一种高表达afgf的方法
阅读说明：本技术 一种高表达afgf的方法 (Method for highly expressing AFGF ) 是由 袁春梅 姜粉军 常二凤 周慧 杨铭斌 刘杨 姜宁健 王培申 于 2021-09-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高表达AFGF的方法,该方法为：细胞生长到密度为95％时进行传代；吸出培养液,加入生理盐水并晃动,弃生理盐水；加入胰酶消化,使细胞全部悬浮,加入培养基终止消化；吸取细胞悬液放入离心管离心,弃上清,加入生理盐水,吸取一滴细胞计数,离心弃生理盐水,用培养基悬细胞加入含培养基的培养瓶中；加入胞壁酰二肽进行诱导；传代结束的培养瓶放入低温低氧的培养箱中进行培养。本发明的高表达AFGF的方法利用低温低氧环境使得骨髓细胞高表达AFGF,从而获得更多的AFGF；该方法具有高效、简单、稳定性好的优点。(The invention discloses a method for highly expressing AFGF, which comprises the following steps: when the cells grow to the density of 95%, passage is carried out; sucking out the culture solution, adding normal saline, shaking, and discarding the normal saline; adding pancreatin for digestion to make the cells completely suspended, and adding culture medium to stop digestion; sucking the cell suspension, placing the cell suspension into a centrifuge tube for centrifugation, discarding the supernatant, adding physiological saline, sucking a drop of cell for counting, centrifuging, discarding the physiological saline, suspending the cells by using a culture medium, and adding the suspended cells into a culture bottle containing the culture medium; adding muramyl dipeptide for induction; and (5) placing the culture bottle after the passage into a low-temperature and low-oxygen incubator for culture. The method for highly expressing AFGF utilizes a low-temperature hypoxia environment to enable bone marrow cells to highly express AFGF, so that more AFGF is obtained; the method has the advantages of high efficiency, simplicity and good stability.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体来说，涉及一种高表达AFGF的方法。
背景技术
酸性成纤维生长因子(AFGF)是一种多功能强力细胞因子，对促进成纤维细胞的代谢和胶原蛋白的形成发挥着重要功能。AFGF能促进皮肤组织的生长繁殖，它通过与细胞表面特异受体结合，调控皮肤上皮、内皮和基质细胞的分裂、繁殖和生长分化，促进细胞代谢，增强氧化作用；能促进与皮肤损伤有关细胞的迅速生长繁殖，并调节细胞间基质的合成、分泌及分解；能促进角质层细胞的再生，加速皮肤角质层和基质层的修复，促进人体皮肤细胞的生长；能增强皮肤细胞的蛋白质的合成和细胞代谢，具有延缓皮肤细胞衰老、促进表皮细胞的修复和生长作用，使皮肤光滑丰润。
专利CN102344930A公开了一种酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)的简便化工业技术，通过体外PCR扩增的方法，从人来源的hepG2的eDNA中扩增得到aFGF基因，并通过NdeI和EcoRI限制性酶切位点与表达载体pET-26b连接，随后将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)获得高效可溶表达，获得天然结构的酸性成纤维细胞生长因子蛋白。但是该方法存在操作复杂的缺陷。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种高表达AFGF的方法，能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种高表达AFGF的方法，该方法包括以下步骤：
S1骨髓细胞生长到密度为95％时进行传代；
S2吸出培养液，加入生理盐水并晃动，弃生理盐水；
S3加入胰酶，室温消化，使细胞全部悬浮，加入培养基，终止消化；
S4吸取细胞悬液放入离心管离心；
S5离心后弃上清，加入生理盐水，吸取一滴细胞计数，离心；
S6离心后弃生理盐水，用培养基悬细胞加入含培养基的培养瓶中；
S7向所述培养瓶中加入10-10000ng/mL胞壁酰二肽(Muramyldipeptide，MDP)进行诱导；
S8将S7中传代结束的培养瓶放入低温低氧的培养箱中进行培养。
优选地，S4中离心的时间为5min，转速为1500rpm。
优选地，S5中离心的时间为5min，转速为1500rpm。
优选地，S7所述培养瓶中胞壁酰二肽的最终浓度为6000ng/mL。
优选地，所述低温低氧的培养箱为20-36℃，5％-40％的氧气的培养箱。
优选地，所述培养基为α-MEM培养基。
优选地，所述培养基为含10％血清替代物的α-MEM培养基。
本发明的有益效果：本发明的高表达AFGF的方法利用低温低氧环境使得骨髓细胞高表达AFGF，从而获得更多的AFGF；该方法具有高效、简单、稳定性好的优点。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
