一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法
阅读说明：本技术 一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法 (Adipose-derived mesenchymal stem cell osteogenesis inducing composition and osteogenesis inducing method ) 是由 辛江江 张坤 于 2021-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物,由以下原料组成：基础培养基、β-甘油磷酸二钠、磷酸铁锂、纳米硒化铋、泡桐素、成纤维细胞生长因子、重组胰岛素。本发明提供的组合物添加磷酸铁锂、纳米硒化铋以及泡桐素等成分,能有效提高细胞的成骨增殖分化效率。其中添加的磷酸铁锂、纳米硒化铋提高了脂肪间充质干细胞成骨分化信号活性,能有效促进细胞的成骨分化。泡桐素和成纤维细胞生长因子、重组胰岛素一起促进成骨细胞增殖,缩短细胞分化时间。本发明还提供一种脂肪间充质干细胞成骨诱导方法,采用本发明提供的组合物可以高效稳定的对脂肪间充质干细胞进行成骨诱导分化,保障了脂肪间充质干细胞在骨组织工程中的应用。(The invention discloses an adipose-derived mesenchymal stem cell osteogenesis inducing composition, which consists of the following raw materials: a basic culture medium, beta-disodium glycerophosphate, lithium iron phosphate, nano bismuth selenide, paulownin, a fibroblast growth factor and recombinant insulin. The composition provided by the invention is added with lithium iron phosphate, nano bismuth selenide, paulownin and other components, so that the osteogenic proliferation and differentiation efficiency of cells can be effectively improved. The added lithium iron phosphate and nano bismuth selenide improve the osteogenic differentiation signal activity of the adipose-derived mesenchymal stem cells, and can effectively promote the osteogenic differentiation of the cells. Paulownin, fibroblast growth factor and recombinant insulin promote osteoblast proliferation and shorten cell differentiation time. The invention also provides an adipose-derived mesenchymal stem cell osteogenesis induction method, and the composition provided by the invention can efficiently and stably carry out osteogenesis induced differentiation on adipose-derived mesenchymal stem cells, thereby ensuring the application of the adipose-derived mesenchymal stem cells in bone tissue engineering.)
技术领域
本发明涉及一种成骨诱导组合物，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法。
背景技术
干细胞是机体各个组织和器官的最初来源，具有增殖及分化的能力，随着医疗技术的快速发展，其在细胞移植，组织工程以及再生医学方面发挥了重要作用。尤其骨组织工程是组织工程领域中发展最为快速的学科，干细胞则是组织工程的主要种子细胞。
脂肪间充质干细胞是干细胞中优势较明显的一种细胞。脂肪组织是最容易获取的间充质干细胞来源。脂肪组织中含有大量未分化的干细胞，且储量丰富。相对于骨髓间充质干细胞，脂肪来源的间充质干细胞可以取材于抽脂术或外科手术中弃去的皮下脂肪，取材方便、来源广泛，不涉及社会和道德伦理等方面的争议。脂肪间充质干细胞在不同的条件下可被成功诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞等中胚层细胞，是组织工程的理想种子细胞。
