检测转基因蛋白的无标记型AuNPs-Thi电化学免疫传感器及其制备方法
阅读说明：本技术 检测转基因蛋白的无标记型AuNPs-Thi电化学免疫传感器及其制备方法 (Unmarked AuNPs-Thi electrochemical immunosensor for detecting transgenic protein and preparation method thereof ) 是由 曾海娟 王金斌 杨倩雯 于 2021-08-30 设计创作，主要内容包括：检测转基因蛋白的无标记型AuNPs-Thi电化学免疫传感器及其制备方法,在玻碳电极表面电沉积金纳米粒子AuNPs,硫堇Thi稳定吸附在AuNPs表面形成AuNPs-Thi膜；转基因蛋白-mAb抗体共价结合于AuNPs-Thi膜上,再以BSA进行封闭。本发明在电极表面电沉积AuNPs后吸附适量Thi,显著增强电化学信号,再通过氨基交联作用将转基因蛋白的抗体连接到AuNPs-Thi膜上,利于传感器的长期稳定性和灵敏度,该方法简单、快速,所需抗体量少,具有较高的灵敏度、良好的特异性和重现性,为电化学免疫检测转基因作物中的转基因蛋白提供了一种新方法。(A non-marking AuNPs-Thi electrochemical immunosensor for detecting transgenic protein and a preparation method thereof are disclosed, wherein gold nano particles AuNPs are electrodeposited on the surface of a glassy carbon electrode, and thionine Thi is stably adsorbed on the surface of the AuNPs to form an AuNPs-Thi film; the transgenic protein-mAb antibodies were covalently bound to AuNPs-Thi membranes and blocked with BSA. According to the invention, a proper amount of Thi is adsorbed after AuNPs are electrodeposited on the surface of an electrode, an electrochemical signal is obviously enhanced, and then the antibody of the transgenic protein is connected to the AuNPs-Thi membrane through an amino crosslinking effect, so that the long-term stability and sensitivity of the sensor are facilitated.)
技术领域
本发明属于食品安全免疫检测技术领域，具体涉及一种检测转基因蛋白的无标记型AuNPs-Thi电化学免疫传感器及其制备方法。
背景技术
随着基因工程技术的不断发展，转基因作物的种植面积逐年扩大，其安全性成为人们关注的焦点。尽管我国对转基因作物及产品已经实施了强制性的标识条例，但仍有许多非法种植，销售转基因作物的案例发生。因此，开发一种简单，快速，高灵敏的转基因作物鉴定方法，对转基因作物及其产品的监管具有重要意义。
对转基因作物的检测中，基于核酸水平的检测，灵敏度高，但依赖仪器并对操作人员有一定的技术要求；基于蛋白质水平的检测方法，操作简单，检测时间短，对样品的前处理要求低，最适于目标物的现场快速检测。其中，免疫传感器具有可定量，特异性强，易操作等优点，目前已成为快速检测方法的研究热点。
在PAT蛋白的检测中，快速检测方法多依赖于免疫学技术，而免疫学速测技术，如免疫层析试纸条等，只能提供半定量的检测结果。迫切需要一种快速、灵敏、定量检测方法用于田间、仓储等环节的农作物的痕量检测。
基于PCR技术的检测方法灵敏度较高，但实验过程繁琐复杂且耗时长。免疫层析试纸条(ICS)能快速地的检测目标物，但其灵敏度偏低，且不能定量。电化学免疫传感器(electrochemiluminescence，ECL)具有较高的灵敏度，但传统的ECL试剂存在一些缺点，如高毒性及耗时长，现有转基因蛋白的不同检测方法性能比较见表1。
表1转基因蛋白的不同检测方法性能比较。
