一种防收缩人工真皮及其制备方法
阅读说明：本技术 一种防收缩人工真皮及其制备方法 (Anti-shrinkage artificial dermis and preparation method thereof ) 是由 欧阳杨 张一帆 王玲 徐铭恩 于 2021-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种防收缩人工真皮及其制备方法。本发明通过3D打印定向分布用于支撑的框架材料,交错分布胶原基质,通过框架材料抵消胶原基质在培养过程中的内部作用力,增强框架材料与胶原的锚定作用,可以减少胶原基质的收缩,改善真皮层与周围组织的融合效果,控制全层皮肤模型的均一性和一致性,为后续药品及化妆品检测提供稳定的体外模型。(The invention discloses an anti-shrinkage artificial dermis and a preparation method thereof. According to the invention, the framework materials for supporting are directionally distributed through 3D printing, the collagen matrixes are distributed in a staggered manner, the internal acting force of the collagen matrixes in the culture process is counteracted through the framework materials, the anchoring effect of the framework materials and the collagen is enhanced, the contraction of the collagen matrixes can be reduced, the fusion effect of the dermis and the surrounding tissues is improved, the uniformity and consistency of the full-layer skin model are controlled, and a stable in-vitro model is provided for the subsequent detection of medicines and cosmetics.)
技术领域
本发明属于皮肤组织工程技术领域，涉及一种防收缩人工真皮及其制备方法。
背景技术
对于药物和化妆品测试来说，以全功能的人工皮肤作为体外检测模型是一种迫切的需求。皮肤具有复杂的多层结构，特定细胞按照特定的方式排列构成皮肤结构，细胞外基质作为细胞生存的微环境，具有重要的生理作用。胶原作为细胞外基质的主要成分，广泛应用于人工真皮的构建。
目前使用较为广泛的是猪皮来源或牛跟腱来源的胶原，在与人源成纤维细胞共培养时，由于成纤维细胞自身分泌胶原，与外源性胶原互相作用，发生结构重组，存在不可控的收缩现象，造成人工真皮无法与周围组织良好的融合，因此人工真皮培养过程中胶原凝胶后，成纤维细胞均匀分布在凝胶内，培养4～5天后，由于胶原的重组过程，整体凝胶会呈现向内收缩的趋势，具体表现为外圈收缩明显，并向内卷曲，严重影响后续检测及应用。
发明内容
本发明的一个目的是针对使用胶原作为细胞外基质构建人工真皮，其与周围组织无法有效融合的问题，提供了一种防收缩人工真皮的制备方法，通过3D打印有取向性的沉积用于支撑的框架材料，将胶原基质(即胶原生物墨水)交错分布在框架材料之间，有方向的增强框架材料与胶原的锚定作用，消减细胞与胶原基质共培养过程产生的作用力，减少胶原基质的收缩，改善人工真皮与周围组织的融合效果，控制人工真皮的均一性和一致性，为后续药品及化妆品检测提供符合要求的体外模型。
