一种质粒dna原液制备方法
阅读说明：本技术 一种质粒dna原液制备方法 (Preparation method of plasmid DNA stock solution ) 是由 王雪云 郭土敬 吴彦萍 吴灼斌 梁富 黄致翔 叶才文 刘爱和 曹静 梁琳琳 郭采 于 2021-08-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种质粒DNA原液制备方法,其包括以下步骤：平衡质粒DNA液温度至常温,进行预浓缩至质粒DNA终浓度为500～1000μg/ml,得预浓缩液；采用含有多元醇的洗滤缓冲液对预浓缩液进行等体积洗滤,再浓缩至合适浓度。本发明的质粒DNA原液制备方法通过控制温度条件,并同时采用质粒DNA低浓度预浓缩及通过含多元醇的洗滤缓冲液进行洗滤,可有效减少质粒DNA的聚集沉淀及机械损伤,显著提高了质粒DNA的超滤回收率,回收率可高达85％以上。(The invention discloses a preparation method of plasmid DNA stock solution, which comprises the following steps: balancing the temperature of the plasmid DNA liquid to normal temperature, and carrying out preconcentration until the final concentration of the plasmid DNA is 500-1000 mug/ml, so as to obtain a preconcentration liquid; and (3) washing and filtering the pre-concentrated solution by adopting a washing and filtering buffer solution containing polyol in an equal volume, and then concentrating to a proper concentration. The preparation method of the plasmid DNA stock solution can effectively reduce the aggregation precipitation and the mechanical damage of the plasmid DNA by controlling the temperature condition, adopting the low-concentration pre-concentration of the plasmid DNA and carrying out the washing and filtering by the washing and filtering buffer solution containing the polyalcohol at the same time, obviously improves the ultrafiltration recovery rate of the plasmid DNA, and the recovery rate can reach more than 85 percent.)
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及了一种质粒DNA原液制备方法。
背景技术