电化学免疫传感器可分为无标记型和标记型免疫传感器，因其灵敏度高，操作简单而备受关注。标记型免疫传感器虽然灵敏度较高，但在分析过程中需要用其他电活性物质对抗体或抗原进行标记。而无标记型免疫传感器，无需对抗体或抗原进行标记，通过简单的抗原-抗体特异性反应即可实现对目标样品的快速检测。
与标记型免疫传感器相比，无标记型免疫传感器制备过程简单，具有低成本，易于微型化，快速，简便等优势，广泛应用于各个领域的免疫分析中，是一种具有较高应用前景的定量检测方法。
Wang Z等(A novel oriented immunosensor based on AuNPs-thionine-CMWCNTs and staphylococcal protein A for interleukin-6 analysis incomplicated biological samples[J].Analytica Chimica Acta.2020,1140:145-152)开发了基于AuNPs/Thi/CMWCNTs(羧化多壁碳纳米管)的免疫传感器用于高灵敏检测白细胞介素-6(IL-6)，该方案中选取3种材料形成的复合材料修饰电极，也可达到高灵敏检测目标物的目的，但多壁碳纳米管修饰电极时易产生聚集现象，可能会导致构建的免疫传感器平行性较差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测转基因蛋白的无标记型AuNPs-Thi电化学免疫传感器及其制备方法，通过在GCE表面电沉积AuNPs，后吸附适量硫堇(Thi)构建了免疫传感器，增大了电极表面积和生物固载量，可以显著增强免疫传感器中的电化学信号，该方法简单，快速，所需抗体量少，且具有较高的灵敏度、良好的特异性和重现性，为电化学免疫检测转基因作物中的转基因蛋白提供了一种新方法。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测转基因蛋白的无标记型AuNPs-Thi电化学免疫传感器，其工作电极为玻碳电极，所述玻碳电极表面电沉积金纳米粒子AuNPs，硫堇Thi通过静电吸附作用稳定吸附在AuNPs表面形成AuNPs-Thi膜；转基因蛋白-mAb抗体共价结合于AuNPs-Thi膜上，以3-5％BSA为封闭剂。
进一步，所述金纳米粒子AuNPs的用量为：以1-1.5％HAuCl4溶液沉积3-4圈，电位范围为：0V～1.1V，50mV/s，所述硫堇Thi的用量为5-10μg。
又，所述转基因蛋白-mAb抗体的用量为2.5-3μg，所述封闭剂BSA的用量为5-10μL。
优选地，所述转基因蛋白为PAT蛋白，所述转基因蛋白-mAb抗体为PAT-mAb抗体。
本发明提供所述检测转基因蛋白的无标记型AuNPs-Thi电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
1)将清洗后的玻碳电极浸泡在HAuCl4溶液中，通过循环伏安法(Cyclicvoltammetry，CV)在电极表面电沉积金纳米粒子；
2)随后采用滴涂法将5-10μL Thi在室温下修饰于沉积有金纳米粒子的玻碳电极表面，Thi通过静电吸附作用稳定吸附在AuNPs表面形成AuNPs-Thi膜，并用0.25-0.5％戊二醛室温活化30-45min；
3)接着将转基因蛋白-mAb抗体滴加至步骤2)活化后的电极表面进行修饰，30-37℃孵育40-60min；
4)在电极表面滴加3-5％BSA，30-37℃放置40-60min，封闭非特异性结合位点，洗涤、室温干燥，获得检测转基因蛋白的无标记型AuNPs-Thi电化学免疫传感器。
进一步，步骤1)中，HAuCl4溶液的浓度为1-1.5％，电沉积3-4圈；步骤2)中，使用的Thi为0.75-1.0mg/mL的硫堇溶液，0.5％戊二醛的室温活化时间为30min；步骤3)中，转基因蛋白-mAb抗体的用量为2.5μg，步骤4)中，5％BSA的用量为5μL。
又，采用循环伏安法对电极的制备过程进行表征，以[Fe(CN)6]3-/4-作为氧化还原探针，CV扫描范围为-0.2V～0.6V，扫描速率为50mV/s。
优选地，整个构建过程均以双蒸水进行洗涤，室温干燥。
本发明提供所述无标记型AuNPs-Thi电化学免疫传感器在检测转基因蛋白中的应用。
进一步，所述应用中，铂丝电极为对电极，Ag-AgCl电极为参比电极，采用差分脉冲伏安法(Differential pulse voltammograms，DPV)对转基因作物中的PAT蛋白进行测定。
