circRNA XPO4在人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化中的应用
阅读说明：本技术 circRNA XPO4在人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化中的应用 (Application of circRNA XPO4 in osteogenic differentiation of interstitial cells of human aortic valve ) 是由 王勇军 董念国 韩东 周廷文 史嘉玮 于 2021-07-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及circRNA XPO4在人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化中的应用。本发明通过高通量测序及生物信息学方法,对circRNA的差异表达进行识别和整合分析,发现人钙化主动脉瓣组织中存在复杂的竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)网络,然后通过高通量测序技术筛选正常及钙化主动脉瓣膜组织中差异circRNA表达,并结合生物信息学方法筛选出与人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化相关的miRNA(miRNA-204-5p)直接相关的circRNA XPO4。通过细胞功能试验,明确circRNA XPO4在人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化中起调节作用,可以促进人主动脉瓣膜间质细胞中成骨关键基因表达,从而诱导其成骨分化。(The invention relates to application of circRNA XPO4 in osteogenic differentiation of interstitial cells of a human aortic valve. The differential expression of circRNA is identified and integrated and analyzed by a high-throughput sequencing and bioinformatics method, a complex competitive endogenous RNA (ceRNA) network exists in human calcified aortic valve tissues, then the differential circRNA expression in normal and calcified aortic valve tissues is screened by a high-throughput sequencing technology, and the circRNA XP 4 directly related to miRNA (miRNA-204-5p) related to osteogenic differentiation of human aortic valve interstitial cells is screened by combining the bioinformatics method. Through cell function tests, the circRNA XPO4 is determined to play a regulating role in osteogenic differentiation of human aortic valve interstitial cells, and can promote the expression of osteogenic key genes in the human aortic valve interstitial cells so as to induce the osteogenic differentiation of the human aortic valve interstitial cells.)
技术领域
：本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种circRNA XPO4在人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化中的应用。
背景技术
：钙化主动脉瓣疾病(calcific aortic valve disease，CAVD)是一种高发病率和高死亡率的老年性进行性疾病，主要病理生理改变为主动脉瓣瓣叶纤维增生钙化从而导致瓣膜变硬并引起血流动力学改变，从而影响心脏功能。以往观点均认为CAVD是一种与年龄相关的退行性病变，是随着年龄增长，瓣膜组织的退化硬化过程。然而近年来的基础研究表明，CAVD是一种涉及内皮损伤，炎症细胞浸润、细胞外基质重塑以及瓣膜间质细胞成骨样分化等复杂病理改变的主动进展过程。瓣膜组织中的细胞主要包括瓣膜内皮细胞(Valvularendothelial cells,VEC)、瓣膜间质细胞(Valvular interstitial cells,VICs)、瓣膜前体细胞等，已有研究证实瓣膜间质细胞成骨样分化所导致的钙盐增多可能是瓣膜钙化发生的重要始动因素。目前，CAVD缺乏有效的临床可用药物治疗方案，其主要治疗手段为主动脉瓣置换手术。然而，接受外科手术的患者必然会承担较高的医疗手术风险及经济负担。因此，探究CAVD具体发病机制，采用非手术方法有效预防和/或治疗钙化性主动脉瓣疾病是目前临床治疗CAVD的迫切需求。
