负载药物的dna折纸筏及其制备方法、应用
阅读说明：本技术 负载药物的dna折纸筏及其制备方法、应用 (Drug-loaded DNA origami raft and preparation method and application thereof ) 是由 郑晓峰 李威 于 2021-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药领域,特别涉及负载药物的DNA折纸筏及其制备方法、应用。本发明利用DNA纳米技术,将IFN-α精确定量的负载于DNA折纸筏上,使载药量高度可控,并且使IFN-α缓慢释放。(The invention relates to the field of biomedicine, in particular to a DNA origami raft loaded with a medicine, and a preparation method and application thereof. The invention uses DNA nanometer technology to load IFN-alpha on DNA origami raft with accurate quantity, to control the drug-loading quantity and release IFN-alpha slowly.)
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及负载药物的DNA折纸筏及其制备方法、应用。
背景技术
细胞因子是由免疫细胞和非免疫细胞产生的小蛋白质，在免疫系统调节，组织稳态维持，组织损伤修复和抗炎中起着重要的作用。细胞因子具有高效性，在微摩尔甚至皮摩尔都可以起作用。细胞因子作为分子信使，允许免疫系统细胞彼此通信，以产生对靶抗原的协调，在许多疾病中具有调节和效应功能，因此细胞因子可用于免疫治疗。比如，在免疫治疗过程中，细胞因子直接刺激肿瘤部位的免疫效应细胞和基质细胞，增强细胞毒性。获得FDA批准上市的细胞因子药物已有多个，如高剂量的IL-2用于治疗黑素瘤和肾细胞癌，IFN-α用于III期黑素瘤的辅助治疗。还有更多的细胞因子已经进入临床试验阶段，如GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18和IL-2。
然而，细胞因子的半衰期短，体内清除速度快，因此需要连续多次过量给药，也增加了其毒副作用。
因此，提供一种成本低、工艺简单的基于DNA折纸筏的细胞因子药物合成方法，提高细胞因子的稳定性并降低细胞因子疗法的毒副作用，具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，为了提高细胞因子的稳定性并降低细胞因子疗法的毒副作用，本发明提出了一种成本低、工艺简单的基于DNA折纸筏的细胞因子药物合成方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了负载药物的DNA折纸筏，包括DNA修饰的待负载药物，以及DNA折纸筏；
所述DNA修饰的待负载药物包括IFN-α、巯基修饰的DNA(SH-DNA)以及待负载的药物；所述IFN-α与所述巯基修饰的DNA的核苷酸序列互补配对；
所述DNA折纸筏包括M 13mp 18DNA单链、订书钉链和捕获链；
所述订书钉链与所述M 13mp 18DNA单链的核苷酸序列互补配对；
所述捕获链与修饰IFN-α的DNA单链的核苷酸序列互补配对。
在本发明的一些具体实施方案中，所述订书钉链的核苷酸序列如SEQ ID No.1～216所示。
在本发明的一些具体实施方案中，所述捕获链的核苷酸序列如SEQ ID No.217～258所示。
在本发明的一些具体实施方案中，所述DNA修饰的待负载药物与DNA折纸筏的摩尔比不小于5:1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述巯基修饰的DNA与所述IFN-α的摩尔比大于50:1；
所述订书钉链与所述M 13mp 18DNA单链的摩尔比大于50:1；
所述捕获链与所述M 13mp 18DNA单链的摩尔比大于100:1。
在本发明的一些具体实施方案中，所述待负载药物包括IFN-α。
本发明还提供了所述的负载药物的DNA折纸筏在制备缓释药物中的应用。
本发明还提供了所述负载药物的DNA折纸筏的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、制备DNA修饰的待负载药物：
取所述IFN-α溶于溶剂中；
取IFN-α溶液与50倍过量的SPDP在缓冲液中反应，脱盐除去过量的SPDP；
取SPDP修饰的IFN-α与巯基修饰的DNA链偶联；
步骤2、制备DNA折纸筏：取M 13mp 18DNA单链与50倍摩尔过量的订书钉链和100倍摩尔过量的捕获链混合；
步骤3、制备负载药物的DNA折纸筏：取所述DNA折纸筏与5倍摩尔过量的所述DNA修饰的待负载药物混合。
此外，本发明还提供了缓释药物，包括所述负载药物的DNA折纸筏，以及药学上可接受的辅料。
本发明利用DNA纳米技术，将IFN-α精确定量的负载于DNA折纸筏上，使载药量高度可控，并且使IFN-α缓慢释放。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明实施例1中DNA修饰INF-α的示意图及吡啶-2-硫酮(消光系数：8080M-1cm-1)的紫外-可见光谱图；其中，图1a示DNA-INF-α的制备的示意图；图1b示反应前后吡啶-2-硫酮的紫外-可见光谱图；
图2示细胞因子在DNA折纸筏上的装载高度可控，精确到每个结合点；其中，图2a示DAN折纸筏的示意图及对应的形貌表征图；图2b示DNA折纸筏对应的高度图；
图3示本发明实施例3中基于DNA折纸筏的IFN-α缓释；其中图3a示DNA折纸筏释放IFN的示意图；图3b示IFN-α在尿液中随时间的共定位效率分析图；图3c示图3b图中对应的红色荧光与绿色荧光的强度随时间减弱以及红绿荧光共定位效率下降。
具体实施方式
本发明公开了负载药物的DNA折纸筏及其制备方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明以IFN-α为例，公开了一种基于DNA折纸筏的细胞因子药物合成方法，包括如下步骤：
(1)备料：准备DNA单链(M 13mp 18DNA单链，订书钉链，捕获链)，巯基修饰的DNA(SH-DNA)，重组IFN-α，3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)，1xTAE-Mg2+缓冲液。
(2)DNA-IFN-α的制备，通过超滤管分离提纯，并通过紫外-可见质光谱来表征制备效率；
(3)DNA折纸筏的合成，通过PCR合成带有与步骤(1)中DNA互补的捕获链。通过超滤管分离提纯。
(4)DNA折纸筏的组装合成，将步骤(1)的DNA-IFN-α和步骤(2)中的DNA折纸筏混合，组装合成DNA折纸筏，通过超滤管分离提纯，通过荧光共定位表征组合效率；
所述步骤(1)中的超滤管为30kD截止滤膜(Amicon)；
所述步骤(3)和步骤(4)中的超滤管为100kD截止滤膜(Amicon)。
表1本发明实施例2中合成DNA折纸筏所需的订书钉链的序列(5’-3’)
表2本发明实施里2中合成DNA折纸筏所需的捕获链的序列(5’-3’)
本发明的有益效果包括但不限于：
本发明利用DNA纳米技术，将IFN-α精确定量的负载于DNA折纸筏上，使载药量高度可控，并且使IFN-α缓慢释放。