又，所述应用中，采用差分脉冲伏安法(Differential pulse voltammograms，DPV)对转基因作物中PAT蛋白进行测定，参数设定为：电位范围：0～0.4V；电位增量：4mV；振幅：0.05V；脉冲宽度：0.06s；采样宽度：0.02s；静置时间，2s；孵育时间：30min；所有测量均在室温下进行。
本发明以转基因作物中的外源转基因蛋白(如PAT蛋白)为检测目标，利用AuNPs和Thi构建了一种简单的无标记型电化学免疫传感器。硫堇(Thionine，Thi)是带有正电荷的阳离子染料，结构对称，可作为一种加速电子转移的活性物质，因其特有的电化学活性，用于增强电流信号，在本发明中同时作为一种连接剂，通过氨基与抗体相连。
本发明通过CV法在电极表面电沉积金纳米粒子，形成均匀的膜层结构，大大提高原有电极表面的固载能力，随后采用滴涂法将硫堇Thi修饰于沉积了金纳米粒子的电极表面，并进行活化。电极表面电沉积的AuNPs促进电子传输，实现传感器的信号放大，Thi通过静电吸附作用稳定吸附在AuNPs层表面，增大了电极表面积和生物固载量，并可以显著增强免疫传感器中的电化学信号，Thi修饰于电极表面后，进一步增加了峰电流值，可达到150μA。
由于因此，对Thi修饰时采用不同浓度及吸附时间进行对比。
本发明中，硫堇Thi的用量为5-10μg，Thi在AuNPs表面的吸附效果直接影响着免疫传感器的灵敏度，当硫堇浓度在0.75-1.0mg/mL时，电流变化值随着Thi浓度的增加而增大，当Thi浓度为1.0mg/mL时，电流变化值为40μA，大于1.0mg/mL时，电流变化值开始下降并趋于稳定，而过量Thi会附着于电极表面，阻碍电子传输，因此，本发明选用浓度为0.75-1.0mg/mL的硫堇溶液。
本发明中，电极表面的电流值随着修饰过程而不断发生变化，经Thi修饰后峰电流增加，当mAb抗体和BSA相继修饰于电极表面后，由于mAb和BSA的导电性差，阻碍电子的传递，峰电流逐渐减小。当mAb抗体捕获转基因蛋白后，电极表面的峰电流继续下降。通过测定不同浓度的标准品并绘制标准曲线，将待测样品中的电流值带入标准曲线中得出样品中转基因含量。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用AuNPs和Thi构建了一种新型的无标记型电化学免疫传感器，这种新型无标记策略，以简单的免疫反应引起电极表面的电流变化，对目的生物靶标做出快速，准确的分析，实现对转基因作物的高灵敏检测。
本发明中，电极表面电沉积AuNPs过程简单，简化了传统修饰电极方法的复杂实验过程，AuNPs作为低维功能纳米材料可以增加传感器的表面积，提高固载量，促进氧化化合物和传感器之间的电荷转移，促进电子传输，实现传感器的信号放大。
本发明在电极表面电沉积AuNPs后吸附适量Thi，不仅提高了电极的导电性，而且扩大了电极的表面积，提供了更多的结合位点，构建了一种简单、快速的无标记型免疫传感器，其中的AuNPs具有良好的导电性，增加电子转移速率，进而提高免疫传感器的灵敏度；Thi通过静电吸附作用稳定吸附在AuNPs层表面，增大了电极表面积和生物固载量，可以显著增强免疫传感器中的电化学信号。
本发明通过免疫反应将转基因蛋白捕捉到免疫传感器上，在保证高灵敏度的前提下仅需30min即可实现定量检测，大大缩短试验时间，极大地简化了实验步骤，检测方法简单、快速，所需抗体量少，且具有较高的灵敏度、良好的特异性和重现性，为电化学免疫检测转基因作物中的PAT蛋白提供了新方法。
本发明所构建的免疫传感器有效地提高了PAT蛋白的检测敏感度，其对大豆A2704-12和玉米BT-176的PAT蛋白检出限分别为0.02％和0.03％，在4℃保存15d和33d后，传感器仍能保持初始信号值的87.5％和82.5％，RSD为0.92％。
附图说明
图1为本发明实施例1中构建电化学免疫传感器检测PAT蛋白的原理图。
图2为本发明实施例1中AuNPs沉积在电极表面的SEM图像。
图3为本发明实施例1中CV表征免疫传感器的逐步组装过程。
图4为本发明实施例2中不同浓度大豆A2704-12的DPV峰电流。
图5为本发明实施例2中免疫传感器检测大豆A2704-12的标准曲线。
图6为本发明实施例2中不同浓度玉米BT-176的DPV峰电流。
图7为本发明实施例2中免疫传感器检测玉米BT-176的标准曲线。
图8为本发明实施例2中免疫传感器的特异性检测结果。
图9为本发明实施例2中CV测量免疫传感器的稳定性。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
