噬菌斑的培养和观察方法
阅读说明：本技术 噬菌斑的培养和观察方法 (Method for culturing and observing plaques ) 是由 张俊会 于 2021-08-25 设计创作，主要内容包括：本发明为一种噬菌斑的培养和观察方法,以大肠杆菌为宿主,分离噬菌体,培养噬菌斑,包括水样的预检、制备菌悬液、水样处理与噬菌体增殖、噬菌体增殖液的稀释、噬菌体-宿主混合液的制备、夹层平板法培养噬菌斑和染色观察等步骤,最终观察到清晰的噬菌斑。大肠杆菌菌苔呈淡蓝色云雾状,噬菌斑则呈一个个深蓝透明的小圆形空斑。相比传统的双层平板法,本方法显著降低了实验的操作难度,降低了污染其它环境微生物的风险,提高了实验的成功率,是一种良好的教学实验方法,可应用于高校教学或相关技术人员培训中。本发明中的夹层平板法亦可用于其它噬菌体形成的噬菌斑的培养和观察,但需调整相关步骤。(The invention relates to a method for culturing and observing plaques, which takes escherichia coli as a host, separates phages, and cultures the plaques, and comprises the steps of water sample pre-detection, bacterial suspension preparation, water sample treatment and phage multiplication, phage multiplication liquid dilution, phage-host mixed liquid preparation, plaque culture by a sandwich plate method, staining observation and the like, and finally clear plaques are observed. The colibacillus lawn is light blue cloud, and the plaque is dark blue transparent small round plaque. Compared with the traditional double-layer plate method, the method obviously reduces the operation difficulty of the experiment, reduces the risk of polluting other environmental microorganisms, improves the success rate of the experiment, is a good teaching experiment method, and can be applied to the teaching of colleges and universities or the training of related technical personnel. The sandwich plate method of the present invention can also be used for culturing and observing plaques formed by other phages, but the relevant steps need to be adjusted.)
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种噬菌斑的培养和观察方法。
背景技术
噬菌体(phage)是感染细菌、放线菌及蓝细菌等原核生物的病毒，是遗传学、分子生物学和基因工程的常见实验材料，广泛存在于自然界的各个生境中。根据其侵染宿主后是否裂解宿主，可分为烈性噬菌体和温和噬菌体。烈性噬菌体会侵染宿主在菌苔上形成一个个具有一定形状、大小、边缘和透明度的噬菌斑。因每种噬菌体的噬菌斑有一定的形态，故可用作噬菌体的鉴定指标，也可用于纯种分离和计数。