S1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
S2吸出培养液，加入15mL生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
S3培养瓶加入胰酶3mL，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α-MEM培养基(含血清替代物10％)5mL，终止消化；
S4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
S5离心后，弃上清，加入生理盐水45mL，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
S6弃生理盐水，用2mL培养基悬细胞加入到已加入培养基的150培养瓶中；
S7加入2000ng/mL MDP进行诱导；
S8将已传代结束的培养瓶放入低温低氧的培养箱(20℃/5％的氧气培养箱)中；
S9 24h后取上清，通过ELISA试剂盒，检测AFGF因子含量是否提高，检测结果见表1。
实施例2
S1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
S2吸出培养液，加入15mL生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
S3培养瓶加入胰酶3mL，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α-MEM培养基(含血清替代物10％)5mL，终止消化；
S4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
S5离心后，弃上清，加入生理盐水45mL，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
S6弃生理盐水，用2mL培养基悬细胞加入到已加入培养基的150培养瓶中；
S7加入4000ng/mL MDP进行诱导；
S8将已传代结束的培养瓶放入低温低氧的培养箱(24℃/8％的氧气培养箱)中；
S9 24h后取上清，通过ELISA试剂盒，检测AFGF因子含量是否提高，检测结果见表1。
实施例3
S1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
S2吸出培养液，加入15mL生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
S3培养瓶加入胰酶3mL，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α-MEM培养基(含血清替代物10％)5mL，终止消化；
S4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
S5离心后，弃上清，加入生理盐水45mL，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
S6弃生理盐水，用2mL培养基悬细胞加入到已加入培养基的150培养瓶中；
S7加入6000ng/mL MDP进行诱导；
S8将已传代结束的培养瓶放入低温低氧的培养箱(28℃/10％的氧气培养箱)中；
S9 24h后取上清，通过ELISA试剂盒，检测AFGF因子含量是否提高，检测结果见表1。
实施例4
S1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
S2吸出培养液，加入15mL生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
S3培养瓶加入胰酶3mL，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α-MEM培养基(含血清替代物10％)5mL，终止消化；
S4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
S5离心后，弃上清，加入生理盐水45mL，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
S6弃生理盐水，用2mL培养基悬细胞加入到已加入培养基的150培养瓶中；
S7加入8000ng/mL MDP进行诱导；
S8将已传代结束的培养瓶放入低温低氧的培养箱(32℃/30％的氧气培养箱)中；
S9 24h后取上清，通过ELISA试剂盒，检测AFGF因子含量是否提高，检测结果见表1。
实施例5
S1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
S2吸出培养液，加入15mL生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
S3培养瓶加入胰酶3mL，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α-MEM培养基(含血清替代物10％)5mL，终止消化；
S4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
S5离心后，弃上清，加入生理盐水45mL，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
S6弃生理盐水，用2mL培养基悬细胞加入到已加入培养基的150培养瓶中；
S7加入10000ng/mL MDP进行诱导；
S8将已传代结束的培养瓶放入低温低氧的培养箱(36℃/40％的氧气培养箱)中；
S9 24h后取上清，通过ELISA试剂盒，检测AFGF因子含量是否提高，检测结果见表1。
表1实施例AFGF因子含量检测结果
条件
实施例1
实施例2
实施例3
实施例4
实施例5
温度℃
20
24
28
32
36
氧气％
5
8
10
30
40
MDP(ng/mL)
2000
4000
6000
8000
10000
AFGF(pg/mL)
55.71
70.23
118.86
88.11
50.56
对比例1
S1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
S2吸出培养液，加入15mL生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
