具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

采用GraphpadPrism8统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验。

M199细胞培养基(gibco公司，货号：C11150500BT)。

大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(CHSE-214细胞)由本实验室保存，该细胞记载在如下文献中：Xu L M，Zhao J Z，Liu M，et al.Bivalent DNA vaccine induces significantimmune responses against infectious hematopoietic necrosis virus andinfectious pancreaticnecrosis virus in rainbow trout[J].Scientific reports，2017,7(1)：5700.。

IPNV毒株由本实验室分离并保存，该毒株记载在如下文献中：Duan K Y，Zhao JZ，Ren G M，et al.Molecular Evolution of Infectious Pancreatic Necrosis Virusin China[J].Viruses，2021，13(3)：488.。

实施例1、IPNV病毒液的制备

一、CHSE-214细胞的复苏和培养

从液氮罐中取出冻存的CHSE-214细胞，迅速放入30℃恒温水浴锅中，待其融化，在无菌条件下移入15m1离心管，1000g/min离心2min弃去细胞冻存液，加入1mlM199细胞培养液(含10％胎牛血清和1％双抗)混匀。将吹匀的细胞移入T-25细胞培养瓶，并补加4ml细胞培养液，吹匀后放入20℃二氧化碳生化培养箱中静置培养。待细胞汇集成单层，用0.25％胰蛋白酶消化，根据实验所需进行传代至6孔或96孔细胞培养板等。

二、IPNV在CHSE-214细胞上最佳增殖方案的研究

1、不同浓度IPNV感染CHSE-214细胞

取6孔板，每孔中单层CHSE-214细胞的量为8.0×10⁵个，将本实验室分离的IPNV毒株(1.00×10^6.00 TCID₅₀/0.1ml)利用PBS缓冲液稀释，分别采用100 TCID₅₀、1000 TCID₅₀、10000 TCID₅₀剂量接种单层CHSE-214细胞，每孔病毒液为1ml。于15℃二氧化碳恒温培养箱内孵育1h后，弃去含有病毒的培养液，每孔更换为2mL细胞维持液(为M199培养基含有2％胎牛血清)，于15℃静置培养，每天观察细胞病变情况。

(请根据实际情况补充调整)

待80％细胞出现病变，收获病毒于-80℃冰箱反复冻融两次，12000g/min 4℃离心15min收集病毒上清液(即为原代病毒)。

将原代病毒按上述三种剂量接种于6孔细胞培养板并以同样的方法进行连续传代培养，直到第10代。将每次传代收获的病毒上清液分装后保存于-80℃冰箱备用。

2、IPNV滴度测定

于1.5mL无菌离心管中用细胞维持液将上述收获的10代病毒上清液作10倍稀释梯度(10^-1～10^-8)，接种于96孔细胞培养板的单层CHSE-214细胞(每孔4.0×10⁴个细胞)上，每个稀释度8个孔，每孔0.1ml稀释后的病毒上清液，置于15℃二氧化碳生化培养箱中培养7d，之后按Reed-Muench法计算病毒滴度，筛选出病毒滴度高且稳定的最佳接毒剂量。细胞维持液接种的单层CHSE-214细胞为阴性对照。

结果显示，当IPNV以100 TCID₅₀进行接毒时，随着传代次数的增加，滴度逐渐上升，传至第5代时趋于稳定，平均滴度为1.00×10^7.50 TCID₅₀/0.1ml。以1000TCID₅₀接毒，IPNV滴度快速上升，当传至第10代时，仍然没有趋于平稳。以10000 TCID₅₀进行接毒，IPNV的滴度在前4代迅速上升，传至第5代时速度减慢，但仍没有达到稳定状态。鉴于以100 TCID₅₀病毒接种后IPNV滴度高且稳定，因此确定对于8.0×10⁵个CHSE-214细胞来说，1ml 100TCID₅₀病毒的接种量为最佳接种剂量(图1)。

3、IPNV收毒时间的确定

该实验分为接毒组和对照组。

接毒组为以最佳接毒剂量(100TCID₅₀)将IPNV接种于6孔细胞培养板的单层CHSE-214细胞(每孔8.0×10⁵个细胞)上，15℃二氧化碳恒温培养箱内孵育1h后，弃去含有病毒的培养液，每孔更换为2mL细胞维持液，于15℃静置培养，然后每天利用倒置显微镜对细胞进行拍照，记录细胞病变状况。于接毒后12、24、48、60、72和84h，收获细胞培养物利用Trizol试剂提取培养物总RNA，使用RT-qPCR的2^-ΔΔCT法检测细胞中IPNV基因含量的变化，以确定病毒最佳收获时间。

对照组为正常的CHSE-214细胞，在6孔细胞培养板采用细胞维持液培养，每孔8.0×10⁵个细胞，2ml细胞维持液，15℃二氧化碳生化培养箱中静置培养。与接毒组相同时间，收获细胞培养物利用Trizol试剂提取培养物总RNA作为阴性对照。

