一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法
阅读说明：本技术 一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法 (Primary isolation culture and induced differentiation method for intramuscular precursor adipocytes of adult yaks ) 是由 王之盛 胡瑞 王森 师俊华 邹华围 王俊梅 郭逸芯 于 2021-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法,包括消毒处理分割、消化、筛滤、离心、纯化和培养；本发明提供的成年牦牛肌内前体脂肪细胞培养方法,不仅能够节省人力物力,还打破了传统培养方法使用初生牛犊脂肪组织和原代细胞高污染率的局限,使样品来源途径更加广泛,并能同时获取大量细胞,是一种便捷,高效的前体脂肪细胞培养方法,为后续深入研究肌内前体脂肪细胞增殖分化过程基因、蛋白表达、信号通路等提供分子基础,为研究不同部位脂肪沉积、脂肪代谢和脂肪动员等提供新思路和新方法,对改善牦牛肉质品质具有重要意义。(The invention discloses a primary isolation culture and induced differentiation method of intramuscular precursor adipocytes of adult yaks, which comprises disinfection treatment, segmentation, digestion, screening, centrifugation, purification and culture; the method for culturing the intramuscular precursor adipocytes of the adult yaks, provided by the invention, can save manpower and material resources, breaks through the limitation that the conventional culture method uses the adipose tissues of newborn calf and primary cells with high pollution rate, enables the source ways of samples to be wider, can simultaneously obtain a large number of cells, is a convenient and efficient method for culturing the precursor adipocytes, provides a molecular basis for the subsequent deep research of genes, protein expression, signal paths and the like in the process of proliferation and differentiation of the intramuscular precursor adipocytes, provides a new thought and a new method for the research of fat deposition, fat metabolism, fat mobilization and the like at different parts, and has important significance for improving the quality of meat quality of the yaks.)
技术领域
本发明属于细胞工程和组织工程领域，具体涉及一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法。
背景技术
牦牛是中国特色牛种，能够适应高原地区严酷的自然环境，并且牦牛经济价值高，是当地牧民赖以生存的重要生活、生产资料。脂肪组织主要分布于四个部位：内脏、皮下、肌内、肌间，探究各部位脂肪组织的积累规律，对改善牦牛肉质品质具有重要意义，对进一步提高当地牧民经济收入具有重要的意义。然而，牦牛饲养方式落后，大多采取传统放牧的生产方式。虽然近年来研究证明牦牛在低海拔地区生长情况良好，但牦牛饲养育肥技术较其它牛种差距很大，并且肉牛肌肉间脂肪的沉积对生产高档牛肉“雪花牛肉”尤为重要，因此研究牦牛肌内前体脂肪细胞培养技术可以为从细胞分子水平探究牦牛肌内脂肪代谢过程提供理论支持，对牦牛阶段育肥体系的建立也具有重要意义。