质粒DNA在进行精纯后，常通过对其进行浓缩，以使其达到药用质量标准。但因为质粒DNA在浓缩过程中，随着浓度的增大，其粘度也显著增大。这不仅易造成质粒DNA超螺旋结构的损伤，更会严重影响质粒DNA的回收率，导致制药成本的增加。现有技术中常采用中空纤维或膜包对精纯后的质粒DNA进行浓缩，并采用PBS缓冲液进行洗滤，但质粒回收率常常维持在60％～70％间，而且在超滤浓缩中质粒超螺旋构型经常存在机械损伤，造成质粒质量的下降。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种质粒DNA原液制备方法。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种质粒DNA原液制备方法，其包括以下步骤：平衡质粒DNA液温度至常温，进行预浓缩至质粒DNA终浓度为500～1000μg/ml，得预浓缩液；采用含有多元醇的洗滤缓冲液对预浓缩液进行等体积洗滤，再浓缩至合适浓度。
作为本发明提供的质粒DNA原液制备方法的一种优选实施方式，所述方法具体包括以下步骤：
(1)温度平衡：将质粒DNA液温度平衡至常温，所述常温为20～30℃；
(2)预浓缩：将平衡后的质粒DNA采用超滤进行预浓缩，浓缩至质粒DNA 终浓度为500～1000μg/ml，等体积维持至预浓缩结束，得预浓缩液；
(3)洗滤：采用含有多元醇的洗滤缓冲液对预浓缩液进行等体积洗滤；
(4)浓缩：洗滤结束后，预浓缩液再浓缩至合适浓度。
作为本发明提供的质粒DNA原液制备方法的一种优选实施方式，所述多元醇为山梨糖醇、甘露醇、季戊四醇、甘油或木糖醇。
作为本发明提供的质粒DNA原液制备方法的一种优选实施方式，所述多元醇的质量浓度为1～10％(W/V)。
作为本发明提供的质粒DNA原液制备方法的一种优选实施方式，步骤(1) 中，所述质粒DNA为精纯后的质粒DNA。
作为本发明提供的质粒DNA原液制备方法的一种优选实施方式，在步骤(2) 中，所述超滤用的超滤器具为膜包或中空纤维柱。
作为本发明提供的质粒DNA原液制备方法的一种优选实施方式，所述膜包或中空纤维柱的孔径为100～500kD。
作为本发明提供的质粒DNA原液制备方法的一种优选实施方式，所述步骤 (3)中洗滤缓冲液中磷酸盐浓度为10～100mmol/L。
作为本发明提供的质粒DNA原液制备方法的一种优选实施方式，所述步骤 (3)中洗滤缓冲液中不添加氯化钠。
作为本发明提供的质粒DNA原液制备方法的一种优选实施方式，步骤(3) 中等体积洗滤的洗滤倍数为3～10倍。
作为本发明提供的质粒DNA原液制备方法的一种优选实施方式，所述合适浓度为2.3～3.0mg/ml。
本发明具有如下有益效果：
本发明的质粒DNA原液制备方法通过控制温度条件，并同时采用质粒DNA 低浓度预浓缩及通过含多元醇的洗滤缓冲液进行洗滤，可有效减少质粒DNA的聚集沉淀及机械损伤，超螺旋含量可达93％以上，显著提高了质粒DNA的超滤回收率，回收率可高达85％以上。本发明无需对整个超滤工艺进行变更，仅通过对质粒DNA浓度、温度和洗滤缓冲液配方进行处理即可显著增加质粒DNA 超滤浓缩回收率，操作简单，重复性高，易于产业规模化应用。
附图说明
图1为本发明的工艺流程示意图；
图2为本发明实施例一琼脂糖凝胶电泳结果图，其中泳道1至5分别对应组别1至组别5原液琼脂糖凝胶电泳结果；
图3为本发明实施例二原液琼脂糖凝胶电泳结果图，其中泳道1至5分别对应组别1至组别5原液琼脂糖凝胶电泳结果；
图4为本发明实施例三原液琼脂糖凝胶电泳结果图，其中泳道1至5分别对应组别1至组别5原液琼脂糖凝胶电泳结果；
图5为本发明实施例四原液琼脂糖凝胶电泳结果图，其中泳道1至5分别对应组别1至组别5原液琼脂糖凝胶电泳结果；
图6为本发明对比例1原液琼脂糖凝胶电泳结果图，其中泳道1为对比例1 原液琼脂糖凝胶电泳结果。
具体实施方式
如背景技术描述的，现有技术中常采用中空纤维或膜包对精纯后的质粒 DNA进行浓缩，并采用PBS缓冲液进行洗滤，但质粒回收率常常维持在 60％～70％间，而且在超滤浓缩中质粒超螺旋构型经常存在机械损伤，造成质粒质量的下降。