一种防收缩人工真皮的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：胶原生物墨水的制备
在低温环境下，配制中性胶原溶液；将成纤维细胞和中性胶原溶液混匀，制备细胞密度为1×106～9×106cells/mL的胶原生物墨水；
所述中性胶原溶液包括1×DMEM、体积含量为1％-10％的胎牛血清、质量体积含量为0.5％-6％(单位为mg/mL)的Ⅰ型胶原、其余为NaHCO3，pH为7.2-7.4。
作为优选，所述低温环境的温度为4～10℃。
作为优选，所述Ⅰ型胶原为牛跟腱胶原。
步骤(2)：生物3D打印制备人工真皮
第一种方案：框架材料采用医用可降解高分子材料，或具有比纯胶原更优力学性能的水凝胶材料；其中所述医用可降解高分子材料包括但不限于聚己内酯PCL、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、聚乙交酯PGA中的一种或多种；所述水凝胶材料包括但不限于天然水凝胶和合成类水凝胶，具体包括明胶、海藻酸钠、壳聚糖、纤维蛋白、丝素蛋白、脱细胞外基质、甲基丙烯酸酐化明胶GelMA或甲基丙烯酰化透明质酸HAMA中的一种或多种，以及其与胶原复合的水凝胶材料。
在双喷头生物3D打印机中的两个墨盒分别装载框架材料和胶原生物墨水，通过打印程序和框架横截面图形文件，由计算机操控双喷头生物3D打印机从而控制两个分别装载框架材料和胶原生物墨水的喷头先后顺序和沉积位置进行交错打印，形成所需人工真皮；
所述交错打印采用不等间距交错填充方式，优选为线性填充、非线性填充、放射线填充、螺纹填充；更为优选是内疏外密的放射线填充方式。
作为优选，所述框架横截面图形具体是由多个同一圆心的圆环构成，相邻圆环间的间距满足公式(1)，且在圆环上设置多个径向加强模块；每个径向加强模块包括多个周期性分布的至少穿过n1个圆环的径向加强筋。
其中Ri表示由圆心往外数的第i个圆环半径，i＝1,2,…，N，N表示圆环总个数；R0表示圆心，R0＝0；2≤n1≤N；
更为优选，Ri-Ri-1范围控制在0.8mm～1.5mm。
更为优选，所述框架横截面图形具体是由多个同一圆心的圆环构成，相邻圆环间的间距满足公式(1)，且在圆环上设置三个径向加强模块；第一径向加强模块包括多个周期性分布的穿过圆心以及所有圆环的第一径向加强筋，相邻径向加强筋间的夹角相等；第二径向加强模块包括多个周期性分布的第二径向加强筋，该第二径向加强筋不穿过圆心且穿过中间n1个圆环，2≤n2≤N；第三径向加强模块包括多个周期性分布的第三径向加强筋，该第三径向加强筋不穿过圆心且穿过最外侧n3个圆环，2≤n3≤N；
作为优选，所述框架材料的丝径为100μm～500μm。
作为优选，接收人工真皮的平台温度控制在37℃，所述双喷头生物3D打印机的整个打印过程时间控制在5min内。
作为优选，若框架材料为医用可降解高分子材料，则生物3D打印制备人工真皮过程中需待框架材料温度降至37℃时，再进行胶原生物墨水的打印；若框架材料为水凝胶材料，则双喷头生物3D打印机的打印喷头温度为25-37℃。
第二种方案：框架材料采用水凝胶材料，其中所述水凝胶材料包括但不限于天然水凝胶和合成类水凝胶，具体包括明胶、海藻酸钠、壳聚糖、纤维蛋白、丝素蛋白、脱细胞外基质、甲基丙烯酸酐化明胶GelMA或甲基丙烯酰化透明质酸HAMA中的一种或多种，以及其与胶原复合的水凝胶材料。
在双喷头生物3D打印机中的两个墨盒分别装载框架材料和胶原生物墨水，通过打印程序和框架横截面图形文件，由计算机操控双喷头生物3D打印机从而控制装载框架材料的喷头进行交错打印得到真皮培养框架，其经梯度冻干处理后制备得到具有多层级孔隙结构的真皮培养框架；然后控制胶原生物墨水的喷头对所述具有多层级孔隙结构的真皮培养框架接种胶原生物墨水，形成所需人工真皮；