然而，目前脂肪间充质干细胞的成骨诱导也存在普通干细胞常见的一些问题，比如成骨诱导率低，操作复杂，周期长，易引起机体的不良反应等，这些问题都极大程度的限制了脂肪间充质干细胞在临床上的广泛应用。因此，有必要研究一种安全高效的针对脂肪间充质干细胞的成骨诱导剂及诱导方法，促进脂肪间充质干细胞在骨组织工程中的应用。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，有效提高诱导效率，缩短分化时间。
本发明的目的之二在于提供一种脂肪间充质干细胞成骨诱导方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，由以下原料组成：基础培养基、β-甘油磷酸二钠、磷酸铁锂、纳米硒化铋、泡桐素、成纤维细胞生长因子、重组胰岛素。
进一步地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
进一步地，以终浓度计，各组分在培养基中的浓度为：β-甘油磷酸二钠1-5ng/mL、磷酸铁锂0.5-1.8ng/mL、纳米硒化铋2.5-4.5 ng/mL、泡桐素3-5 ng/mL、成纤维细胞生长因子5-10μg/mL、重组胰岛素1-5μg/mL。
进一步地，以终浓度计，各组分在培养基中的浓度为：β-甘油磷酸二钠3ng/mL、磷酸铁锂1.2ng/mL、纳米硒化铋3ng/mL、泡桐素4 ng/mL、成纤维细胞生长因子8μg/mL、重组胰岛素3μg/mL。
进一步地，所述纳米硒化铋的平均粒径为100-200nm。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种脂肪间充质干细胞的成骨诱导方法，采用上述组合物诱导培养脂肪间充质干细胞，得到成骨细胞。
进一步地，所述脂肪间充质干细胞为P3代细胞。
进一步地，所述脂肪间充质干细胞在组合物中的浓度为1-5×104个/mL。
进一步地，诱导培养条件为：在37℃，5%CO2的培养箱进行，时间为10-12d。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，在该组合物中添加磷酸铁锂、纳米硒化铋以及泡桐素等成分，能有效提高细胞的成骨增殖分化效率。其中添加的磷酸铁锂、纳米硒化铋提高了脂肪间充质干细胞成骨分化信号活性，能有效促进脂肪间充质干细胞的成骨分化，提高成骨分化的效率。泡桐素和成纤维细胞生长因子、重组胰岛素一起促进成骨细胞增殖，缩短细胞分化时间。
本发明还提供一种脂肪间充质干细胞成骨诱导方法，采用本发明提供的组合物可以高效稳定的对脂肪间充质干细胞进行成骨诱导分化，保障了脂肪间充质干细胞在骨组织工程中的应用。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1至3中所用P3代脂肪间充质干细胞通过以下方法制备得到：
（1）将离体的脂肪组织用PBS清洗后加入1%Ⅱ型胶原酶振荡消化；
（2）将步骤（1）完成消化的溶液1000rpm离心15min，留取底层的细胞沉淀；
（3）向步骤（2）的细胞沉淀中加入培养基（DMEM/F12＋10%FBS）重悬，在培养皿中培养至细胞融合度达到80-90%后去除培养液上清，加入PBS洗涤一遍后，再加入0.25%胰酶消化，至细胞脱落后加入DMEM/F12培养基终止消化，离心后再次加入培养基（DMEM/F12＋10%FBS）重悬细胞，细胞密度为1×104个/mL，接种于T75培养瓶中以1:3的比例进行传代培养，取P3代细胞进行实验。
实施例1
一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、β-甘油磷酸二钠、磷酸铁锂、纳米硒化铋、泡桐素、成纤维细胞生长因子、重组胰岛素；以终浓度计，各组分在培养基中的浓度为：β-甘油磷酸二钠3ng/mL、磷酸铁锂1.2ng/mL、平均粒径为100nm的纳米硒化铋3ng/mL、泡桐素4 ng/mL、成纤维细胞生长因子8μg/mL、重组胰岛素3μg/mL。
一种脂肪间充质干细胞的成骨诱导方法，包括以下过程：取培养得到的P3代脂肪间充质干细胞加入成骨诱导组合物，细胞密度为1×104个/mL，在6孔板中诱导分化，诱导分化过程在37℃，5%CO2的培养箱中进行，每两天换液一次，连续诱导10d。
实施例2
一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、β-甘油磷酸二钠、磷酸铁锂、纳米硒化铋、泡桐素、成纤维细胞生长因子、重组胰岛素；以终浓度计，各组分在培养基中的浓度为：β-甘油磷酸二钠1ng/mL、磷酸铁锂0.5ng/mL、平均粒径为150nm的纳米硒化铋2.5 ng/mL、泡桐素3 ng/mL、成纤维细胞生长因子5μg/mL、重组胰岛素1μg/mL。
一种脂肪间充质干细胞的成骨诱导方法，包括以下过程：取培养得到的P3代脂肪间充质干细胞加入成骨诱导组合物，细胞密度为3×104个/mL，在6孔板中诱导分化，诱导分化过程在37℃，5%CO2的培养箱中进行，每两天换液一次，连续诱导12d。
实施例3