为了解决上述技术问题，本发明提出了一种质粒DNA原液制备方法，其包括以下步骤：平衡质粒DNA液温度至常温，进行预浓缩至质粒DNA终浓度为 500～1000μg/ml，得预浓缩液；采用含有多元醇的洗滤缓冲液对预浓缩液进行等体积洗滤，再浓缩至合适浓度。
本发明的质粒DNA原液制备方法通过控制温度条件，并同时采用质粒DNA 低浓度预浓缩及通过含多元醇的洗滤缓冲液进行洗滤，可有效减少质粒DNA的聚集沉淀及机械损伤，超螺旋含量可达93％以上，显著提高了质粒DNA的超滤回收率，回收率可高达85％以上。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明将通过以下实施例作进一步说明。本发明方法中超滤膜包和夹具均为默克密理博公司。所用的试剂均为药用级。
回收率计算方法：回收率＝(DNA疫苗原液体积×DNA疫苗原液浓度)/(DNA 精纯后液体积×DNA精纯后液浓度)×100％
实施例一
本实施例示出了一种质粒DNA原液制备方法，具体包含以下步骤：
(1)温度平衡：将质粒DNA精纯后液平衡至25℃，测定浓度后，分成5 份；
(2)预浓缩：将平衡后的质粒DNA精纯后液用300kD超滤膜包，分别浓缩至终浓度为500μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml，等体积维持至预浓缩结束，得预浓缩液；
(3)洗滤：采用洗滤缓冲液对预浓缩液洗滤5倍，其中洗滤缓冲液中甘露醇浓度为2.5％、磷酸盐浓度为50mmol/L，洗滤缓冲液pH值为7.5；
(4)浓缩：按DNA精纯后液浓度值计算浓缩至2.5mg/ml所需浓缩倍数，并按此倍数进行浓缩。
本实施例结果见表1，通过改变预浓缩倍数，使得预浓缩时质粒浓度不同，造成了样品的粘度差异，当预浓缩质粒浓度在500～1000μg/ml时，质粒回收率均在85％以上，减少了质粒聚团以及降低机械损伤造成的超螺旋含量损失，而当质粒预浓缩浓度提高至1500μg/ml以上时，粘度过高，部分质粒可能损失在膜包之中，难以洗脱回收，导致质粒回收率显著降低。
表1实施例一数据
实施例二
本实施例示出了一种质粒DNA原液制备方法，具体包含以下步骤：
(1)温度平衡：将DNA精纯后液平衡至25℃，测定浓度后，分成5份；
(2)预浓缩：将平衡后的质粒DNA精纯后液用300kD超滤膜包，分别浓缩至终浓度为1000μg/ml，等体积维持至预浓缩结束，得预浓缩液；
(3)洗滤：采用洗滤缓冲液对预浓缩液洗滤5倍，其中洗滤缓冲液中甘露醇浓度分别为0％、1％、2.5％、5％、10％；磷酸盐浓度为50mmol/L，洗滤缓冲液pH值为7.5；
(4)浓缩：按DNA精纯后液浓度值计算浓缩至2.5mg/ml所需浓缩倍数，并按此倍数进行浓缩。
本实施例结果见表2，通过改变洗滤缓冲液中的甘露醇浓度，对样品进行洗滤发现，无论是否添加甘露醇，预浓缩质粒浓度为1000μg/ml时，质粒回收率无显著差异。而添加1％～10％的甘露醇能显著减少超螺旋含量的损失，这表明甘露醇可有效减少了质粒DNA在浓缩过程中的氧化或机械损伤。
表2实施例二数据
实施例三
本实施例示出了一种质粒DNA原液制备方法，具体包含以下步骤：
(1)温度平衡：将DNA精纯后液分成四份，分别平衡至4℃，10℃，20℃， 30℃；
(2)预浓缩：将平衡后的质粒DNA精纯后液用300kD超滤膜包，分别浓缩至终浓度为1000μg/ml，等体积维持至预浓缩结束，得预浓缩液；
(3)洗滤：采用洗滤缓冲液对预浓缩液洗滤5倍，其中洗滤缓冲液中甘露醇浓度分别为2.5％，磷酸盐浓度为50mmol/L，洗滤缓冲液pH值为7.5；
(4)浓缩：按DNA精纯后液浓度值计算浓缩至2.5mg/ml所需浓缩倍数，并按此倍数进行浓缩。
本实施例结果见表3，通过不同温度条件下进行超滤浓缩发现，在20℃以下时，质粒回收率显著低于20～37℃。而20～37℃处理组，质粒回收率和超螺旋含量无显著差异。其中，实际应用中维持37℃温度，成本较高，故使用20-30℃较为合适。
