一种从老鹰茶中提取分离呋喃酮类化合物的方法及其应用
阅读说明：本技术 一种从老鹰茶中提取分离呋喃酮类化合物的方法及其应用 (Method for extracting and separating furanone compounds from Litsea coreana and application thereof ) 是由 肖世基 方亦可 王一名 孙成新 董敏健 张涛 杨建文 于 2021-08-23 设计创作，主要内容包括：本申请公开了分离提取技术领域中一种从老鹰茶中提取分离呋喃酮类化合物的方法,包括回流提取、溶剂萃取、硅胶中压柱色谱分离以及高效液相色谱分离,最终得到呋喃酮类化合物,结构式如下所示,MTT活性测试显示该呋喃酮类化合物对人胰腺癌SW1990细胞具有很强的细胞毒活性,其IC50为2.520μg/mL。AO/PI双重荧光染色高剂量组晚期凋亡细胞数目明显增多,表明该呋喃酮类化合物能够促进人胰腺癌SW1990细胞凋亡,可用于制备潜在抗癌药物。(The application discloses a method for extracting and separating furanone compounds from Litsea Coreana in the technical field of separation and extraction, which comprises reflux extraction, solvent extraction, silica gel medium pressure column chromatography separation and high performance liquid chromatography separation to finally obtain the furanone compounds, the structural formula is shown as follows, MTT activity test shows that the furanone compound has strong cytotoxic activity on SW1990 human pancreatic cancer cells, and the IC50 of the furanone compound is 2.520 mu g/mL. The number of advanced apoptotic cells in a high-dose group subjected to AO/PI double fluorescent staining is obviously increased, which shows that the furanone compound can promote the apoptosis of SW1990 cells in human pancreatic cancer, and can be used for preparing potential anticancer drugs.)
技术领域
本发明涉及分离提取技术领域，具体为一种从老鹰茶中提取分离呋喃酮类化合物的方法及其应用。
背景技术
老鹰茶樟科木姜子属植物毛豹皮樟(Litsea coreana Lévl.var.lanuginosa(Migo)Yang et P.H.Huang)的嫩梢与叶，为一种药食同源草本茶，广泛分布于贵州、云南、四川等地，并且在贵州习水、务川、息烽、湄潭和开阳等地的偏远山村居民还保留老鹰茶饮用的习惯。《本草纲目》中记载老鹰茶具有“止咳、祛痰、平喘、消暑解渴”功效，现代研究证明老鹰茶具有抗氧化、降糖、降脂、抗炎、抗菌、抗病毒等功效，具有较大的开发应用前景。
现如今对于老鹰茶中化学成分的研究，主要是黄酮类、多酚类、二氢芪苷类等化合物，或者如中国专利CN108707133 A提到的一种木脂素类化合物及其从老鹰茶中提取分离的方法与应用，但是未曾有从老鹰茶中分离得到具有抗癌活性呋喃酮类成分的相关报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，设计一种从老鹰茶中提取分离呋喃酮类化合物的方法。
本发明的目的之一是提供一种从老鹰茶中提取分离呋喃酮类化合物的方法，所述呋喃酮类化合物的化学结构式为：
提取分离的步骤如下所示：
1)取老鹰茶地上部分，经干燥、粉碎后，用浓度90％的甲醇回流提取3～4次，每次提取3～4h，合并每次提取后过滤得到的提取液，减压浓缩得到甲醇浸膏；
2)将1)中所得甲醇浸膏分散于水后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3～4次，减压浓缩得到各萃取部份浸膏；
3)将2)中乙酸乙酯萃取部份浸膏通过柱层析法分离，用石油醚-乙酸乙酯以9:1、4:1、3:2、2:3、1:4和1:0体积比进行梯度洗脱，分为6个组分；
4)将3)中的石油醚:乙酸乙酯＝3:2部分利用HPLC进行分析，合并，再次利用柱层析法分离，色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯以9:1、4:1、3:2、2:3、1:4和1:0体积比进行梯度洗脱，分为5个亚组分；
5)将4)中得到的第2～3亚组分利用MCI拌样，去除色素，再次分离，得到10个亚组分；
6)将5)中得到的第8～10亚组分通过制备HPLC分离，检测波长210nm～280nm，流速2.0mL/min～20mL/min，用浓度85％～100％的甲醇等度洗脱，得到呋喃酮类化合物。
进一步的，步骤6)中检测波长为210nm～280nm，流速为2.0mL/min～20mL/min。
进一步的，步骤6)中使用浓度为90％～100％的甲醇梯度洗脱。
进一步的，步骤6)中色谱柱用C18，10μm，10mm×250mm，流速为20mL/min。
本发明首次从老鹰茶中提取到具有抗癌活性的呋喃酮类成分，并且提供的制备方法，工艺简单，分离方法可控性，重现性好，成本低，操作简单，适于推广应用。