本发明提供的负载药物的DNA折纸筏及其制备方法、应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 DNA-IFN-α的制备
将100μg的IFN-α粉末溶解在50μL的NaCl溶液中。使50μL的6.6μM IFN-α溶液与50倍过量的SPDP在1x PBS缓冲液(pH 8.5)中反应2小时。通过Zeba旋转脱盐柱(7K MWCO，0.5mL)除去过量的SPDP。然后，将IFN-α与巯基修饰的DNA链(过量3倍)在1x PBS缓冲液(pH7.4)中在室温下偶联8小时。通过监测由于吡啶-2-硫酮的生成(消光系数：8080M-1cm-1)引起的UV-vis光谱在343nm处的净增加来评估HS-DNA修饰IFN-α的效率。在1x PBS(pH＝7.4)中，用30kD截止滤膜(Amicon)超滤(3000g，10分钟)3次，去除多余的SH-DNA链。
实施例2 DNA折纸筏的合成
在1x TAE-Mg2+缓冲液中，将10nM的M 13mp 18DNA单链与50倍过量的订书钉链和100倍过量的捕获链混合。将混合物从95℃退火至4℃。
表3从95℃退火至4℃的退火程序
温度
梯度
95℃
2min
95-60℃
-0.1℃/12s
60℃
12min
60-25℃
-0.1℃/12s
4℃
保持
在1xTAE-Mg2+缓冲液中用100kD超滤管(Amicon)进行超滤(3000g，10分钟)两次，然后在1xPBS(pH＝7.4)中超滤一次(3000g，10分钟)，除去过量的订书钉链和捕获链。
实施例3 DNA折纸筏的组装合成
在室温下，将5倍摩尔过量的DNA修饰的IFN-α与DNA折纸在PBS(pH＝7.4)中混合至少2h。然后用1x PBS(pH＝7.4)超滤(超滤管为100kD截止滤膜Amicon)3次，去除过量的IFN-α后，得到DNA折纸筏-细胞因子药物。通过琼脂糖凝胶电泳表征DNA折纸筏的组装。用IFN-α标记Alexa488，DNA折纸筏标记Cy5，用全内反射荧光显微镜表征其组合效率。
效果例1
SPDP通过IFN-α表面的氨基与巯基DNA中的巯基将DNA与IFN-α连接在一起。若DNA成功修饰到IFN-α表面，则会生成吡啶-2-硫酮。吡啶-2-硫酮在343纳米处有强吸收峰，通过检测吡啶-2-硫酮的生成，以确定DNA成功修饰到IFN-α表面。
步骤：将100μg的IFN-α粉末溶解在50μL的NaCl溶液中。使50μL的6.6μM IFN-α溶液与50倍过量的SPDP在1x PBS缓冲液(pH 8.5)中反应2小时。通过Zeba旋转脱盐柱(7K MWCO，0.5mL)除去过量的SPDP。然后，将IFN-α与巯基修饰的DNA链(过量3倍)在1x PBS缓冲液(pH7.4)中混合均匀并在室温下偶联8小时。用UV-Vis分光光谱仪检测上述混合溶液反应前后的光谱，发现在反应8小时后，混合溶液在343nm处出现吸收峰，表明生成了吡啶-2-硫酮，间接证明了DNA成功修饰到IFN-α表面。
效果例2
步骤：将10nM的M 13mp 18DNA与50倍摩尔过量的订书钉链和100倍摩尔过量的不同数量的捕获链(0条，21条或42条)在1x TAE-Mg2+缓冲液中混合均匀，并在PCR中由95℃至4℃退火合成DNA折纸筏。然后将上述混合溶液用100kD超滤管(Amicon)在1xTAE-Mg2+缓冲液中超滤两次，并在1x PBS(pH＝7.4)中超滤一次(3000g，10分钟)。接着将5倍过量的DNA-IFN-α与合成的带有不同数量的捕获链的DNA折纸在1xTAE-Mg2+缓冲液中混合均匀，然后在室温下静置2小时。在1xTAE-Mg2+缓冲液中用100kD超滤管(Amicon)进行超滤(3000g，10分钟)两次，然后在1x PBS(pH＝7.4)中超滤一次(3000g，10分钟)，除去过量的订书钉链和捕获链。将5μl，浓度为2nM的DNA折纸滴在云母表面，吸附5分钟。然后用原子力显微镜(AFM)进行扫描，获得DNA折纸筏的形貌图，并通过原子力显微镜自带软件分析纳米筏的高度。
如图2a所示，通过调控捕获链的数量，可以精确控制IFN-α负载于DNA折纸表面的数目。
效果例3
步骤：用Cy5标记DNA折纸筏，Alexa488标记负载于DNA折纸筏表面的IFN-α，然后与小鼠尿液孵育，用全内反射荧光显微镜分别在孵育0，12，24，36，48小时后进行成像。如图3a所示，随着孵育时间增长，Cy5与Alexa488的荧光点逐渐由重合到分离，两者逐渐从DNA折纸筏中释放出来。如图3c所示，红色荧光与绿色荧光逐渐减弱，两者的共定位效率逐渐降低，表明Cy5与Alexa-488逐渐从DNA折纸筏中释放出来，间接证明IFN-α能够从DNA折纸筏中在缓慢释放。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 四川大学华西医院
<120> 负载药物的DNA折纸筏及其制备方法、应用
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<212> DNA
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<211> 32
<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 174
tttcaactat aggctggctg accttgtatc at 32
<210> 175
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 175
ccaggcgctt aatcattgtg aattacaggt ag 32
<210> 176
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 176
cgcctgatgg aagtttccat taaacataac cg 32
<210> 177
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 177
tttcatgaaa attgtgtcga aatctgtaca ga 32
<210> 178
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 178
atatattctt ttttcacgtt gaaaatagtt ag 32
<210> 179
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 179
aataataagg tcgctgaggc ttgcaaagac tt 32
<210> 180
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 180
cgtaacgatc taaagttttg tcgtgaattg cg 32
<210> 181
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 181
acccaaatca agttttttgg ggtcaaagaa cg 32
<210> 182
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 182
tggactccct tttcaccagt gagacctgtc gt 32
<210> 183
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 183
tggtttttaa cgtcaaaggg cgaagaacca tc 32
<210> 184
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 184
