具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

电化学免疫传感器以其抗体-抗原反应的特异性和亲和力、高灵敏度、低成本、高效率和可移植性等优点在临床疾病诊断中得到了广泛的关注。最近有报道，如Liu等利用无模板水热技术合成了铌酸铈/氧化铈空心纳米球来检测瘦素。然而，他们并没有对不同BMI的人群进行检测。

此外，发明人研究发现，现有关于瘦素的生物传感器灵敏度低，一般为0.001-0.042μg/mL，而且瘦素的生物传感器选择性、抗干扰性、重现性和稳定性有待提高，或者无法兼顾这些性能，导致瘦素的生物传感器的使用受限。

为了解决这些问题，本发明提出一种电化学生物传感器及其制备方法和应用，使用还原氧化石墨烯-金纳米复合材料(rGO-Au)修饰电极和生物纳米胶囊(ZZ-BNC)来垂直定位抗体检测瘦素。检测范围为0.001～1000pg/mL，检出限为0.00087pg/mL。与现有的传感器相比，本发明所述生物传感器具有更高的选择性、灵敏度和抗干扰能力。同时生物传感器能够检测饮食诱导的肥胖小鼠模型中的瘦素，并与酶联免疫分析法(ELISA)检测结果很好地吻合。在不同体重指数(BMI)的人群中，生物传感器的检测结果也各不相同。因此，本发明基于定向抗体固定化的电化学生物传感器是实际样本中瘦素检测的有效平台，并可能在肥胖疾病的评估中有广泛的应用。

抗体定向固定在传感器芯片表面是提高免疫传感器灵敏度和特异性的重要标准之一。一般来说，抗体连接主要是通过与金的化学交联来固定的，或通过抗体与蛋白质A或蛋白质G连接。这些固定方法通常使用试剂-与蛋白质的氨基非特异性反应，将抗体或其他相互作用的分子结合到传感器表面，因此Fv并不是导向溶剂。

ZZ-BNC是由乙型肝炎病毒包膜L蛋白与蛋白A衍生的Fc-binding Z域串联融合而成，用于使抗体垂直固定，以增强抗原与抗体的结合能力的物质。有研究表明，ZZ-BNC由于其特殊的抗体定向固定，确实提高了免疫传感器的敏感性、抗原结合能力和亲和力。此外，选择具有优异导电性能的纳米材料，提高抗体的垂直固定对提高传感器的分析性能具有重要意义。

具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：

本发明第一方面，提供一种电化学生物传感器，包括：还原氧化石墨烯-金(rGO-Au)纳米复合材料、生物纳米胶囊、瘦素抗体和电极，所述还原氧化石墨烯-金纳米复合材料、生物纳米胶囊、瘦素抗体修饰于电极表面。

在本发明一些实施方式中，将rGO-Au纳米复合材料用于修饰电极，其稳定性高、生物相容性好、电导率高、比表面积大，这些优点为生物特异性识别和电子信号转导提供了良好的条件。因此，它可以作为玻碳电极的改性材料。然后利用ZZ-BNC作为电极材料与抗体的结合剂，构建快速检测人血清中瘦素的免疫传感器。同时检测不同饮食模式小鼠和不同BMI人群的血清瘦素水平，为进一步研究肥胖的发病机制提供科学依据。

未来进一步提高电化学生物传感器灵敏度，在一些实施方式中，所述电极为玻碳电极，所述生物纳米胶囊由乙型肝炎病毒包膜L蛋白与蛋白A衍生的Fc-binding Z域串联融合而成。

本发明第二方面，提供一种电化学生物传感器的制备方法，分别将还原氧化石墨烯-金纳米复合材料、生物纳米胶囊、瘦素抗体置于电极表面，干燥。

其中，在不同材料置于电极表面上时，都要保证前一种材料已经烘干固定，避免后一成分影响前一成分。

实验研究发现，生物纳米胶囊可充当胶黏剂的作用，连接还原氧化石墨烯-金纳米复合材料和瘦素抗体，并且有助于三者在电极上稳定存在，赋予电化学生物传感器较好的稳定性。因此在一些实施方式中，先将还原氧化石墨烯-金纳米复合材料置于电极表面，干燥，再将生物纳米胶囊置于电极上孵育，再将瘦素抗体置于电极上孵育，即得。