环状RNA(circRNA)是一类呈闭环结构且不受RNA外切酶影响的非编码RNA。因为其在真核生物体内广泛表达，稳定，物种间保守性好且不易被降解而成为近年来非编码RNA研究领域的热点。已有大量的研究表明环状RNA在动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病中扮演重要角色，其上述特点使得circRNA在新型疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有了非常广阔的前景。
目前已公开的瓣膜间质细胞成骨分化研究主要在转录和翻译水平调控机制，已经有许多miRNA被证实能够调控人瓣膜间质细胞成骨分化，如miR-204、miRNA-483-5p和miRNA-214。在本项目的相关研究中，通过生物信息学分析，对lncRNA和circRNA的差异表达进行识别和整合分析，发现钙化主动脉瓣膜组织中存在复杂的竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)网络。因此，特异性lncRNA和circRNA可能作为ceRNA调节人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化和影响主动脉瓣钙化疾病进展，并且通过寻找与miR-204功能相关的lncRNA进行验证，证实了lncRNA MALAT1通过与miR-204相互作用促进瓣膜间质细胞的成骨分化，而circRNA作为ceRNA调控瓣膜间质细胞的成骨分化机制的研究较少。
发明内容
：(一)解决的技术问题
针对上述背景，本发明对circRNA与主动脉瓣钙化及人瓣膜间质细胞成骨分化之间的关系展开研究，基于高通量测序技术，检测正常及钙化主动脉瓣膜组织中的差异表达circRNA，对差异表达基因中上调的TOP10 circRNA基因结合starbase数据库，预测筛选出与瓣膜间质细胞成骨分化相关miRNA miRNA-204-5p具有结合位点的circRNA XPO4。确认circRNA XPO4沉默后的人主动脉瓣膜间质细胞中成骨关键表达基因ALP(alkalinephosphatase)、Runx2(runt-related transcription factor 2)表达降低，茜素红阳性结节及钙盐沉积显著减少，证明circRNA XPO4对于人主动脉瓣膜间质细胞的成骨分化具有促进作用，为主动脉瓣钙化非手术治疗开辟更广阔的前景。
(二)技术方案
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明公开第一方面，提供circRNA XPO4作为人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化诱导剂的应用。
进一步地，所述应用包括circRNA XPO4作为人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化中ALP或Runx2激动剂的应用。
进一步地，所述circRNA XPO4为circBase中登记号为Hsa_circ_0100041的序列。
本发明公开第二方面，提供circRNA XPO4 siRNA沉默试剂作为人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化抑制剂的应用。
进一步地，所述circRNA XPO4沉默试剂包括circRNA XPO4 siRNA序列。其正义链核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；反义链核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
本发明公开第三方面，提供circRNA XPO4检测试剂在制备检测人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化水平试剂盒中的应用。
进一步地，所述circRNA XPO4检测试剂为PCR检测试剂，所述PCR检测试剂中包括一组引物序列，所述引物序列包括由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的DNA序列组成的引物对。
进一步地，所述引物序列中还包括内参引物，所述内参引物为β-actin，所述内参引物序列包括由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示序列组成的引物对。
本发明公开第四方面，提供circRNA XPO4作为人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化能力评判标志物的应用。
本发明公开第五方面，提供一种通过抑制人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化治疗主动脉瓣钙化的方法，所述方法通过将circRNA XPO4 siRNA转入人主动脉瓣膜间质细胞，治疗主动脉瓣钙化。
(三)有益效果
本发明产生的有益效果是：
(1)本发明通过检测人钙化主动脉瓣组织中的circRNA XPO4基因表达，证明其表达水平相比正常主动脉瓣组织显著升高，提示circRNA XPO4可作为钙化性主动脉瓣疾病的诊断标志物；