以IPNV A链基因为目的基因，β-acin为内参基因。

A链基因上游引物F：GCATT CAACT ACGGG AGAC

A链基因下游引物R：CATCA GGCT GTTGTA GGTTAG

β-acin上游引物F：GCCGGCCGCGACCTCACAGACTAC

β-acin下游引物R：CGGCCGTGGTGGTGAAGCTGTAAC

每20μl的RT-qPCR体系包括：10μ1 2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 4、1.2μlTaKaRa Ex Taq HS Mix、0.4μlPrimeScript PLUS RTase Mix、2μlRNA模板、0.8μl的上下游引物以及4.8μl的RNase Free dH₂O。反应程序为：42℃5min(1个循环)，95℃10s(1个循环)，95℃5s(40个循环)，60℃34s(40个循环)，95℃15s(1个循环)，60℃1min(1个循环)，95℃30s(1个循环)，60℃15s(1个循环)。

基因含量倍数＝接毒组IPNV基因含量/对照组IPNV基因含量。

RT-qPCR结果显示，IPNV在CHSE-214细胞中的基因含量先升高后降低。接毒后24h内病毒核酸含量较低；接毒后48～72h，基因含量开始增加，分别是对照组的19.8倍、29.4倍和120.0倍，各时间点间IPNV的基因含量差异显著；接毒后84h，基因表达量开始下降，为对照组的89.7倍，显著低于接毒后72h，但仍显著高于其他时间点(p＜0.05)(图2)。

细胞病变观察结果显示，接毒后48h内，细胞未发生任何变化，接毒后60h，CHSE-214细胞开始发生病变，表现为细胞变薄，消融，出现圆形膜结构；接毒后72h，细胞开始大面积病变，出现崩解；接毒后84h，大部分细胞崩解脱落(图3)。

鉴于IPNV在接毒后72h时基因含量最高且细胞病变较为明显，因此选择该时间点为病毒最佳收获时间。

综上所述，IPNV在CHSE-214细胞上的最佳增殖方案为：接种剂量为100 TCID₅₀，15℃培养72h即可收获病毒。

4、IPNV的体外增殖

将剂量为100TCID₅₀的IPNV接种于6孔细胞培养板中的单层CHSE-214细胞(每孔8.0×10⁵个细胞)上，于15℃二氧化碳恒温培养箱内静置培养72h后，收获病毒于-80℃冰箱反复冻融2次后，以12000g/min离心10min(4℃)，取上清液为扩增后IPNV病毒液。

实施例2、IPNV攻毒模型的建立

以1.00×10^5.00 TCID₅₀/尾剂量将IPNV(本实验室分离的IPNV毒株(1.00×10^6.00TCID50/0.1m1))对虹鳟(体重为10±2g)进行腹腔注射攻毒。于攻毒后3、7、14、30d，分别取3尾鱼的内脏组织(肝、脾及头肾)，以1∶10(g：ml)的比例用PBS缓冲液进行匀浆，然后12000g/min4℃离心15min收获上清液。上清液经无菌过滤后进行10倍稀释(10^-1～10^-8)，然后接种于96孔细胞培养板，7d后按Reed-Muench法计算病毒滴度以确定组织中病毒含量最高的时间点，每个样品重复三次。以腹腔注射等量PBS缓冲液的虹鳟组织为对照组。

结果显示，虹鳟组织中IPNV滴度在攻毒后3d最高，随后开始下降。在攻毒后3、7、15、30d时，组织内IPNV平均滴度分别为1.51×10^8.00、5.46×10^7.00、4.25×10^6.00、1.47×10^5.00 TCID₅₀/g。鉴于攻毒后3d时IPNV的病毒滴度最高(p＜0.05)，选择该时间点为攻毒后采样时间点(图4)。

综上所述，攻毒模型为采用实施例1中分离的IPNV毒株(1.00×10^6.00 TCID₅₀/0.1ml)，采用腹腔注射对虹鳟进行攻毒，剂量为10μl/尾。攻毒后3d作为攻毒后的采样时间点。

实施例3、IPN灭活疫苗的制备及免疫保护效力分析

一、IPN灭活疫苗制备

将0.153ml的β-丙内酯(BPL)加入30ml采用实施例1中“4、IPNV的体外增殖”获得的IPNV病毒液(病毒滴度为1.00×10^7.50 TCID₅₀/0.1ml)，使BPL的终浓度为0.500％，混匀后置于室温(25℃)摇床，100r/min进行灭活48h，37℃水浴2h得到IPN灭活疫苗。

二、IPN灭活疫苗的免疫保护效力分析

免疫组用上述制备的IPN灭活疫苗，采用0.1ml/尾(1.00×10^7.50 TCID₅₀)剂量腹腔注射免疫虹鳟，对照组用等量的pH值为6.5的PBS缓冲液腹腔注射虹鳟。虹鳟体重为10±2g，每组80尾。

于免疫后不同时间点，按照实施例2建立的攻毒模型进行攻毒，于攻毒后3天作为采样点进行病毒滴度的测定。病毒滴度的测定方法与实施例2相同。

病毒载量下降程度以对照组与免疫组病毒滴度之比进行表示。

结果显示，免疫组虹鳟病毒滴度显著低于对照组(p＜0.05)，其中免疫后30d的滴度下降最多。免疫后3、7、14、30、45以及60d，对照组虹鳟组织中的IPNV平均滴度分别为免疫组虹鳟的4.7倍、13.5倍、9.3倍、60513.3倍、435.8倍以及29.6倍(p＜0.05)。该结果表明IPN灭活疫苗在免疫后60天内均可有效的抑制病毒增殖，持续对虹鳟产生免疫保护作用，其中在免疫后30d的抗病毒能力最强(图5)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。