为了保证电极上均匀负载功能成分，在一些实施方式中，所述还原氧化石墨烯-金纳米复合材料为悬浮液，浓度为2-10mg/mL。实验研究发现，当还原氧化石墨烯-金纳米复合材料悬浮液浓度为5mg/mL时，在电极表面负载效果最好。

在一些实施方式中，所述生物纳米胶囊浓度为0.01-0.5μg/mL，优选为0.1μg/mL；所述瘦素抗体浓度为5-45ng/mL，优选为25ng/mL。

还原氧化石墨烯-金纳米复合材料为悬浮液、生物纳米胶囊、瘦素抗体溶剂的溶剂均为PBS。

纳米材料提高电化学性能，生物纳米胶囊用来固定抗体，抗体用来捕获瘦素。

将还原氧化石墨烯-金纳米复合材料、生物纳米胶囊修饰的电极与瘦素抗体共同孵育30、60、90、120和150min，以优化免疫传感器系统的孵育时间。瘦素抗体的孵育时间极大地影响了免疫传感器的反应。在孵育较短时间时，瘦素抗体可能不能有效地固定在电极表面。但是，如果时间过长，可能会导致电极表面吸附的蛋白质量过高，电极表面被绝缘，甚至被破坏。因此，最终选择120min为瘦素抗体的最佳孵育时间。

将rGO-Au纳米复合材料用于修饰电极，其稳定性高、生物相容性好、电导率高、比表面积大，这些优点为生物特异性识别和电子信号转导提供了良好的条件。因此，它可以作为玻碳电极的改性材料。然后利用ZZ-BNC作为电极材料与抗体的结合剂，构建快速检测人血清中瘦素的免疫传感器。同时检测不同饮食模式小鼠和不同BMI人群的血清瘦素水平，为进一步研究肥胖的发病机制提供科学依据。

还原氧化石墨烯-金纳米复合材料(rGO-Au)在前人研究方法的基础上进行稍微修改，制备了均质rGO-Au纳米复合材料。将20mg氧化石墨烯放入20mL超纯水中超声分散2小时。然后加入浓度为20mM的100μL HAuCl₄溶液，搅拌30min后置于95℃水浴中。同时加入还原剂2mL 50％水合肼溶液，95℃反应2h。然后加入15mg PVP，搅拌1h。将均匀溶液以14000rpm离心澄清，然后用乙醇和双蒸馏水的混合物清洗沉淀物至少三次。最后，将体积稳定到5mg/mL保存于4℃冰箱中。还原氧化石墨烯采用类似的方法制备，没有添加HAuCl₄溶液。

本发明第三方面，提供一种电化学生物传感器在检测瘦素中的应用。

本发明第四方面，提供一种瘦素电化学生物传感器，包括电化学生物传感器。

由于肥胖有很多成因，不同成因的肥胖症状原因不同，因此其缓解方案不同。

肥胖成因包括但不限于遗传因素、饮食因素、活动因素、性别与职业因素、年龄因素、精神因素、代谢因素、内分泌因素、微量元素、睡眠因素等。

实验研究发现，本发明一些实施方式所述瘦素电化学生物传感器用于检测饮食诱导的肥胖症状中瘦素的含量时，检测限更低，检测范围大，选择性、稳定性更好。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

(1)rGO-Au的制备

将20mg氧化石墨烯放入20mL超纯水中超声分散2小时。然后加入浓度为20mM的100μL HAuCl₄溶液，搅拌30min后置于95℃水浴中。同时加入还原剂2mL 50％水合肼溶液，95℃反应2h。然后加入15mg PVP，搅拌1h。将均匀溶液以14000rpm离心澄清，然后用乙醇和双蒸馏水的混合物清洗沉淀物至少三次。最后，将体积稳定到5mg/mL保存于4℃冰箱中。还原氧化石墨烯采用类似的方法制备，没有添加HAuCl₄溶液。