噬菌体的分离纯化是普通微生物学实验、病原微生物学实验和环境工程微生物学实验等课程的必做项目之一。噬菌斑的培养和观察，是本实验项目的核心技术。目前，国内外教材多沿用Adams1959年发明的双层平板法，其主要步骤为:预先分别配制含2％和0.7％琼脂的底层培养基和上层培养基。先用底层培养基在培养皿上浇一层平板,待凝固。再把预先融化并冷却到45℃的上层培养基混合较浓的敏感宿主和一定体积的噬菌体待检液，混匀后铺平在已凝固的底层平板上，如存在能裂解宿主菌的噬菌体，则培养一段时间后，出现肉眼可见的噬菌斑。该方法存在几个显著的缺点：
(1)使用预先融化的上层培养基混合宿主和噬菌体，温度很难把握。低于45℃，上层琼脂在混合过程中即凝固，高于60℃，则噬菌体有灭活的风险，所以初学者往往手忙脚乱，且上层琼脂很容易因凝固而出现琼脂块。
(2)肉眼观察难度大。虽然用底层培养基补平，避免了玻璃培养皿底部凹凸不平，但由于大肠杆菌菌落无色半透明，琼脂虽透明亦呈现淡黄色，仅凭肉眼观察，初学者很难辨识噬菌斑。
(3)培养基营养丰富，对实验环境和操作技术要求较高，很容易被环境中的其它微生物污染，干扰实验结果。
(4)观察时间苛刻。尽管多数教程规定培养后18-24h观察。但实际上噬菌斑的最佳观察时间在培养的4-20h之间，超过20h往往会出现斑块界限模糊，可能是因为上层培养基很软，方便宿主或污染的其它杂菌在琼脂表面运动。
此外，在噬菌斑培养前期的噬菌体增殖环节，教材多选用大容量污水(200ml)直接增殖噬菌体。该步骤有两个缺陷，一是实验材料体积较大，操作不便；二是污水中同时包含多种微生物，这些微生物均可在营养丰富的牛肉膏蛋白胨液体培养基中增殖，因此，本步骤并没有选择性的增殖大肠杆菌噬菌体。
为了增加噬菌斑和背景的对比度，研究人员在上层琼脂中添加红四氮唑等染料，但染料对大肠杆菌的生长存在一定的抑制。或在培养后用2,3,5氯化三苯基四氮唑(TTC)染色，染色后倾去染料，染料被菌苔中的活细胞还原，从而使噬菌斑和菌苔呈现鲜明对比。然而上层琼脂软(0.7％)，硬度低，且大肠杆菌菌落与培养基结合不紧密，染色过程中很容易将菌苔冲起或将上层培养基破坏，进而也无法观察和计数噬菌斑。
发明内容
本发明为一种改良的噬菌斑培养和观察方法，在双层平板法的基础上，将底层琼脂改成无营养物的水琼脂，同时将双层平板改成三层，即两层水琼脂中间夹一层半固体琼脂，将宿主菌和噬菌体局限在中间层，这样既降低了环境中微生物在平板上定殖的风险，也使形成的噬菌斑都接近于同一平面上，避免了噬菌斑的上下重叠。培养完毕，洗去表层水琼脂上污染的其它杂菌，用低浓度亚甲基蓝染色后可清晰的观察到噬菌斑，噬菌斑的大小接近、边缘清晰，无上下噬菌斑的重叠现象。发明包括以下步骤：
步骤1：水样预检，选择总大肠菌群阳性的环境水样为噬菌体分离培养材料。
步骤2：制备菌悬液，无菌操作从伊红美兰培养基上挑取选择一个深紫红色、有金属光泽的菌落的单菌落，接种5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃，150rpm培养1～3hour。
步骤3：水样处理与增殖噬菌体，取污水2ml，4℃，10000rpm离心1min，收集上清，上清中加0.2ml氯仿涡旋1min，静置，收集上层液体1ml添加于5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基中，同时添加0.2ml大肠杆菌的菌悬液，37℃，150rpm过夜培养以增殖噬菌体。
步骤4：噬菌体增殖液的稀释，取2ml噬菌体增殖液4℃，10000rpm离心1min收集上清液，上清加0.2ml氯仿涡旋震荡1min，静置，上层液体为富集的噬菌体样品。用1％蛋白胨水将富集的噬菌体样品10倍倍比稀释到10-3～10-7。
步骤5：噬菌体、宿主混合液的制备，在制备好的噬菌体梯度稀释液中添加大肠杆菌悬液，添加比例为每1ml稀释液添加50μl菌悬液，颠倒混匀。
步骤6：夹层平板法培养噬菌斑，在无菌平皿中加入约5ml水琼脂，冷却待凝固。再在将混匀的宿主-噬菌体混合液倾倒在已经凝固的底层平板上，随即倾入一层保温的半固体培养基，混匀，每皿约10ml，静置待凝。最后，再倒入一层保温的水琼脂，每皿约10ml，凝固后倒置37℃培养过夜。