本发明的目的之二是提供上述提取方法提取的呋喃酮类化合物在制备抗癌药物中的用途。
本发明的目的之三是提供上述提取方法提取的呋喃酮类化合物在制备抗胰腺癌药物中的用途。
本发明提供的呋喃酮类化合物的化学结构经过1HNMR、13CNMR波谱技术的鉴定，参考相关文献得到确认并具有以下理化常数和谱学特征。其核磁数据见表1。
表1：化合物的核磁数据(400/100MHz，CDCl3)
以上数据经与文献(Phytochemistry Letters,2015,11:32-36.)报道的(4S,5S,Z)-3-decylidene-4-hydroxy-5-methylbu-tanolide数据一致，结合质谱数据鉴定该化合物为(4S,5S,Z)-3-decylidene-4-hydroxy-5-methylbu-tanolide。
本发明以老鹰茶为原料，采用溶剂提取结合柱层析的方法得到呋喃酮类化合物，通过药理实验表明该呋喃酮类化合物具有较好的抗癌活性。
附图说明
图1为本发明呋喃酮类化合物的1H-NMR图；
图2为本发明呋喃酮类化合物的13C-NMR图；
图3为本发明呋喃酮类化合物对SW1990细胞毒作用对比图；
图4为本发明采用AO/PI双重染色法检测呋喃酮类化合物致SW1990细胞凋亡情况示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
本发明的呋喃酮类化合物的化学结构通式为：
实施例1：
从老鹰茶中提取分离上述呋喃酮类化合物的方法，包括以下步骤：
1)取毛豹皮樟来源的老鹰茶树叶17.81kg，经干燥、粉碎后，用浓度90％甲醇回流提取3次，每次提取3～4h，提取液进行减压浓缩得到甲醇浸膏2020g；
2)将1)中甲醇浸膏分散于水中，然后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，每个萃取部份减压浓缩得到各萃取部份浸膏，其中乙酸乙酯萃取部分浸膏889g；
3)将2)中乙酸乙酯部位浸膏通过硅胶中压柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯以体积比9:1、4:1、3:2、2:3、1:4、1:0梯度洗脱，分为6个组分，Fr.1～Fr.6；
4)将3)中第3个组分Fr.3(也是石油醚:乙酸乙酯＝3:2部分)通过硅胶中压柱色谱分离，再次用石油醚-乙酸乙酯以体积比9:1、4:1、3:2、2:3、1:4、1:0梯度洗脱，分为5个亚组分Fr.5.1～Fr.5.5；
5)将4)中得到的第Fr.5.2亚组分利用MCI拌样，去除色素，再次分离，得到10个亚组分Fr.5.2.1～Fr.5.2.10；
6)将5)中得到的第Fr.5.2.10亚组分通过制备HPLC分离，用浓度90％～100％甲醇梯度洗脱，色谱柱用C18，10μm，10mm×250mm，流速20mL/min洗脱，得到了20个亚组分Fr.5.2.10.1～Fr.5.2.10.20；将第Fr.5.2.10.12亚组分通过制备HPLC分离，用浓度90％甲醇梯度洗脱，色谱柱用C18，5μm，10mm×250mm，流速3mL/min洗脱，得到该呋喃酮类化合物。
将实施例1提取的呋喃酮类化合物的化学结构经过1HNMR、13CNMR波谱技术的鉴定，如图1和图2所示。
实施例2：
呋喃酮类化合物对人胰腺癌SW1990细胞株作用研究
(1)MTT法检测呋喃酮类化合物对人胰腺癌SW1990细胞株细胞毒作用：
选取对数生长期的人胰腺癌SW1990细胞，用含10％胎牛血清培养液调节细胞浓度为3×104个/mL，以每孔100μL，接种到96孔平底细胞培养板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养12h后，加入100μL样品，样品的浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、20μg/mL，设5个复孔，在37℃，5％，CO2培养箱中继续培养48h。然后每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)继续培养3h，弃去上清液。最后，每孔加入150μL DMSO，低速振荡20min使结晶物充分溶解，在490nm波长处检测吸光度值，并计算细胞存活率，细胞存活率＝实验组吸光度值/对照组吸光度值×100％。单因素方差分析各药物处理组与对照组的统计学差异性。结果显示呋喃酮类化合物具有极好的抗肿瘤活性(***代表P<0.001，具有统计学意义)，且呈浓度梯度依赖性。经计算，呋喃酮类化合物对人胰腺癌SW1990细胞株的IC50值为2.520μg/mL，实验结果见图3。
(2)吖啶橙和碘化吡啶(AO/PI)双重染色法检测所述呋喃酮类化合物对胰腺癌SW1990细胞株细胞凋亡的影响
选取对数生长期的人胰腺癌SW1990细胞，用含10％胎牛血清培养液调节细胞浓度为10×104个/mL，以每孔1mL，接种到24孔平底细胞培养板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养12h。吸出上清，加入500μL样品，样品的浓度分别为0、0.5、2μg/mL，在37℃，5％，CO2培养箱中继续培养24h。吸出上清，用PBS清洗细胞一次，每孔加入50μL PBS，50μL AO(100μg/mL)和50μL PI(100μg/mL)于孔板中，室温避光孵育10min后荧光显微镜下观察并拍照，实验结果见图4，对照组无明显凋亡细胞，高剂量组可见明显的晚期凋亡细胞增多，表现为细胞核为PI染色呈桔红色，细胞核浓聚和偏向，表明该呋喃酮类化合物能够促进人胰腺癌SW1990细胞凋亡，可用于制备潜在抗癌药物。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
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