(2)电极修饰

采用直径为0.3和0.05μm的氧化铝粉对GCE表面进行精心打磨，以去除氧化层。然后用双蒸馏水和乙醇对电极表面进行超声波清洗，以去除其他物理吸附物质。随后GCE立即在氮气中干燥。将10μL的rGO-Au悬浮液(5mg/mL)置于GCE表面，自然干燥后，10μL 0.1μg/mLZZ-BNC滴到电极上孵育60min，然后10μL 25ng/mL瘦素抗体(anti-leptin)孵育120min获得rGO-Au-ZZ-BNC-anti-leptin/GCE，最后加入10μL 1％牛血清白蛋白(BSA)孵育30min，切断非特异性位点，得到rGO-Au-ZZ-BNC-anti-leptin-BSA/GCE(图1)。每一步修饰后，用磷酸盐缓冲溶液(PBS)轻轻洗涤电极。

(3)ZZ-BNC的表征

在盖玻片滴加ZZ-BNC(0.1μg/mL 10μL)在室温下孵育60min。然后anti-leptin(25ng/mL 10μL)孵育120分钟。在空气中干燥后使用原子力显微镜(AFM)进行观察。

(4)检测方法介绍

采用循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)对电极修饰过程进行表征。在10mM铁氰化钾(K₃[Fe(CN)₆])溶液中进行了电化学检测。此外，由于DPV是伏安法中灵敏度最高的检测方法，因此也被应用于免疫传感器的优化研究、免疫传感器的分析特性以及真实样本分析部分。

(5)小鼠血清瘦素检测

20只6周龄健康雄性C57/B16小鼠置于标准笼子中，室温、湿度适宜，光/暗循环12h。小鼠实验方案经山东师范大学动物保护与利用委员会批准。随机分为正常脂肪饮食组(NFD)和高脂肪饮食组(HFD)。在调整饮食前，所有小鼠都用正常脂肪饲料喂养一周。HFD组小鼠饲喂高脂肪食物(60％脂肪功能)，NFD组小鼠饲喂正常食物(15％脂肪功能)。喂养至12周时，实验组按体重大于标准体重+2倍的NFD标准差作为标准选取5只肥胖小鼠，同时，测量体长和体重。此外，采集眼球血液和附睾脂肪组织。离心取血清(4℃，3000r/min,15min)。分别采用电化学法和Elisa法检测血清瘦素水平。同时将小鼠附睾脂肪组织置于专用脂肪固定液中，石蜡包埋后进行苏木精-伊红染色(HE染色)。用Eclipse CI-L相机显微镜选择组织靶区进行200次成像。成像完成后，使用Image-Pro Plus 6.0分析软件分别测量各切片的细胞直径和脂肪细胞总面积，并计算各图像中脂肪细胞的总数和密度。

(6)不同BMI人群血清瘦素检测

BMI是国际上常用的衡量人体肥胖程度和健康程度的标准。重度肥胖定义为BMI大于35kg/m²。本研究从济南市散发性社区人群中采集3例正常人群和3例肥胖人群的血清样本。样本的采集经山东师范大学医学伦理审查委员会批准，并由所有志愿者签署研究知情同意书。采用不含抗凝剂的采血血管采集空腹静脉血2～3mL，采集静脉血4℃离心(4000r/min，5min)。取上清获得血清样本，用密封膜密封，保存于-80℃冰箱中备用。在测量前，用0.1M PBS按1:10的比例稀释以减少干扰基质效应。最后，采用DPV进行检测。

实施例2性能与表征

(1)复合材料的表征

透射电镜(TEM)研究揭示了合成的氧化石墨烯、还原氧化石墨烯和还原氧化石墨烯-金纳米复合材料的形态结构。纯氧化石墨烯显示为透明薄膜，说明它在水溶液中完全脱落(图2A)。从图像中可以清楚地看到，还原氧化石墨烯成为褶皱结构(图2B)，10-20nm的球形金纳米颗粒均匀地分布在还原氧化石墨烯薄片上(图2C)。这表明rGO-Au纳米颗粒已成功合成。

图2D为拉曼光谱图，据图可知氧化石墨烯粒子在1350cm^-1和1600cm^-1附近有明显的D和G特征峰。与GO(0.91)相比，rGO-Au(1.25)和rGO(1.23)的D/G峰强度比(ID/IG)明显提高，这与Wu等人所做的工作相似。这表明氧化石墨烯的晶粒尺寸和结构在功能化反应中发生了明显的变化。同时也说明氧化石墨烯已成功地还原为还原氧化石墨烯。