(2)本发明通过研究circRNA XPO4对人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的影响，证明过表达circRNA XPO4显著促进人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化，下调circRNA XPO4可明显抑制人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化能力，进一步明确了人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的机制，为以circRNA XPO4为靶点的抗主动脉瓣钙化治疗提供了新的思路。
附图说明
：为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是正常与钙化人主动脉瓣膜组织高通量测序差异表达circRNA基因热图结果。
图2是starbase数据库(http://www.starbase.sysu.edu.cn)，预测在主动脉瓣钙化组织中表达上调的TOP10 circRNA中筛选出circRNA XPO4与miRNA-204-5p存在结合位点。
图3是实施例一种QRT-PCR检测正常及钙化主动脉瓣膜组织中circRNA XPO4和β-actin的表达水平图；(NC:正常主动脉瓣膜，CAVs：钙化主动脉瓣膜)；
图4是实施例二中circRNA XPO4过表达质粒(B)及siRNA敲低(A)效能的验证结果；
图5是实施例三中，在人原代瓣膜间质细胞中转染circRNA XPO4特异性siRNA干扰circRNA XPO4基因后，随后用成骨分化诱导培养基培养14天后进行钙化相关标志蛋白(RUNX2,ALP)检测(图5A)，随后用成骨分化诱导培养基培养21天后行茜素红染色(图5B)，钙盐定量分析(图5C)结果图；
图6是实施例三中，在人原代瓣膜间质细胞中转染circRNA XPO4特异性过表达质粒，过表达circRNA XPO4基因后，随后用成骨分化诱导培养基培养14天后进行钙化相关标志蛋白(RUNX2,ALP)检测(图6A)，随后用成骨分化诱导培养基培养21天后行茜素红染色(图6B)，钙盐定量分析(图6C)结果图；
具体实施方式
：
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例一
采集正常与钙化主动脉瓣膜组织各4例，进行高通量测序，筛选正常与疾病组组织circRNA差异表达谱，见图1。
本实施例中，基于测序数据中在钙化主动脉瓣膜组织中表达上调的circRNA，得到如表1所示的10个circRNA。
表1.高通量circRNA测序筛选钙化瓣膜组织中表达上调Top10 circRNA
circBase数据库编号
差异表达变化倍数
NCBI转录本
基因名称
hsa_circ_0100041
18.56
NM_022459
XPO4
hsa_circ_0002268
12.55
NM_030948
PHACTR1
hsa_circ_0017995
10.50
NM_020200
PRTFDC1
hsa_circ_0002688
10.29
NM_007331
WHSC1
hsa_circ_0093546
9.66
NM_145023
CCDC7
hsa_circ_0032029
9.03
NM_004986
KTN1
hsa_circ_0114158
8.65
NM_015534
ZZZ3
hsa_circ_0016909
8.58
NM_020808
SIPA1L2
hsa_circ_0119637
8.52
NM_000183
HADHB
hsa_circ_0016443
8.42
NM_005401
PTPN14
通过starbase数据库结合人瓣膜组织测序数据，筛选出表达上调TOP10 circRNA中表达差异倍数最高，而且与主动脉瓣钙化相关miRNA miRNA-204-5p存在结合位点的目的circRNA。
基于starbase数据库(http://www.starbase.sysu.edu.cn)，预测与miRNA-204-5p相关的circRNA。
由图2可知，在主动脉瓣钙化组织中表达上调的TOP10 circRNA中筛选出circRNAXPO4与miRNA-204-5p存在结合位点，且在上调基因中排序第1位。
为了进一步验证circRNA XPO4，通过设计能扩增环状RNA的特异性引物，通过PCR技术在人主动脉瓣膜组织中对circRNA XPO4表达进行大样本qRT-PCR验证。qRT-PCR结果表明circRNA XPO4在钙化主动脉瓣组织中高表达，故可制作检测该基因表达变化的试剂盒以用于诊断主动脉瓣钙化。
具体实验方案如下：
1、RNA提取
1)组织处理：取50mg左右主动脉瓣膜组织，液氮研磨至满意后加入1ml Trizol试剂，震荡匀浆，充分裂解后，12000rpm，4℃离心15分钟，取上清液。
2)加入氯仿200ul，震荡混匀后室温放置15分钟。
3)4℃，12000rpm，离心15分钟，分三层，取上层水相至新的无酶EP管，加入等体积异丙醇，混匀室温放置10分钟，沉淀RNA。
4)4℃，12000rpm，离心15分钟，小心去掉上清液，RNA沉淀与管底。
5)按照每1ml Trizol加入1ml 75％乙醇，颠倒混匀。
6)4℃，8000g，离心5分钟,弃上清，室温晒干(5-10分钟)。
7)加入适量DEPC水溶解RNA，测定RNA浓度。根据定量结果进行逆转录。
8)RNA A260/A280＝1.8-2.1
2、cDNA逆转录
9)日本TAKARA公司试剂盒逆转录体系(10ul):
反应条件：37℃，15分钟逆转录反应；85℃，5s逆转录酶的失活反应；4℃，反应结束，产物为cDNA。
3、QRT-PCR上机扩增
1)实验体系：
2)反应条件：