当前牦牛肌内前体脂肪细胞体外培养技术未见有报道和研究，并且其他成年动物肌内前脂肪细胞分离技术普遍存在低活性和高污染率的问题，为解决前一问题，大多采样对象为幼龄动物，但高污染仍是原代细胞培养实验的重大问题，未见有效的解决办法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法，该突破了采样动物必须为幼龄动物的局限，极大降低了细胞污染率，而且还能收获大量高活性的脂肪细胞。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法，它包括以下步骤：
S1. 消毒处理：无菌条件下分离成年牦牛背最长肌组织，PBS冲洗表面至无污垢在碘酒中浸泡8-15min，然后迅速取出剥去外层染色区域组织；
S2. 分割：将消毒处理后的组织用PBS涮洗干净后分割呈小块，放入装有PBS的离心管中并剪成组织块；
S3. 消化：向含有组织块的离心管中加入消化酶溶液，37℃恒温消化100-150min，得消化液；其中，所述的消化酶溶液为I型胶原酶、II型胶原酶、BAS和氯化钙的D-hanks溶液；
S4. 筛滤：得到的消化液用40μm的无菌细胞筛过滤，收集滤液加终止培养基终止消化；其中，所述终止培养基为高糖培养基与FBS的混合液；
S5. 离心：将终止消化后的滤液1200rpm离心4-8min，弃去上清液得到细胞团；将细胞团用无血清高糖培养基洗涤两次，第一次洗涤离心机的转速为1000rpm离心4-8min，第二次洗涤离心机的转速800rpm离心4-8min；
S6. 纯化：离心后的细胞重悬于I型培养基，所述I型培养基为含有12% FBS、2%青/链霉素/两性霉素和2%L-谷氨酰胺的高糖培养基，通过差速贴壁纯化细胞；
S7. 培养：将纯化后的细胞在培养箱中培养，培养2d换一次I型培养基，之后每2d更换一次II型培养基，所述II型培养基为含有10% FBS、1%青/链霉素和2% L-谷氨酰胺的高糖培养基，待细胞汇合度达到95%后进行分化。
进一步地，步骤S2中所述组织块的大小为1-2mm3。
进一步地，步骤S3中消化酶溶液与组织块的体积比为2.5-4:1。
进一步地，步骤S6中所述差速贴壁法纯化细胞的方法为：将培养瓶置于CO2浓度为5%的培养箱中恒温37℃培养50-80min，弃去含有非贴壁细胞培养基，用含2%青/链霉素/两性霉素的PBS洗2次，再向培养瓶中加入I型培养基。
进一步地，步骤S7中所述培养的条件为37℃、CO2浓度为5%的培养箱中进行培养。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、原代肌内前体脂肪细胞分离组织基本源于幼龄动物，成年动物尤其是成年牦牛其自身细胞分离后活性较弱，体外培养难度大。本发明对试验动物年龄没有限制，并且组织可取自屠宰场，无需无菌条件获取脂肪组织，大大降低了对幼龄实验动物的需求和实验动物的寻找难度和获取成本。
2、传统原代细胞分离方法使用高浓度抗生素抑菌，但分离细胞仍存在大量污染，本发明使用碘酒浸泡后，再进行相应处理，极大降低了抗生素的使用和酒精对细胞的损伤，减少了实验经费，降低了细胞损伤，避免了样品的污染问题。
3、本发明经消化后只需一步过滤即可获得细胞，节省实验成本和时间。
4、本发明中首先使用高糖培养基培养牦牛前体脂肪细胞，试验中发现I型培养基对牦牛前脂肪细胞具有显著促进贴壁的作用，一般情况下前体脂肪细胞贴壁时间在2小时左右，本发明通过更换培养基环境，将差速贴壁时间缩减50%，极大的缩短了试验时间，减少了工作量；同时本发明公开的两种优化培养基（I型、II型）对牦牛原代前脂肪细胞进行两步培养，此方法对成年牦牛原代前体脂肪细胞的活性具有重要的恢复作用。
5、本发明公开的消化酶中添加CaCl2和BSA既减少了细胞消化损伤，又不降低胶原酶的消化能力，获取的细胞形态良好，活力旺盛，仅需3d即可生长至80%左右。
6、本发明采取梯度离心，先通过高转速富集细胞，之后换至低俗离心力收集目的细胞，减少了离心力对细胞的机械损伤。
7、本发明提供了一种高效、污染率低、可重复的成年牦牛肌内前体脂肪细胞培养方法，不仅能够节省人力物力，还打破了传统培养方法使用初生牛犊脂肪组织和原代细胞高污染率的局限，这就使样品来源途径更加广泛，并能同时获取大量细胞，是一种便捷，高效的前体脂肪细胞培养方法，为后续深入研究肌内前体脂肪细胞增殖分化过程基因、蛋白表达、信号通路等提供分子基础，为研究不同部位脂肪沉积、脂肪代谢和脂肪动员等提供新思路和新方法，对改善牦牛肉质品质具有重要意义。