(2)复合材料的电化学性能

在10mM K₃[Fe(CN)₆]中使用CV法研究了裸GCE、rGO/GCE和rGO-Au/GCE的电化学活性。各修饰电极在224和123mV处均有明确的氧化还原峰，这与铁氰化物离子在体系中的准可逆氧化还原性能有关(图3A)。裸GCE、rGO/GCE和rGO-Au/GCE的阴极峰值分别为90.49、177和213.4μA。由于双金属纳米复合材料的协同作用，rGO-Au/GCE的电化学性能最佳。与裸GCE相比，纳米复合材料的电流响应增加了2倍(2.36倍)。电活性面积的增加可能与rGO-Au纳米复合材料优异的导电性和比表面积的增加有关。上述结果表明，rGO-Au纳米复合材料适用于生物传感器的制备。

通过研究扫描速率对循环伏安法的影响，探讨了修饰电极的动力学。在10mM K₃[Fe(CN)₆]介质中，以10～200mV/s的扫描速率检测了rGO-Au/GCE的电化学性能。氧化还原反应的最大电流随扫描速率的增加呈线性增加，且氧化还原峰之间的距离越来越大(图3B)。基于以上结果，我们对氧化峰(Ipa)和还原峰(Ipc)的峰值电流与扫描速率的平方根(v^1/2)进行了线性拟合(图3C)。最终线性方程为Ipa＝22.39×v^1/2-21.10(R²＝0.999)，Ipc＝-5.54×v^1/2-21.52(R²＝0.999)。这些计算结果表明，免疫传感器是一种扩散控制的表面反应。

(3)抗体定向固定的表征和优化

采用原子力显微镜检测ZZ-BNC与瘦素抗体的结合能力。分别在修饰好rGO-Au的盖玻片上直接滴加瘦素抗体(图2E)和滴加ZZ-BNC后再加瘦素抗体(图2F)，它们的高度和粗糙度分别为74.02nm和12.83nm。经ZZ-BNC修饰后，高度和粗糙度分别增加了38.31nm和10.89nm，可能与抗体定向固定化有关。

还研究了瘦素抗体浓度对rGO-Au/GCE电极的影响，获得了一种灵敏度高、重现性好的免疫传感器系统。设计不同浓度的瘦素抗体(5、15、25、35和45ng/mL)免疫传感器测定1pg/mL瘦素标准液。当浓度低于25ng/mL时，抗体在电极上的加载不完全(图6A)。当浓度进一步增加时，电化学反应不会发生明显变化。因此，25ng/mL为构建免疫传感器的最佳浓度。

此外，将修饰电极与瘦素抗体共同孵育30、60、90、120和150min，以优化免疫传感器系统的孵育时间。瘦素抗体的孵育时间极大地影响了免疫传感器的反应(图6B)。在孵育较短时间时，瘦素抗体可能不能有效地固定在电极表面。但是，如果时间过长，可能会导致电极表面吸附的蛋白质量过高，电极表面被绝缘，甚至被破坏。因此，最终选择120min为瘦素抗体的最佳孵育时间。

为了研究瘦素免疫传感器的制作过程，在10mM K₃[Fe(CN)₆]中进行了DPV测量(图3D)。在rGO-Au/GCE表面滴加ZZ-BNC后，其峰值电流降低，表明ZZ-BNC成功地与Au纳米颗粒结合。在加入瘦素抗体后，电流进一步降低，说明ZZ-BNC的ZZ端成功地与抗体结合，可以说明ZZ-BNC可以起到连桥的作用。为了阻断非特异性位点而滴加BSA，电流进一步降低。每一步中附加的蛋白质阻碍了电子转移，导致观察到的电导率下降。这些结果表明瘦素生物传感器已成功制备。

(4)瘦素免疫传感器检测性能研究

在最优的实验条件下，在10mM K₃[Fe(CN)₆]溶液中使用不同浓度的瘦素免疫传感器测定了其分析性能。DPV测量显示，峰值电流信号随着瘦素浓度的增加而降低(图4A)。这种性能的下降是由于滴加瘦素后抑制了电极电子转移能力。所构建的瘦素免疫传感器显示出从0.001到1000pg/mL的广泛线性范围，检测限为0.00087pg/mL。计算线性回归方程为I＝-3.94lg C(leptin)+38.15(R²＝0.999)(图4B)。将该新型免疫传感器与之前免疫传感器的线性范围、检测限和灵敏度进行比较，发现制备的瘦素免疫传感器具有更宽的线性检测范围(表1)。