一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，由以下原料组成：DMEM/F12培养基、β-甘油磷酸二钠、磷酸铁锂、纳米硒化铋、泡桐素、成纤维细胞生长因子、重组胰岛素；以终浓度计，各组分在培养基中的浓度为：β-甘油磷酸二钠5ng/mL、磷酸铁锂1.8ng/mL、平均粒径为200nm的纳米硒化铋4.5 ng/mL、泡桐素5 ng/mL、成纤维细胞生长因子10μg/mL、重组胰岛素5μg/mL。
一种脂肪间充质干细胞的成骨诱导方法，包括以下过程：取培养得到的P3代脂肪间充质干细胞加入成骨诱导组合物，细胞密度为5×104个/mL，在6孔板中诱导分化，诱导分化过程在37℃，5%CO2的培养箱中进行，每两天换液一次，连续诱导11d。
对比例1
对比例1提供一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，和实施例1的区别为：省去磷酸锂铁，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，和实施例1的区别为：将磷酸锂铁替换为磷酸锂，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，和实施例1的区别为：省去纳米硒化铋，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，和实施例1的区别为：将纳米硒化铋替换为铁酸铋，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，和实施例1的区别为：将纳米硒化铋替换为氧化铋，其余均和实施例1相同。
对比例6
对比例6提供一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，和实施例1的区别为：将纳米硒化铋替换为纳米硒，其余均和实施例1相同。
对比例7
对比例7提供一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，和实施例1的区别为：省去磷酸锂铁，将纳米硒化铋的用量调整为4.2ng/ mL其余均和实施例1相同。
对比例8
对比例8提供一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物，和实施例1的区别为：省去泡桐素，其余均和实施例1相同。
分别将实施例1，对比例1至8中诱导分化培养10d的细胞弃去培养基， PBS清洗后，用40g/L的多聚甲醛在常温下固定10min，弃去多聚甲醛，再次用 PBS清洗后用1g/L的茜素红室温染色25min，弃去染色液，PBS洗涤后在倒置显微镜下观察染色情况，统计钙化面积百分比，结果如表1所示。
表1
组别
钙化面积（%）
实施例1
69.72
对比例1
43.51
对比例2
47.29
对比例3
40.05
对比例4
49.27
对比例5
46.62
对比例6
51.14
对比例7
48.39
对比例8
53.96
分别取实施例1，对比例1至8中诱导分化培养2d、5d、8d、10d的细胞，将细胞裂解于pH7.4的Tris-HCl缓冲液中，12000r/min离心5min，收集上清液，采用ALP试剂盒检测各组细胞的ALP活性，结果如表2所示。
表2
组别
2d
5d
8d
10d
实施例1
0.37
0.54
0.67
0.79
对比例1
0.19
0.31
0.43
0.50
对比例2
0.21
0.32
0.45
0.54
对比例3
0.15
0.26
0.38
0.47
对比例4
0.23
0.35
0.49
0.61
对比例5
0.20
0.31
0.43
0.52
对比例6
0.25
0.37
0.51
0.64
对比例7
0.22
0.34
0.47
0.58
对比例8
0.28
0.41
0.55
0.67
由表1和表2可以看出实施例1中钙化面积较大，ALP的活性较高，说明实施例1中诱导分化得到的成骨细胞较多。
在对比例1中省去了组合物中的磷酸锂铁，对比例2中将磷酸锂铁替换为磷酸锂，对比例1的钙化面积以及ALP活性下降更为显著，说明本发明在组合物中添加磷酸锂铁能有效促进脂肪间充质干细胞的成骨分化，经添加上述成分的组合物培养后获得的成骨细胞更多。将磷酸锂铁替换为磷酸锂后，钙化面积和ALP活性和对比例1相比有轻微提高，但是和实施例1相比还是有一定差距，说明磷酸锂的诱导效果不及磷酸锂铁。
对比例3中省去了纳米硒化铋，对比例4中将纳米硒化铋替换为铁酸铋，对比例5中将纳米硒化铋替换为氧化铋，对比例6中将纳米硒化铋替换为纳米硒，由表1和表2可知，对比例3至6在诱导分化效果上均不及实施例1。说明本发明添加的纳米硒化铋对促进脂肪间充质干细胞的成骨分化效果较好，显著提高了钙化面积和ALP的活性。对比例7中省去磷酸锂铁后即使增加纳米硒化铋的用量，细胞的成骨分化效果也不及实施例1，说明两种成分协同作用提高脂肪间充质干细胞成骨分化的效率。
对比例8中省去了泡桐素，钙化面积和ALP活性也有不同程度的下降。这是因为泡桐素的加入可以促进成骨细胞增殖，提高成骨细胞数量，缩短细胞分化时间。
综上，本发明的组合物中通过添加磷酸铁锂、纳米硒化铋以及泡桐素等成分，促进脂肪间充质干细胞的成骨分化，有效提高细胞的成骨增殖分化效率。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种无动物源性脐带间充质干细胞的培养方法