附图说明
图1为牦牛肌内前体脂肪细胞形态学观察图。
图2为牦牛肌内前体脂肪细胞油红O鉴定结果图。
图3为分离肌内前体脂肪细胞的免疫荧光鉴定结果图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
实验试剂：I型胶原酶（Worthington）、II型胶原酶（Worthington）、牛血清白蛋白（BSA）(Sigma)、D-hanks溶液(博士德)；高糖培养基（Gibco，型号：11960044）、胎牛血清（FBS）（Gibco）、青/链霉素/两性霉素B（三抗）（索莱宝）、L-谷氨酰胺（Gln）（博士德）、青/链霉素（双抗）、牛胰岛素（索莱宝）、地塞米松(索莱宝)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（百灵威）、罗格列酮（索莱宝）。
实施例1：一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法，包括以下步骤：
S1. 消毒处理：无菌条件下分离成年牦牛背最长肌组织，PBS冲洗表面至无污垢在碘酒中浸泡10min，然后迅速取出剥去外层染色区域组织；
S2. 分割：将消毒处理后的组织用PBS涮洗干净后分割呈小块，放入装有2mL 5%PBS的50mL离心管中并剪成大小为1-2mm3组织块；
S3. 消化：向含有组织块的离心管中加入消化酶溶液，消化酶溶液与组织块的体积比为3:1，37℃恒温消化120min，得消化液；其中，所述的消化酶溶液为100mg I型胶原酶、50mg II型胶原酶、1g BAS和5mmol/L氯化钙溶于50mL D-hanks溶液；
S4. 筛滤：得到的消化液用40μm的无菌细胞筛过滤，收集滤液加含有15mL温热终止培养基终止消化；其中，所述终止培养基为普通高糖培养基与10% FBS的混合液；
S5. 离心：将终止消化后的滤液1200rpm离心5min，弃去上清液得到细胞团；将细胞团用无血清高糖培养基洗涤两次，第一次洗涤离心机的转速为1000rpm离心5min，第二次洗涤离心机的转速800rpm离心5min；
S6. 纯化：细胞重悬于I型培养基，所述I型培养基为含有12% FBS、2%青/链霉素/两性霉素和2%L-谷氨酰胺的高糖培养基，通过差速贴壁纯化细胞；所述差速贴壁法纯化细胞的方法为：将培养瓶置于CO2浓度为5%的培养箱中恒温37℃培养60min，弃去含有非贴壁细胞培养基，用含2% 青/链霉素/两性霉素的PBS洗2次，再向培养瓶中加入I型培养基；
S7. 培养：将纯化后的细胞在37℃、CO2浓度为5%的培养箱中进行培养，培养2d换一次I型培养基，之后每2d更换一次II型培养基，所述II型培养基为含有10% FBS、1%青/链霉素和2% L-谷氨酰胺的高糖培养基，待细胞汇合度达到95%后进行分化。
实施例2：一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法，包括以下步骤：
S1. 消毒处理：无菌条件下分离成年牦牛背最长肌组织，PBS冲洗表面至无污垢在碘酒中浸泡15min，然后迅速取出剥去外层染色区域组织；
S2. 分割：将消毒处理后的组织用PBS涮洗干净后分割呈小块，放入装有2mL 5%PBS的50mL离心管中并剪成大小为1-2mm3组织块；
S3. 消化：向含有组织块的离心管中加入消化酶溶液，消化酶溶液与组织块的体积比为4:1，37℃恒温消化150min，得消化液；其中，所述的消化酶溶液为100mg I型胶原酶、50mg II型胶原酶、1g BAS和5mmol/L氯化钙溶于50mL D-hanks溶液；
S4. 筛滤：得到的消化液用40μm的无菌细胞筛过滤，收集滤液加含有15mL温热终止培养基终止消化；其中，所述终止培养基为普通高糖培养基与10% FBS的混合液；
S5. 离心：将终止消化后的滤液1200rpm离心8min，弃去上清液得到细胞团；将细胞团用无血清高糖培养基洗涤两次，第一次洗涤离心机的转速为1000rpm离心8min，第二次洗涤离心机的转速800rpm离心8min；
S6. 纯化：离心后的细胞重悬于I型培养基，所述I型培养基为含有12% FBS、2%青/链霉素/两性霉素和2%L-谷氨酰胺的高糖培养基，通过差速贴壁纯化细胞；所述差速贴壁法纯化细胞的方法为：将培养瓶置于CO2浓度为5%的培养箱中恒温37℃培养80min，弃去含有非贴壁细胞培养基，用含2% 青/链霉素/两性霉素的PBS洗2次，再向培养瓶中加入I型培养基；