95℃，2分钟；40个循环(95℃，10秒；60℃，60秒)；60-95℃溶解曲线。
3)上机扩增，反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，各基因表达强度根据CT值(threshold cycle values)、内参基因(β-actin)标化后，T检验计算P值。
4)QRT-PCR结果
结果见图3。在30例正常主动脉瓣膜组织及30例钙化主动脉瓣组织样本中检测circRNA XPO4的表达，结果显示与正常主动脉瓣组织相比，circRNA XPO4在钙化主动脉瓣膜组织中显著上调。
实施例二：circRNA XPO4小干扰RNA和过表达质粒构建
1、circRNA XPO4小干扰RNA设计：circRNA XPO4 siRNA序列由广州吉赛生物科技公司设计合成。circRNA XPO4的siRNA正义链序列如SEQ ID NO:6所示，反义链序列如SEQID NO:7所示。阴性对照组序列正义链和反义链分别如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。
2、pCD5-ciR载体过表达circRNA XPO4及人瓣膜间质细胞瞬时转染：合成circRNAXPO4线性全序列，序列退火成双链DNA片段通过多克隆位点插入到pCD5-ciR载体，重组质粒通过测序鉴定，对照组为pCD5-ciR空载体。
3、siRNA和过表达效能验证：
1)2-5代人瓣膜间质细胞接种至24孔板，37℃、5％CO2培养。
2)待细胞汇合密度至80％后开始转染，取0.5ug过表达质粒或5ul siRNA以及0.5ug内参质粒溶于250ul opti-MEM中，混匀。
3)1.5ul Lipofectamine 2000溶于250ul opti-MEM中，混匀。
4)两管试剂混合，室温静置20分钟，然后加入24孔板中，37℃、5％CO2培养。
5)6-8小时后更换完全培养基，继续培养。
6)48小时后收集细胞，QRT-PCR定量分析。
结果见图4。结果显示siRNA能有效降低circRNA XPO4表达，而过表达质粒能显著上调circRNA XPO4表达水平。
实施例三：敲低或过表达circRNA XPO4基因对人瓣膜间质细胞成骨分化能力的影响。
1、实验方法
1)种人瓣膜间质细胞于6孔板内，待细胞汇合度达到80％后，按照实施例二中方法，分别转染siRNA和过表达circRNA XPO4质粒。培养14天后收集细胞，行western blot检测钙化标志基因ALP、RUNX2蛋白表达变化。培养21天后，行茜素红染色、钙定量分析检测不同处理对瓣膜间质细胞成骨分化的影响。
2)瓣膜间质细胞成骨分化诱导方法：
待各组细胞转染24小时后，观察细胞汇合度，取培养密度90％左右的人瓣膜间质细胞，用含2％胎牛血清的DMEM高糖培养基饥饿过夜，第二日以新配置成骨诱导培养基(50mg/mL维生素C，5mmol/Lβ-甘油磷酸,100nmol/L地塞米松，溶剂为含2％胎牛血清的高糖DMEM培养基)对人瓣膜间质细胞进行成骨分化诱导，每三天换液，分别诱导14天及21天。
2、结果分析
成骨诱导培养基诱导14天，western blot检测钙化标志基因ALP、RUNX2蛋白表达变化。成骨诱导培养基诱导21天，进行茜素红染色、钙定量分析检测。结果如图5所示，与si-NC组相比，circRNA XPO4 siRNA组钙化标志基因ALP、RUNX2蛋白表达显著降低；茜素红染色阳性钙结节明显减少，钙盐沉积量也明显减少；相反，circRNA XPO4过表达组与对照组相比，钙化标志基因ALP、RUNX2蛋白表达显著增高；茜素红染色阳性钙结节及盐沉积量也显著增多，结果见图6。
综上所述，本发明提供的一种circRNA XPO4在人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化中的应用，circRNA XPO4及其表达产物可作为诊断钙化性主动脉瓣疾病的标志物，也可作为制备治疗钙化性主动脉瓣疾病药物的靶基因为治疗主动脉瓣钙化提供新的非手术治疗方案。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的保护范围。另外，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改或变型，所有的这些等价形式同样属于本申请所要求限定的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院
<120> circRNA XPO4在人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化中的应用
<130> 20210616
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1957
<212> DNA
<213> 人类(Homo)
<400> 1
gtacatcgaa aaatcagaga agattcagat atggcacaag attctctgca gtgccttgcc 60
cagttagctt ctcttcatgg acccatcttc ccagatgaag gatcacaagt tgattatcta 120
gcacacttca ttgagggatt actgaatact atcaatggaa ttgaaataga agattctgaa 180
gctgtgggga tctccagcat tatcagcaac ctgataaccg tgttcccacg aaatgtttta 240