gccagctgcc tgcaggtcga ctctgcaagg cg 32
<210> 185
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 185
cttgcatgca ttaatgaatc ggcccgccag gg 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 186
attaagttcg catcgtaacc gtgcgagtaa ca 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 187
tagatggggg gtaacgccag ggttgtgcca ag 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 188
acccgtcgtc atatgtaccc cggtaaaggc ta 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 189
catgtcaaga ttctccgtgg gaaccgttgg tg 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 190
tcaggtcact tttgcgggag aagcagaatt ag 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 191
ctgtaatatt gcctgagagt ctggaaaact ag 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 192
caaaattaaa gtacggtgtc tggaagaggt ca 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 193
tgcaactaag caataaagcc tcagttatga cc 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 194
tttttgcgca gaaaacgaga atgaatgttt ag 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 195
aaacagttga tggcttagag cttatttaaa ta 32
<210> 196
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 196
actggataac ggaacaacat tattacctta tg 32
<210> 197
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 197
acgaactagc gtccaatact gcggaatgct tt 32
<210> 198
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 198
cgattttaga ggacagatga acggcgcgac ct 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 199
ctttgaaaag aactggctca ttatttaata aa 32
<210> 200
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 200
gctccatgag aggctttgag gactagggag tt 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 201
acggctactt acttagccgg aacgctgacc aa 32
<210> 202
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 202
aaaggccgaa aggaacaact aaagctttcc ag 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 203
gagaatagct tttgcgggat cgtcgggtag ca 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 204
acgttagtaa atgaattttc tgtaagcgga gt 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 205
ttttcgatgg cccactacgt aaaccgtc 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 206
tatcagggtt ttcggtttgc gtattgggaa cgcgcg 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 207
gggagaggtt tttgtaaaac gacggccatt cccagt 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 208
cacgacgttt ttgtaatggg ataggtcaaa acggcg 36
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 209
gattgacctt ttgatgaacg gtaatcgtag caaaca 36
<210> 210
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 210
agagaatctt ttggttgtac caaaaacaag cataaa 36
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 211
gctaaatctt ttctgtagct caacatgtat tgctga 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 212
atataatgtt ttcattgaat ccccctcaaa tcgtca 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 213
taaatatttt ttggaagaaa aatctacgac cagtca 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 214
ggacgttgtt tttcataagg gaaccgaaag gcgcag 36
<210> 215
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 215
acggtcaatt ttgacagcat cggaacgaac cctcag 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 216
cagcgaaaat tttactttca acagtttctg ggattttgct aaactttt 48
<210> 217
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 217
