具体实施方式

为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹举以下实施例详细说明。

本发明的规模化制备鸡胚成纤维细胞的方法包括以下步骤，

(1)挑选鸡胚并进行初步消毒：在鸡胚前孵化室通过照胚挑选发育良好的多枚SPF鸡胚，将鸡胚送入消毒室，使用消毒液喷雾消毒鸡胚表面，之后将鸡胚转移至温室内；本步骤中，选取的SPF鸡胚为9日龄，温室内的室温为38℃。

SPF是指Specific Pathogen Free，SPF动物即无特定病原体动物，是指除清洁动物应排除的病原外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的实验动物。本步骤中选取SPF鸡胚是指符合前述条件的SPF鸡(指生长在屏障系统或隔离器中、无国际、国内尤其流行的主要鸡传染病病原的鸡群)所生产的鸡胚。SPF鸡胚对各种病原微生物有敏锐的感受性，且重复性好，是研制人和禽等多种生物制品的高标准原材料。

本步骤的具体操作中，鸡胚放置在专用托盘中，托盘置于推车上，采用推车整批次地将完成挑选和初步消毒的鸡胚转移至温室内。消毒作业在专用的消毒室内进行，采用喷雾消毒设施对鸡胚进行表面喷淋雾化消毒。本实施例中，单次制备选用的挑选后SPF鸡胚的数量为2000枚。

(2)对鸡胚进行再次消毒：将鸡胚从温室中取出，用刷子蘸取碘酒并对鸡胚上部进行消毒，待碘酒晾干后，使用无水乙醇进行鸡胚脱碘；

本步骤中，从温室内取出鸡胚的时间为置入温室后的第二天，对鸡胚的中上部进行碘酒消毒。具体地，用刷子蘸取碘酒对鸡胚中线以上的部分进行刷涂消毒，也就是对鸡胚的中上部进行消毒，鸡胚的中上部是后序打开蛋壳的位置，采用碘酒消毒能够去除这个位置的病菌，避免打开蛋壳时病菌进入内部。

碘酒的消毒效果在常规消毒液中属于较强的消毒液，先使用碘酒进行消毒，可以保证消毒效果的确切性。无水乙醇既能够脱碘(碘能够溶于无水乙醇，因而在擦拭鸡胚表面时被去除)、也能够脱水(无水乙醇吸水后蒸发)，保证鸡胚表面的干燥性，这样就有效避免了后序打开鸡胚气室时外部残留的液体进入气室内，降低了污染的风险。

(3)取鸡胚：打开鸡胚气室部位，将鸡胚取出，放入平皿中；

本步骤中用到的工具主要是手术式歪头剪刀和歪头镊子，其中手术式歪头剪刀用于打开鸡胚的蛋壳和气室，歪头镊子用于将鸡胚从蛋壳和气室内取出。

(4)处理鸡胚：采用工具夹取并去除鸡胚的眼睛；

本步骤中用到的工具主要是歪头镊子，采用歪头镊子夹取鸡胚的眼睛并去除。

本发明中没有采取传统方式去除鸡胚的头、四肢、内脏，只进行眼球的去除处理，因为脑球、内脏组织比如肝脏等组织不被胰酶消化，并不会影响鸡胚成纤维细胞制备的质量，在后续的过滤中一次性去除即可。只去除眼球的好处有三方面，第一：简化了鸡胚处理的工序，节省了约80％的处理时间；第二、提高单位鸡胚成纤维细胞的制备数量，这是因为在去除头部、四肢、内脏的过程中，会有大量鸡胚皮肤损失，通过执行本制备方法的数据统计，每个鸡胚可以稳定地获得2.5～3×10⁸个鸡胚细胞，是传统成纤维细胞制备方式的两倍；第三，由于处理方式简化，减少了鸡胚暴露在外界环境的时间，降低了污染的风险。