抗PAT蛋白的单克隆抗体(PAT-mAb)购于上海容晖生物公司；戊二醛、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)和硫堇(Thionine，Thi)均购于Sigma(美国密苏里州圣路易斯市)；蛋白含量为100％和5％的所有转基因作物种子粉末标准品系购于ERM(Geel,Belgium,European)和AOCS(Urbana，Illinois，USA)，蛋白含量为1％的所有转基因作物种子粉末购于农业农村部；所有的化学品和溶剂都是分析纯试剂。
电化学测量均在CHI660E电化学工作站(上海辰华)进行，采用三电极体系在室温进行检测；工作电极为玻碳电极(GCE，d＝3mm)，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极。紫外-可见吸收光谱使用NanoDrop2000c分光光度计(Thermo Scientific，MA，USA)进行；通过扫描电子显微镜(Scanning electron microscopy，SEM，日本)对修饰材料的微观外貌进行表征。
实施例1构建检测PAT蛋白的无标记型AuNPs-Thi电化学免疫传感器
所述无标记电化学免疫传感器的工作电极为玻碳电极，玻碳电极表面电沉积金纳米粒子AuNPs，硫堇Thi通过静电吸附作用稳定吸附在AuNPs表面形成AuNPs-Thi膜；PAT-mAb抗体以共价结合方式连接于AuNPs-Thi膜上，BSA作为封闭剂，参见图1，其构建过程如下：
1)工作电极按步骤抛光清洗干净，将清洗后的玻碳电极浸泡在1％HAuCl4溶液中，通过CV法在电极表面电沉积金纳米粒子，电位范围为：0V～1.1V，扫描速率为50mV/s；
2)采用滴涂法将Thi(5μL)修饰于玻碳电极GCE表面，将Thi滴涂至玻碳电极后，用0.5％戊二醛室温活化30min。
其中，由于Thi在AuNPs表面的吸附效果直接影响着免疫传感器的灵敏度，因此，对Thi修饰时采用不同浓度及吸附时间进行对比：
分别选用浓度为0.5mg/mL、1mg/mL和2mg/mL的Thi修饰于不同的玻碳电极表面，经2h室温孵育后，通过DPV法测定电流信号，结果显示，0.5mg/mL和2mg/mL时电流变化值小于25μA、1mg/mL时达到40μA。
用合适浓度的Thi修饰电极后，分别对比室温处理40min、60min、90min、120min及4℃过夜条件下的峰电流，利用DPV法测定其峰电流信号，选择峰电流变化大的时间为合适的孵育时间，结果显示：随着反应时间的增加，电流的信号强度逐渐增强，在4℃过夜处理后得到最大电流响应。
经多次实验筛选，选定处理条件为1.0mg/mL Thi 4℃过夜滴涂至玻碳电极时，能得到更好的信号放大效果，实现传感器的高灵敏检测。
为了更直观的看到修饰过程中电极表面的变化，通过扫描电镜对修饰电极表面的微观外貌进行观察，如图2，电沉积的AuNPs在电极表面形成了均匀的膜层结构，证明AuNPs已成功修饰，大大提高了原有电极表面的固载能力。
3)将PAT-mAb抗体滴加到经戊二醛活化的电极表面，37℃孵育40min；
4)在电极表面滴加5％BSA(5μL)，37℃放置40min，阻断剩余的活性位点，整个修饰过程均以双蒸水进行洗涤，室温干燥，获得检测PAT蛋白的无标记型AuNPs-Thi电化学免疫传感器，4℃保存备用。
采用循环伏安法对电极的制备过程进行表征，[Fe(CN)6]3-/4-作为氧化还原探针，在含有5mM[Fe(CN)6]3-/4-和0.1M KCl的PBS(0.1M，pH 7.4)缓冲液中，CV扫描范围为-0.2V～0.6V，通过CV以50mV/s的扫描速度，对免疫传感器的构建过程逐一进行表征，参见图3。
由图3可见，裸GCE具有较低的峰电流，而当表面电沉积一层AuNPs后，其峰电流可达到120μA，当Thi修饰于电极表面后，进一步增加了峰电流值，达到150μA；当mAb和BSA相继修饰于电极表面后，由于mAb和BSA的导电性差，阻碍了电子的传递，峰电流逐渐减小。当抗体捕获PAT蛋白后，峰电流继续下降。
电极表面的电流值随着修饰过程而不断发生变化，验证了每一步试剂材料的成功修饰，电化学免疫传感器的成功构建，同时，证明了AuNPs/Thi能够极大的增强电流信号。
实施例2构建的免疫传感器的检测性能分析
1.样品处理及测定方法
将需要检测的转基因作物种子标准品(参见表2)用0.01M PBS缓冲液(pH 7.4)以1：3的质量体积比提取。
表2使用的转基因作物种子粉标准品清单