所述真皮培养框架的多层级孔隙结构为打印孔隙及梯度冻干的微观孔隙。
所述的梯度冻干方法具体是对真皮培养框架进行如下梯度冻干：4℃、30min，-20℃、2～4h，-80℃、12～24h，得到梯度冻干处理后的框架；对梯度冻干处理后的框架抽真空48h以上，充分去除水分，引入微观孔隙，得到真皮培养框架。
作为优选，接收人工真皮的平台温度控制在37℃，所述双喷头生物3D打印机的打印喷头温度为25-37℃，所述双喷头生物3D打印机的整个打印过程时间控制在5min内。
作为优选，所述真皮培养框架接种胶原生物墨水选择负压接种方式，使胶原充分进入真皮培养框架的微观孔隙，在框架内部形成交联网络。
步骤(3)：将上述人工真皮置于人工真皮培养基培养；
作为优选，所述培养条件为5％CO2、37℃培养箱中培养。
本发明的另一个目的是提供一种防收缩人工真皮，采用以上方法制备得到。
本发明的有益效果具体是：
1、本发明采用的框架材料具有多层级孔隙结构；通过胶原与框架材料的锚定作用，减少胶原收缩，有效控制胶原与成纤维细胞培养过程中发生的收缩，有效维持真皮模型形状的均一性。
2、本发明采用双喷头打印的方式，根据胶原受力特点，定向分布框架材料，有利于胶原生物墨水向框架材料内部的渗透，通过胶原与框架材料的锚定作用，减少胶原收缩，有效控制胶原与成纤维细胞培养过程中发生的收缩，有效维持真皮模型形状的均一性。
3、本发明采用与胶原同源的生物材料作为框架材料，通过氢键作用，不仅能有效控制胶原收缩，更能改善人工真皮与周围组织的融合，包括真皮与皮下脂肪层的结合及真皮表皮层的界面融合。框架材料简单易得，无特殊处理。
4、本发明提出的框架结构设计在尽可能的引入较少框架材料，以达到最大的支撑效果，以有效控制胶原与成纤维细胞培养过程中发生的收缩。
附图说明
图1为框架的横截面图形示意图之一；
图2为框架的横截面图形示意图之二；
图3(a)、(b)分别为本发明人工表皮培养7天后照片、传统人工表皮培养7天后照片。
具体实施方式
下面结合具体较佳实施例对本发明做进一步的分析，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限，并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：一种防收缩人工真皮的制备方法
步骤(1)：胶原生物墨水的制备
在4～10℃低温环境下，吸取2.8mL的牛跟腱胶原溶液(含量10mg/mL)，并添加10xDMEM溶液300μL，胎牛血清300μL和304μL的NaHCO3(含量71.2mg/mL)溶液，得到pH为7.2～7.4的中性胶原溶液。
将成纤维细胞和中性胶原溶液混匀，制备细胞密度为1×106～9×106cells/mL的胶原生物墨水。
步骤(2)：生物3D打印制备人工真皮
双喷头生物3D打印机中的两个墨盒分别装载框架材料聚己内酯(PCL)和胶原生物墨水，通过打印程序和框架横截面图形文件，由计算机操控双喷头生物3D打印机从而控制两个分别装载框架材料和胶原生物墨水的喷头的先后顺序和沉积位置进行交错打印，形成所需人工真皮，最后将其置于人工真皮培养基，于5％CO2、37℃培养箱中培养。接收人工真皮的平台温度为37℃，整个打印过程时间控制在5min内。在PCL框架材料和胶原生物墨水交错打印时，待PCL温度降至37℃时，然后进行胶原生物墨水的打印。
如图1所述框架横截面图形具体是由多个同一圆心的圆环构成，相邻圆环间的间距满足公式(1)，且在圆环上设置径向加强模块；该径向加强模块包括多个周期性分布的穿过圆心以及所有圆环的第一径向加强筋；
其中Ri表示由圆心往外数的第i个圆环半径，i＝1,2,…，N，N表示圆环总个数；R0表示圆心，R0＝0；2≤n1≤N；Ri-Ri-1范围控制在0.8mm～1.5mm。