表1.用于肿瘤标志物检测的电化学传感器的比较

(5)瘦素电化学生物传感器的选择性、抗干扰性、重现性和稳定性由于生物样品组成复杂，免疫传感器必须具有优良的选择性和抗干扰的能力。以BSA、TNF-ɑ和IL-6为干扰物质，评价所制备的免疫传感器的选择性和抗干扰性能。通过观察1pg/mL leptin、BSA、TNF-ɑ和IL-6的电化学反应来检测传感器的选择性(图4C)。此外，通过检测1pg/mL leptin和1pg/mL leptin与1pg/mL BSA、TNF-ɑ或IL-6的混合物作为干扰物的电化学反应来评估修饰电极的抗干扰能力(图4D)。从图4A和图4B可以看出，基于定向抗体固定化构建的传感器对检测瘦素具有良好的选择性和抗干扰性。

在一段时间内对传感器的稳定性进行了评估。在4℃冰箱中储存一周后，rGO-Au/GCE的电流值仅下降了3.15％，说明其具有良好的耐久性(图4E)。此外，通过检测5次相同的瘦素浓度(1pg/mL)来评估免疫传感器的重现性，测量值之间的相对标准偏差(RSD)为4.66％(图4F)。这表明该免疫传感器具有可接受的重现性。

(6)不同饮食模式小鼠血清瘦素的检测

12周肥胖组小鼠体重、体长均高于正常组，差异有统计学意义(表2)。对于实验组，在体重方面，NFD 2周后检测到体重增加，并在4周后变得明显，6周后体重差异更加明显(51.72％)。然而，对照组的体重增加不明显(19.40％)(图7)。同时对附睾脂肪组织进行HE染色，证明小鼠肥胖模型的成功建立，证明肥胖模型是成功的。同时对附睾脂肪组织进行HE染色，证明小鼠肥胖模型的成功建立。

表2不同组小鼠的体重、身长和Lee指数

在相同的放大倍数下，根据HE染色实验结果，我们可以发现12周肥胖组的脂肪细胞数量远少于正常组，细胞面积明显大于正常组(表3)。肥胖组脂肪组织直径约为正常脂肪组织直径的2倍。肥胖脂肪组织的细胞数量大约是正常脂肪组织的两倍(图5A和图5B)。可以看到肥胖组脂肪组织的细胞体积明显增大，单位面积脂肪空泡数量减少，胞核被挤压呈扁平状、少见；个别的脂肪细胞破裂，相互融合。

表3 HE染色中不同组小鼠脂肪细胞平均直径、数目、面积和密度统计

用PBS稀释血清进行电化学检测(1:1稀释)，可以清楚地看到HFD(高脂肪饮食组)的血清瘦素水平(1213.43pg/mL)远远高于NFD(正常脂肪饮食组)的血清瘦素水平(456.02pg/mL)。同时采用ELISA法进行比较，所得结果与电化学检测方法一致(图5C)。

(7)不同BMI人群血清瘦素的检测

BMI是国际上常用的衡量人体肥胖程度和健康程度的标准。重度肥胖定义为BMI大于35kg/m²。进行电化学检测和统计分析。如图8所示，肥胖人群的血清瘦素含量明显高于正常人。很明显，血清瘦素水平随体重指数而变化。一般来说，BMI越高，血清中的瘦素就越高(图5D)。

综上所述，本发明实施例开发了一种定向抗体固定化的电化学平台，用于检测不同肥胖指标的小鼠和不同BMI人群中的血清瘦素含量。制备的电极具有良好的电化学性能：线性检测范围宽，灵敏度高，检测限低。总的来说，免疫传感器的性能优于前面描述的大多数瘦素传感器。此外电化学检测不同饮食模式小鼠瘦素含量与ELISA结果一致。更重要的是，该生物传感器优异的检测性能为其在临床检测中的应用奠定了坚实的基础。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。