(5)清洗鸡胚：将鸡胚加入清洗器中，将汉克氏液注入清洗器中，摇晃鸡胚清洗器使鸡胚与汉克氏液充分混合，之后将清洗器中的汉克氏液吸出，如此重复清洗鸡胚多次；

本步骤中，将多个获取的鸡胚分装到多个清洗器内，2000枚鸡胚分装到7个鸡胚清洗器内。鸡胚清洗器在结构上包括清洗罐，在清洗罐的顶部设有三通盖，在三通盖上设有三个接口，一个为进液口、一个为抽气口、另一个为出液口，在进液口上连接有进液管且进液管的下端延伸至清洗罐的内腔中上部，在出液口上连接有抽液管，抽液管的下端延伸至清洗罐的内腔底部。

采用多联管道将各清洗器顶部三通盖上的进液口与清洗液储罐连接，采用多联管道将各清洗器顶部三通盖上的抽气口连接且在该多联管道上安装有真空泵，采用多联管道将各清洗器顶部三通盖上的出液口与废液储罐连接且在该多联管道上安装有抽液泵。这样，当需要向清洗器内注入清洗液时，开启真空泵，真空泵通过抽气口将各清洗罐内的空气抽出来，内部气压降低，则清洗液经进液口进入清洗罐内，待清洗液浸没鸡胚后停止，摇晃鸡胚清洗器使鸡胚与汉克氏液充分混合，之后启动抽液泵，从各清洗罐的底部将汉克氏液及清洗杂质抽出。

该鸡胚清洗器在相对密闭状态下清洗鸡胚，可以保证清洗过程的无菌状态，同时通过多管道连接，两个人一次性可以同时操作7台清洗器，大大节省了鸡胚清洗的时间，提升了作业效率。

重复上述清洗液注入-摇晃混合-抽出清洗液的过程，清洗的次数设定为三次，实现对鸡胚的彻底清洗处理。

(6)消化鸡胚：把清洗后的鸡胚倒入磁力消化瓶中，高转速搅拌令消化瓶中的鸡胚全部打碎，成为糊状悬浮组织，之后调至低转速搅拌并加入胰酶，在胰酶的作用下，充分消化鸡胚组织；

本步骤的磁力消化瓶即磁力搅拌瓶，是指以磁力搅拌作为基本工作原理的搅拌瓶，包括产生周期性变化磁力作用的底座以及置于瓶内的搅拌颗粒，工作时，搅拌颗粒在磁力的作用下发生搅拌动作。高转速和低转速为相对而言，在高转速的搅拌作用下，鸡胚被打碎，快速形成糊状悬浮组织，低转速搅拌有两方面作用：一是使消化液的温度更加均匀，二是在搅拌状态下，胚组织外层已经消化好的组织细胞更快地脱落到消化液中，使内部组织暴露在消化液中，加快消化进度，既节省消化时间，又获得活力强的细胞。一般情况下，高转速是指转速大于等于380r/min的转速，低转速是指小于等于140r/min的转速。

本步骤中，高转速搅拌和低转速搅拌在38℃的温度条件下进行，高速搅拌持续的时间为5min，低转速搅拌的持续时间为15min；低转速搅拌后，取消化瓶观察底部沉淀物，以底部沉淀物中的脑球组织、肝脏、脊椎骨、腿部、翅部骨骼清晰可见且骨骼上没有肌肉组织作为判定消化鸡胚步骤的终点。

本步骤中，胰酶的添加量为：10ml/胚。

(7)组织细胞离心：消化好的鸡胚悬浮组织，在无菌条件下向消化液中加入血清以中和胰酶，采用离心机进行离心处理；

本步骤中，加入的血清重量为消化液总重量的3％；离心机的转速为3000r/min，离心持续时间为10min。

(8)组织细胞重悬：弃去离心后的上层清液，向离心管中加入细胞生长液并摇晃离心管，使组织细胞脱离离心管管壁，之后加入混合瓶中并振摇混合瓶，使组织细胞成为悬浮液；

(9)组织细胞过滤：将组织细胞重悬液吸入带有纱布囊式过滤装置的分装罐中，细胞悬液通过纱布囊式过滤装置，使得细胞悬液中的未消化鸡胚组织得到过滤截留，之后向分装罐内补加细胞培养液；