所述框架材料的丝径为100μm～500μm。
实施例2：一种防收缩人工真皮的制备方法
步骤(1)：胶原生物墨水的制备
在4～10℃低温环境下，吸取2.8mL的牛跟腱胶原溶液(含量10mg/mL)，并添加10xDMEM溶液300μL，胎牛血清300μL和304μL的NaHCO3(含量71.2mg/mL)溶液，得到pH为7.2～7.4的中性胶原溶液。
将成纤维细胞和中性胶原溶液混匀，制备细胞密度为1×106～9×106cells/mL的胶原生物墨水。
步骤(2)：生物3D打印制备人工真皮
双喷头生物3D打印机中的两个墨盒分别装载框架材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和胶原生物墨水，通过打印程序和框架横截面图形文件，由计算机操控双喷头生物3D打印机从而控制两个分别装载框架材料和胶原生物墨水的喷头的先后顺序和沉积位置进行交错打印，形成所需人工真皮，最后将其置于人工真皮培养基，于5％CO2、37℃培养箱中培养。接收人工真皮的平台温度为37℃，整个打印过程时间控制在5min内。在PLGA框架材料和胶原生物墨水交错打印时，待PLGA温度降至37℃时，然后进行胶原生物墨水的打印。
如图2所述框架横截面图形具体是由多个同一圆心的圆环构成，相邻圆环间的间距满足公式(1)，且在圆环上设置三个径向加强模块；第一径向加强模块包括多个周期性分布的穿过圆心以及所有圆环的第一径向加强筋，相邻径向加强筋间的夹角相等；第二径向加强模块包括多个周期性分布的第二径向加强筋，该第二径向加强筋不穿过圆心且穿过中间n1个圆环，2≤n2≤N；第三径向加强模块包括多个周期性分布的第三径向加强筋，该第三径向加强筋不穿过圆心且穿过最外侧n3个圆环，2≤n3≤N；
其中Ri表示由圆心往外数的第i个圆环半径，i＝1,2,…，N，N表示圆环总个数；R0表示圆心，R0＝0；2≤n1≤N；Ri-Ri-1范围控制在0.8mm～1.5mm。
所述框架材料的丝径为100μm～500μm。
实施例3：一种防收缩人工真皮的制备方法
步骤(1)：胶原生物墨水的制备
在4～10℃低温环境下，吸取2.8mL的牛跟腱胶原溶液(含量10mg/mL)，并添加10xDMEM溶液300μL，胎牛血清300μL和304μL的NaHCO3(含量71.2mg/mL)溶液，得到pH为7.2～7.4的中性胶原溶液。
将成纤维细胞和中性胶原溶液混匀，制备细胞密度为1×106～9×106cells/mL的胶原生物墨水。
步骤(2)：生物3D打印制备人工真皮
双喷头生物3D打印机中的两个墨盒分别装载框架材料明胶海藻酸钠和胶原生物墨水，通过打印程序和框架横截面图形文件，由计算机操控双喷头生物3D打印机从而控制装载框架材料的喷头进行交错打印得到真皮培养框架，其经梯度冻干处理后制备得到具有多层级孔隙结构；然后控制胶原生物墨水的喷头对具有所述多层级孔隙结构的真皮培养框架采用负压接种方式接种胶原生物墨水，使胶原充分进入真皮培养框架的微观孔隙，在框架内部形成交联网络，最终得到所需人工真皮，最后将其置于人工真皮培养基，于5％CO2、37℃培养箱中培养。接收人工真皮的平台温度为37℃，双喷头生物3D打印机的打印喷头温度为25-37℃，整个打印过程时间控制在5min内。
所述真皮培养框架的多层级孔隙结构为打印孔隙及梯度冻干的微观孔隙。
所述的梯度冻干方法具体是对框架材料3D打印后结构进行如下梯度冻干：4℃、30min，-20℃、2～4h，-80℃、12～24h，得到梯度冻干处理后框架；对梯度冻干处理后框架抽真空48h以上，充分去除水分，引入微观孔隙，得到真皮培养框架。
图3(a)、(b)分别为本发明人工表皮培养7天后照片、传统人工表皮培养7天后照片。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。