actgccattc caagtgaact tttctcctcc tttgttaact gcctcacaca cctcacttgt 300
tcttttgggc gaagtgctgc attggaagaa gtgcttgata aagatgacat ggtatacatg 360
gaagcatatg ataaattgtt ggagtcctgg ttaactttgg ttcaagatga caaacatttc 420
cataaaggct tttttaccca acatgcagtt caagttttca attcctatat tcagtgccac 480
ctagctgctc cagatggcac aagaaatttg actgccaatg gtgtggcctc tcgtgaggag 540
gaagaaataa gtgaacttca agaggatgat cgagaccagt tttctgatca actggccagt 600
gtaggaatgc taggaagaat tgctgcagaa cactgtatac ctcttctgac aagtttatta 660
gaagaaagag taacaagact ccatggtcag ttacaacgac atcagcaaca gttacttgct 720
tcaccgggtt caagcactgt tgacaacaaa atgcttgatg atctctatga agatattcac 780
tggcttattt tagttacagg ctacctctta gctgatgata ctcagggaga gactccgcta 840
atacctccag aaataatgga atattccatt aagcattcat ctgaagttga cattaataca 900
acacttcaaa ttttgggatc tccaggagaa aaggcttctt ccatcccagg gtacaacaga 960
acagattctg tgattaggct gttgtctgcc attctcagag tttcagaagt tgaatctcga 1020
gcaataagag cagatctcac tcatctacta agtccccaga tgggcaaaga tattgtttgg 1080
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tacctcttac aaaaagtcat cagtaacctc tcagtctgga gtagtgagca ggaccttgca 1260
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attcaatgtg agaactggtg gaatttagct aagcagtttg caagccgaag cccacctctt 1380
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gtcaagcagg aaatcactgc cacactagag gccctgtgtg gcattgctga ggctacccag 1620
attgacaacg tagcaatcct gtttaatttt ttaatggact tccttaccaa ttgcattgga 1680
ttgatggaag tttacaagaa taccccagag actgtcaatc tcattataga agtttttgtt 1740
gaagttgcac ataaacagat atgctatctt ggagagtcca aagctatgaa cttatatgaa 1800
gcctgcctta ctttgttgca agtgtattct aagaataatt tagggcggca aagaatagat 1860
gttacagcag aagaagagca ataccaagac ctgcttctca ttatggaact tcttactaac 1920
ctgctgtcaa aagaattcat agatttcagt gatacag 1957
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
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<210> 3
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<400> 3
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<213> Artificial Sequence
<400> 4
gtggccgagg actttgattg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cctgtaacaa cgcatcatat t 21
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
<400> 6
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
<400> 7
ttttcgatgt acctgtatca c 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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uucuccgaac gugucacguu u 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
acgugacacg uucggagaau u 21