S7. 培养：将纯化后的细胞在37℃、CO2浓度为5%的培养箱中进行培养，培养2d换一次I型培养基，之后每2d更换一次II型培养基，所述II型培养基为含有10% FBS、1%青/链霉素和2% L-谷氨酰胺的高糖培养基，待细胞汇合度达到95%后进行分化。
实施例3：一种成年牦牛肌内前体脂肪细胞原代分离培养及诱导分化方法，包括以下步骤：
S1. 消毒处理：无菌条件下分离成年牦牛背最长肌组织，PBS冲洗表面至无污垢在碘酒中浸泡8min，然后迅速取出剥去外层染色区域组织；
S2. 分割：将消毒处理后的组织用PBS涮洗干净后分割呈小块，放入装有2mL 5%PBS的50mL离心管中并剪成大小为1-2mm3组织块；
S3. 消化：向含有组织块的离心管中加入消化酶溶液，消化酶溶液与组织块的体积比为2.5:1，37℃恒温消化100min，得消化液；其中，所述的消化酶溶液为100mg I型胶原酶、50mg II型胶原酶、1g BAS和5mmol/L氯化钙溶于50mL D-hanks溶液；
S4. 筛滤：得到的消化液用40μm的无菌细胞筛过滤，收集滤液加含有15mL温热终止培养基终止消化；其中，所述终止培养基为普通高糖培养基与10% FBS的混合液；
S5. 离心：将终止消化后的滤液1200rpm离心4min，弃去上清液得到细胞团；将细胞团用无血清高糖培养基洗涤两次，第一次洗涤离心机的转速为1000rpm离心4min，第二次洗涤离心机的转速800rpm离心4min；
S6. 纯化：离心后的细胞重悬于I型培养基，所述I型培养基为含有12% FBS、2%青/链霉素/两性霉素和2%L-谷氨酰胺的高糖培养基，通过差速贴壁纯化细胞；所述差速贴壁法纯化细胞的方法为：将培养瓶置于CO2浓度为5%的培养箱中恒温37℃培养50min，弃去含有非贴壁细胞培养基，用含2% 青/链霉素/两性霉素的PBS洗2次，再向培养瓶中加入I型培养基；
S7. 培养：将纯化后的细胞在37℃、CO2浓度为5%的培养箱中进行培养，培养2d换一次I型培养基，之后每2d更换一次II型培养基，所述II型培养基为含有10% FBS、1%青/链霉素和2% L-谷氨酰胺的高糖培养基，待脂肪细胞汇合度达到95%后进行分化。
以下通过实验说明本发明的有益效果：
（1）牦牛前体脂肪细胞形态学观察
经过实施例1消化酶溶液消化后得到的细胞在刚接种到25T培养瓶中时，呈现出圆球形状并处于悬浮状态，接种后1小时，由于前体脂肪细胞贴壁性强，故而提前完成贴壁，大部分呈现黑色椭圆型，小部分呈现出不规则三角形和梭形，如图1中的图1 A所示。培养2天后小时后贴壁细胞开始伸长，呈现出狭长的成纤维细胞形态，如图1中的图1 B所示。获得细胞活性旺盛，继续培养至3天后，细胞汇合度即可达到80%，如图1中的图1 C所示，可以进行传代或冻存处理。
（2）油红O染色检测
将实施例1前体脂肪细胞生长至汇合状态后更换为分化A液（DMEM、1% 青/链霉素/两性霉素B、1% 谷氨酰胺、10μg/ml 牛胰岛素、1μM 地塞米松、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1μM 罗格列酮）。培养3天和分化B液（DMEM、1% 青/链霉素/两性霉素B、1% 谷氨酰胺、10μg/ml 牛胰岛素）。培养8天。A液处理3天后，开始出现小脂滴，之后更换为B液处理，8天后出现聚集大脂滴。诱导分化后成为成熟脂肪细胞，按照油红O染色法进行染色以鉴定脂肪细胞。先用10%甲醛固定20分钟，之后PBS稍冲洗晾干；之后滴加油红O染液，密闭染色15分钟；60%异丙醇稍洗后，PBS稍洗，之后晾干镜检，结果如图2所示，脂肪细胞内脂质都被染成红色，即分离细胞具有良好的成脂能力。
（3）免疫荧光鉴定
将实施例1纯化的脂肪细胞接种在6孔培养板中加入含有10％FBS的II型培养基培养，当细胞汇合达到70％时，弃去培养基，使用PBS轻柔洗涤细胞，在室温下每孔加入1ml4％的多聚甲醛，将细胞固定30分钟，之后再次用PBS洗涤；在室温下用浓度为0.5％的Triton X-100使细胞通透60分钟，弃去液体，然后用PBS再次洗涤，在室温下使用浓度为5％的山羊血清封闭60分钟；弃去封闭溶液，并加入稀释的兔Pref-1抗体，并在4℃孵育过夜，弃去一抗，加入稀释的抗兔FITC荧光二抗，37℃孵育80min，弃去二抗后用PBS洗3次，每次3min。后滴加DAPI避光孵育5min，用PBS洗4次去除多余的DAPI，每次5min。最后加入适量PBS，在荧光显微镜下观察结。结果如图3所示，绿色荧光即为前体脂肪细胞标志蛋白Pref-1的表达，说明此鉴定细胞为前脂肪细胞。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。
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