：
(1)配制DSPE-PEG-Biotin注射液：55℃金属浴加热溶解DSPE-PEG-Biotin于DMSO中，再用无菌盐溶液涡旋稀释DSPE-PEG-Biotin，配制成DSPE-PEG-Biotin盐溶液，4℃保存。
(2)将小鼠分组、称重、麻醉及固定，然后以尾静脉注射的方式将DSPE-PEG-Biotin溶液按照25mg/kg、75mg/kg、150mg/kg的剂量标准注射入C57BL/6小鼠体内，每只小鼠注射溶液总体积不超过200μL。
(3)小鼠活体经内眦动脉取血0.5-1mL，4℃、1550g离心20min两遍去除细胞及细胞碎片，取上清加入适量链霉亲和素偶联的氧化铁纳米颗粒(SA-IONPs)溶液(10μg/μL)，用涡旋仪轻柔混匀混合液，然后在37℃温箱中孵育28-32min，接着使用一块磁铁(100×50×20mm，0.6T)将混合液中SA-IONPs标记成功的循环细胞外囊泡分离出来，用PBS重悬并洗脱数次，最后将沉淀用PBS重悬，冻存于-80℃，获得膜表面经氧化铁纳米颗粒修饰的循环细胞外囊泡(如图8所示)。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种因子法扩增T细胞的培养基及培养方法