表3实施例三数据
实施例四
本实施例示出了一种质粒DNA原液制备方法，具体包含以下步骤：
(1)温度平衡：将DNA精纯后液测定浓度后分成五份，温度平衡至25℃；
(2)预浓缩：将平衡后的质粒DNA精纯后液用300kD超滤膜包，分别浓缩至终浓度为1000μg/ml，等体积维持至预浓缩结束，得预浓缩液；
(3)洗滤：采用洗滤缓冲液对预浓缩液洗滤5倍，其中洗滤缓冲液中多元醇浓度分别为2.5％，磷酸盐浓度为50mmol/L，洗滤缓冲液pH值为7.5，其中多元醇分别为甘露醇、甘油、山梨醇、木糖醇；
(4)浓缩：按DNA精纯后液浓度值计算浓缩至2.5mg/ml所需浓缩倍数，并按此倍数进行浓缩。
本实施例结果见表4，通过用不同的多元醇进行超滤洗滤，结果表明，是否添加多元醇不影响浓缩回收率，但对超螺旋含量有显著影响。而不同种类的多元醇的超滤浓缩回收率及超螺旋含量无显著差异。因此，在超滤浓缩洗滤过程中，在洗滤缓冲液中添加多元醇能有效减少质粒的氧化损伤或机械损伤，提高制品质量。
表4实施例四数据
对比例1
本实施例示出了一种质粒DNA原液制备方法，具体包含以下步骤：
(1)温度平衡：将质粒DNA精纯后液平衡至2-8℃；超滤之前的质粒DNA 样品为中间品，常保存在低温环境中的；
(2)浓缩：按DNA精纯后液浓度值计算浓缩至2.5mg/ml所需浓缩倍数，并按此倍数进行浓缩；
(3)洗滤：采用洗滤缓冲液对浓缩液洗滤5倍，其中洗滤缓冲液中磷酸盐浓度为50mmol/L，氯化钠浓度为150mmol/L，洗滤缓冲液pH值为7.5，不含有多元醇。
表5对比例数据
从表5可知，现有采用中空纤维或膜包对精纯后的质粒DNA进行浓缩，并采用PBS缓冲液进行洗滤，获得质粒DNA原液，但是在超滤浓缩中质粒超螺旋构型的损伤及回收率总体偏低。一般情况下，现有技术中洗滤缓冲液中会添加100-200mmol/L氯化钠，以促进质粒DNA溶解，有助于质粒回收。但本发明人实施现有原液制备过程中无意发现，按常规添加100mmol/L氯化钠后反而会降低质粒的溶解影响质粒的回收率，其中质粒的长度越长，对氯化钠浓度越敏感，即质粒DNA极易在浓缩洗滤过程中，部分沉淀在膜包或中空纤维柱中严重影响回收率。进而本发明人进行大量的实验提出了本发明的质粒DNA原液制备方法，具体地，其通过控制温度条件以将浓缩前的质粒DNA平衡指常温状态，解决了现有技术在低温条件下的质粒DNA粘性显著增加，导致其在超滤过程中存在质粒聚团及机械损伤等问题；本发明还采用质粒DNA低浓度预浓缩，解决了现有技术中DNA浓度高使其粘性变大更易造成质粒聚团及机械损伤等问题；本发明进一步通过含多元醇的洗滤缓冲液进行洗滤，解决了现有技术质粒DNA 在浓缩后洗滤操作过程中缺乏对其酸碱性、氧化性和机械损伤的保护，造成质粒质量的下降；而且，所使用的洗滤缓冲液不添加氯化钠，避免添加氯化钠后影响质粒DNA的溶解。
需要说明的是，从表1-3、表5可知，本发明的技术效果是各个步骤技术特征协同作用的总和，各步骤之间具有一定的内在相关性，并非单个技术特征效果的简单叠加。本发明通过①控制温度条件，并同时②采用质粒DNA低浓度预浓缩及③通过含多元醇的洗滤缓冲液进行洗滤，可有效减少质粒DNA的聚集沉淀及机械损伤，超螺旋含量可达93％以上，显著提高了质粒DNA的超滤回收率，回收率可高达85％以上。本发明产生的上述效果是相互协同所得到的，是不可分割的。而且本发明无需对整个超滤工艺进行变更，仅通过对质粒DNA浓度、液温度和洗滤缓冲液配方进行处理即可显著增加质粒DNA超滤浓缩回收率，操作简单，重复性高，易于产业规模化应用。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
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