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttgcataaa gttccacaca acatacgaag 60
cgcca 65
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 218
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actat 65
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 219
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttctcatct tgaggcaaaa gaatacagtg 60
aattt 65
<210> 220
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 220
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttgaatagc cgcaagcggt ccacgctcct 60
aatga 65
<210> 221
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 221
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttggcgatc gcactccagc cagctttgcc 60
atcaa 65
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 222
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttaccgttc taaatgcaat gcctgagagg 60
tggca 65
<210> 223
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 223
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttgaagcaa aaaagcggat tgcatcagat 60
aaaaa 65
<210> 224
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 224
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttacgagta gtgacaagaa ccggatatac 60
caagc 65
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 225
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttcaatgac actccaaaag gagccttaca 60
acgcc 65
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 226
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttgtaaagc actaaatcgg aaccctagtt 60
gttcc 65
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 227
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttactgccc gccgagctcg aattcgttat 60
tacgc 65
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 228
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttctttcat ccccaaaaac aggaagaccg 60
gagag 65
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 229
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttcaataaa tacagttgat tcccaattta 60
gagag 65
<210> 230
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 230
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt ttttttgcca gatcagttga gatttagtgg 60
tttaa 65
<210> 231
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 231
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttcgcctga tggaagtttc cattaaacat 60
aaccg 65
<210> 232
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 232
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt ttttggactc ccttttcacc agtgagacct 60
gtcgt 65
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 233
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttattaagt tcgcatcgta accgtgcgag 60
taaca 65
<210> 234
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 234
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt ttttcaggtc acttttgcgg gagaagcaga 60
attag 65
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 235
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt ttttttttgc gcagaaaacg agaatgaatg 60
tttag 65
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 236
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttcgatttt agaggacaga tgaacggcgc 60
gacct 65
<210> 237
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 237
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttaaaggcc gaaaggaaca actaaagctt 60
tccag 65
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<400> 238