S3培养瓶加入胰酶3mL，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α-MEM培养基(含血清替代物10％)5mL，终止消化；
S4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
S5离心后，弃上清，加入生理盐水45mL，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
S6弃生理盐水，用2mL培养基悬细胞加入到已加入与实施例1等量培养基的150培养瓶中；
S7加入2000ng/mL MDP进行诱导；
S8将已传代结束的培养瓶放入正常培养箱(37℃/5％的二氧化碳培养箱)中；
S9 24h后取上清，通过ELISA试剂盒，检测因子含量是否提高，检测结果见表2。
对比例2
S1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
S2吸出培养液，加入15mL生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
S3培养瓶加入胰酶3mL，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α-MEM培养基(含血清替代物10％)5mL，终止消化；
S4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
S5离心后，弃上清，加入生理盐水45mL，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
S6弃生理盐水，用2mL培养基悬细胞加入到已加入与实施例2等量培养基的150培养瓶中；
S7加入4000ng/mL MDP进行诱导；
S8将已传代结束的培养瓶放入正常培养箱(37℃/5％的二氧化碳培养箱)中；
S9 24h后取上清，通过ELISA试剂盒，检测因子含量是否提高，检测结果见表2。
对比例3
S1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
S2吸出培养液，加入15mL生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
S3培养瓶加入胰酶3mL，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α-MEM培养基(含血清替代物10％)5mL，终止消化；
S4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
S5离心后，弃上清，加入生理盐水45mL，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
S6弃生理盐水，用2mL培养基悬细胞加入到已加入与实施例3等量培养基的150培养瓶中；
S7加入6000ng/mL MDP进行诱导；
S8将已传代结束的培养瓶放入正常培养箱(37℃/5％的二氧化碳培养箱)中；
S9 24h后取上清，通过ELISA试剂盒，检测因子含量是否提高，检测结果见表2。
对比例4
S1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
S2吸出培养液，加入15mL生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
S3培养瓶加入胰酶3mL，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α-MEM培养基(含血清替代物10％)5mL，终止消化；
S4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
S5离心后，弃上清，加入生理盐水45mL，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
S6弃生理盐水，用2mL培养基悬细胞加入到已加入与实施例4等量培养基的150培养瓶中；
S7加入8000ng/mL MDP进行诱导；
S8将已传代结束的培养瓶放入正常培养箱(37℃/5％的二氧化碳培养箱)中；
S9 24h后取上清，通过ELISA试剂盒，检测因子含量是否提高，检测结果见表2。
对比例5
S1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
S2吸出培养液，加入15mL生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
S3培养瓶加入胰酶3mL，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α-MEM培养基(含血清替代物10％)5mL，终止消化；
S4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
S5离心后，弃上清，加入生理盐水45mL，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
S6弃生理盐水，用2mL培养基悬细胞加入到已加入与实施例5等量培养基的150培养瓶中；
S7加入10000ng/mL MDP进行诱导；
S8将已传代结束的培养瓶放入正常培养箱(37℃/5％的二氧化碳培养箱)中；
S9 24h后取上清，通过ELISA试剂盒，检测因子含量是否提高，检测结果见表2。
表2对比例AFGF因子含量检测结果
条件
对比例1
对比例2
对比例3
对比例4
对比例5
温度℃
37
37
37
37
37
二氧化碳％
5
5
5
5
5
MDP(ng/mL)
2000
4000
6000
8000
10000
AFGF(pg/mL)
25.33
25.67
26.43
25.83
24.12
由表1-2的数据可见，利用低温低氧环境能够使骨髓细胞高表达AFGF。
上述实施例及对比例中所述血清替代物的品牌为ThermoFisher，货号为：10828028。
综上所述，借助于本发明的上述技术方案，本发明的高表达AFGF的方法利用低温低氧环境使得骨髓细胞高表达AFGF，从而获得更多的AFGF；该方法具有高效、简单、稳定性好的优点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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