将种子粉末加入PBS后，剧烈摇晃3～5min，然后于6000rpm离心5min，使其分层收集上清，并稀释为不同浓度的转基因蛋白溶液进行检测，相应非转基因作物的上清液作为实验空白对照。实际种子样品经食品粉碎机或研钵研磨成粉末，按1：5比例加入双蒸水震荡混匀，8000rpm离心5min，取上清进行检测。
采用差分脉冲伏安法(Differential pulse voltammograms，DPV)对转基因作物中PAT蛋白进行测定，在含有5mM[Fe(CN)6]3-/4-和0.1M KCl的PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)中进行，参数设定为：电位范围，0～0.4V；电位增量，4mV；振幅，0.05V；脉冲宽度，0.06s；采样宽度，0.02s；静置时间，2s；孵育时间，30min；根据公式(1)计算电流差ΔI：
ΔI＝I0-I 公式(1)
其中，I0为空白作物上清液所测电流值，I为转基因作物上清液所测电流值，所有测量均在室温下进行。
2.传感器标准曲线的建立及灵敏度分析
在实施例1筛选出的条件下构建基于AuNPs/Thi的无标记型免疫传感器，将浓度为0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1.0％和1.5％的转基因大豆标准品A2704-12和转基因玉米标准品BT-176分别滴于制备好的工作电极表面进行DPV测定，并对所得电流变化值进行分析建立标准曲线，计算检出限。
对所构建免疫传感器的灵敏度进行检测，峰电流随着所测蛋白浓度的变化而变化，并在一定浓度范围内，呈现良好的线性关系。所含蛋白浓度范围为0.05％-1.5％的大豆A2704-12和玉米BT-176标准品检测结果如图4、图6所示，峰电流随着PAT蛋白浓度的增加而不断降低，这是由于电极表面PAT蛋白的增加阻碍了电子传递。
相应的标准曲线线性回归方程分别为ΔI＝22.424x+10.708(R2＝0.9936)和ΔI＝13.873x+5.7094(R2＝0.9933)(参见图5和图7)，其中，ΔI是电流信号变化(μA)，x是蛋白的浓度。最终得出，大豆A2704-12的检出限为0.02％，玉米BT-176的检出限为0.03％(S/N＝3)。
3.免疫传感器的特异性及稳定性检测
特异性是免疫传感器的一个重要指标，是否能够特异性的吸附PAT蛋白，影响着传感器的准确度和灵敏度。
为了评估所开发的免疫传感器的特异性，对转基因作物中普遍存在的11种干扰蛋白进行了检测，包括5％的玉米BT-176(BT-Cry1Ac/PAT)、玉米MIR604(BT-Cry3A)、玉米MON89034(BT-Cry1A105/Cry2Ab)、玉米MON88017(CP4-EPSPS/Cry3Bb1)、大豆RRS(CP4-EPSPS)、棉花MON88913(CP4-EPSPS)和甜菜H7-1(CP4-EPSPS)，1％的玉米MON810(BT-Cry1Ab)、玉米BT-11(BT-Cry1Ab/PAT)、大豆A2704-12(PAT)和油菜T45(PAT)等11种转基因样品的检测，应的非转基因作物上清为空白对照，评估所构建免疫传感器的特异性选择，并对其稳定性进行验证
如图8所示，PAT蛋白的峰电流变化明显高于其他蛋白，该传感器可以成功检测到含有PAT蛋白的大豆和玉米标准品，且不受CP4-EPSPS、BT-Cry1Ab、BT-Cry3A和BT-Cry1A105/Cry2Ab等蛋白的干扰，说明所研制的免疫传感器具有良好的特异性识别能力。
将构建的GCE/AuNPs/Thi/mAb/BSA在4℃保存15d和33d后，仍保持原有信号值的87.5％和82.5％。在存储33d后，CV连续扫描15圈得到稳定的电流信号(图9)，RSD为0.92％。
因此，本实施例所构建的免疫传感器具有良好的稳定性和重复性，可应用于转基因作物蛋白的分析中。
3.免疫传感器的回收率实验
用浓度为0.05％、0.1％、0.5％和1％的转基因玉米BT-176和转基因大豆A2704-12种子标准品进行加标回收实验，相应空白样品为空白对照，每个浓度的样品重复三次，评估所构建免疫传感器的适用性和准确性，结果如表3。
表3免疫传感器加标样品中PAT蛋白的回收率(n＝3)
由表3可见，相对标准偏差RSD均小于15.0％，玉米样品的回收率为98％～113％，大豆样品的回收率为85％～108％，表明所构建的电化学免疫传感器对PAT蛋白的检测具有良好的准确性，可应用于转基因作物的实际样品检测中。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种谷氨酸生物传感器的制备方法