本步骤中，分装罐的容量为50L，每500个鸡胚的组织细胞重悬液向一个分装罐中注入；分装罐内的纱布囊式过滤装置包括18层纱布，完成鸡胚的组织细胞重悬液的注入和过滤后，补加细胞培养液到分装罐的50L刻度线处，也就是在完成注入和过滤操作后，将细胞培养液向分装罐内注满。

(10)分装：将分装罐内的细胞悬浮液分装至多个细胞工厂；

分装前可以进行活细胞计数，图1中所示为活细胞计数的显微图像。

本步骤中，每个分装罐的出口连接有带有多个分液头的分液管，每个分液头连接至一个细胞工厂的注入口，一次进行多个细胞工厂的细胞悬浮液分装。具体地，细胞工厂选取为10层结构的细胞工厂，每个分液管上的分液头为10个，因此单次向10个细胞工厂内分装。每个细胞工厂分装液体2000ml左右，故50L细胞悬液共分装至25个细胞工厂内。

(11)细胞培养：将细胞工厂放入温室中静止培养，得到单层鸡胚成纤维细胞；

本步骤中，细胞工厂的培养温室的温度条件为38℃，培养时间为18～24h。

图2、图3和图4中分别给出了培养时间为12h、48h和72h的细胞工厂内的细胞显微图像，显示了健康细胞随着时间的延长而产生的形态变化。

有益效果：

表1效率和污染风险性对比

从表1的对比上可以看出：采用本规模化生产模式进行鸡胚成纤维细胞的制备，操作步骤大量简化，同时采用改良的设备，生产效率大大提高，成纤维细胞制备过程暴露在外界的时间大大缩短，降低了产品污染的风险，本厂自从采用了改良鸡胚成纤维制备工艺，合格率达到100％。

表2单胚细胞产量与细胞活力对比

从表2中可以看出两种生产方式制备成纤维细胞的活力相当，而规模化生产模式由于简化鸡胚处理模式，不除去头、四肢与内脏，同时磁力消化方式的改良，组织消化的更加充分，使得单胚的细胞产量翻了一倍，大大节约了生产成本。

规模化生产的无菌操作保证：

要实现规模化生产的无菌，从大的方面来说，设施是保证无菌环境的基础，GMP的规范性是软件保障，人员的规范操作是核心。要实现持续的无菌操作一定是细节决定成败，在细节上要把握以下几个原则。

1、尽可能保证所有进入洁净区的物料是低微生物限度甚至无菌，比如本文叙述的鸡胚从D级前孵化区域进入C级洁净区，需要经过优洁消毒液对所有鸡胚进行全面的喷雾消毒，再由C级洁净区进入B级洁净区下的局部A级，通过碘酒消毒和无水乙醇的脱碘和脱水。这些方面都是在践行“所有进入洁净区的物料是低微生物限度甚至无菌”的原则。

2、尽可能的简化操作步骤，比如鸡胚处理阶段，传统模式的鸡胚处理，要去除头部、内脏、四肢，而本文叙述只需要去除眼球即可，从效率上来说，只去除眼球，仅仅是传统模式操作时间的20％，从成本上来说，去除的头部、四肢以及去除内脏时连带胸腹部皮肤，将有大量的皮肤细胞被抛弃。

3、尽可能的减少无菌原料暴露外界的频次和时间，细胞营养液的配制过程和细胞营养液的分装过程，全部使用管道化，减少瓶与瓶之间倾倒液体时各种液体暴露的频次和时间，从而降低污染的风险。

4、尽可能减少人为的操作，尽可能多的使用设备操作，以减少人为差错的概率。传统的鸡胚清洗，大部分在烧杯中进行鸡胚的清洗，1次2个人员只能操作一个烧杯，清洗花费的时间长，鸡胚暴露外界环境的时间也长，我们进行了鸡胚清洗仪器的改进，把鸡胚加入鸡胚清洗器中，连接好管道后，一次性可以操作7个容器进行清洗，大大提高了生产效率，操作过程全部在设备与设备之间进行清洗液流转，减少了人为的操作差错。