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<211> 65
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<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 239
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttatcggct gcgagcatgt agaaacctat 60
catat 65
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 240
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttcgacaac taagtattag actttacaat 60
accga 65
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 241
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttctgaaac aggtaataag ttttaacccc 60
tcaga 65
<210> 242
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 242
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttgacttga gagacaaaag ggcgacaagt 60
tacca 65
<210> 243
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 243
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttattattt aacccagcta caattttcaa 60
gaacg 65
<210> 244
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 244
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttacgctca aaataagaat aaacaccgtg 60
aattt 65
<210> 245
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 245
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttcctgatt gaaagaaatt gcgtagaccc 60
gaacg 65
<210> 246
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 246
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttaggcggt cattagtctt taatgcgcaa 60
tatta 65
<210> 247
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 247
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttccctcag aaccgccacc ctcagaactg 60
agact 65
<210> 248
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 248
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttcaccaga gttcggtcat agcccccgcc 60
agcaa 65
<210> 249
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 249
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttataccca agataaccca caagaataaa 60
cgatt 65
<210> 250
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 250
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttcaagcaa gacgcgcctg tttatcaaga 60
atcgc 65
<210> 251
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 251
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt ttttaacctc catatgtgag tgaataaaca 60
aaatc 65
<210> 252
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 252
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttattttgc gtctttagga gcactaagca 60
acagt 65
<210> 253
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 253
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt ttttgctcag tcagtctctg aatttaccag 60
gaggt 65
<210> 254
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 254
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttccggaaa cacaccacgg aataagtaag 60
actcc 65
<210> 255
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 255
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttctttaca gttagcgaac ctcccgacgt 60
aggaa 65
<210> 256
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 256
tgagatgata agtggattgg agtagaagtt tttagaggca taatttcatc ttctgactat 60
aacta 65
<210> 257
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 257
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aggag 65
<210> 258
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence;)
<400> 258
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cgtct 65