步骤7：染色观察噬菌斑，缓缓用流水清洗夹层平板表面，去除表面污染的杂菌和灰尘，吸干残水后用0.05％亚甲基兰水溶液染色2min，倾去染液，观察，背景为蓝色，大肠杆菌菌苔呈现不透明云雾状，噬菌斑为深蓝色圆形空斑。
本发明亦可用于其它噬菌体形成噬菌斑的培养与观察，但相关步骤需要做适当调整。
本发明的有益效果为：
(1)增加了水样预检环节。由于噬菌体通常和其宿主共存在于特定生境中，而大肠杆菌是总大肠菌群的重要组成，如水样总大肠菌群检测阳性，则说明水体中存在大肠杆菌，水体也存在大肠杆菌的噬菌体。此外如实验室无适合的大肠杆菌菌株，可利用本步骤同时分离环境大肠杆菌菌株，针对水体中大肠杆菌分离特定的噬菌体。但如采用大肠杆菌的工程菌，如DH5α、BL21和JM109等，则不一定能保证实验成功。
(2)宿主菌始终保持在伊红美兰培养基上传代。由于伊红美兰培养基为一种鉴别培养基，大肠杆菌在上面呈现独特的菌落特征，即深紫红色、有金属光泽、表面比较湿润的光滑菌落，至少保证了宿主的菌落纯，避免制备的菌悬液含有其它杂菌。
(3)选择性增殖水体中的噬菌体。传统方法使用大剂量(200ml)污水直接增殖噬菌体，消耗试剂多，操作强度大。此外，由于牛肉膏蛋白胨液体培养基营养丰富，污水中的许多微生物都能在其中生长，因此选择性不强。本方法使用小剂量(2ml)污水，同时通过高速离心和氯仿处理去除污水中的细胞，仅使用污水中的非细胞成分增殖噬菌体，增强了实验的选择性。
(4)避免了操作过程中半固体培养基的凝固。传统方法中噬菌体梯度稀释液制备后，要在半固体培养基中混合宿主菌和噬菌体稀释液，操作时要求准确迅速，否则上层琼脂很容易出现琼脂块，干扰后期观察。本发明采用浇注平板法，首先在1％蛋白胨水中混合宿主菌和噬菌体稀释液，混合液直接倾倒在已凝固的底层培养基上，然后再倒入保温的半固体培养基，混合，静置待凝，操作简便，避免了混合过程中培养基的凝固。
(5)使用夹层平板将宿主菌和噬菌体限制在培养皿的中间层，通过培养可在中间层形成噬菌斑，从而避免了噬菌斑的上下层重叠。此外，底层和表层都为2％的水琼脂，即使是操作过程中有环境微生物污染，由于水琼脂不含营养物，不能支持大多数微生物的生长，从而降低了污染的风险。表层的水琼脂也对形成的菌苔和噬菌斑起到保护层的作用，防止了后期染色过程中因滴加染色液强度大破坏菌苔。
(6)使用0.05％亚甲基兰水溶液对夹层平板进行染色，增加噬菌斑和菌苔的对比度，可清晰的观察到噬菌斑。背景为蓝色，大肠杆菌菌苔呈现不透明云雾状，噬菌斑为深蓝色空斑。此外，由于亚甲基兰是一种活体染色剂，无毒无害，不影响后续实验。即可从形成的噬菌斑中继续分离噬菌体，进行后续实验。
(7)观察时间宽泛。双层平板法噬菌斑的最佳观察时间很短，超过20h会出现噬菌斑溶源化或耐受菌覆盖噬菌斑。这是因为上层培养基很软，宿主菌在琼脂表面运动会改变噬菌斑的形状。同时，污染的耐受菌也会破坏噬菌斑的形状。本方法培养24h和48h后观察，肉眼观察噬菌斑大小、分布和形态等特征并无显著不同，可能是因为大肠杆菌的运动被表层较硬的水琼脂限制，同时水琼脂也避免了杂菌的生长。这就极大程度上方便学生可在课余时间观察实验结果，开展后续实验。
附图说明
图1为夹层平板法示意图，从下到上依次为水琼脂、牛肉膏蛋白胨半固体培养基和水琼脂。
图2为分离的典型大肠杆菌菌落。
图3为观察到的大肠杆菌噬菌斑。
具体实施方式
1.实验材料
1.1培养基及试剂
①乳糖蛋白胨液体培养基
蛋白胨10g,牛肉膏3g，乳糖5g，NaCl 5g，16g/L的溴甲酚紫乙醇液1.0ml，蒸馏水1000ml，pH 7.2～7.4，分装试管，每管5ml，内放小倒管一只115℃灭菌30min。
②伊红-美蓝培养基(EMB)培养基
蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氢二钾2g，琼脂18～20g，蒸馏水1000ml，pH 7.2～7.4，115℃灭菌30min，冷却后添加20g/L的伊红水溶液20ml，5g/L美蓝水溶液13ml，混匀，倒平板，凝固后4℃冰箱保存备用。
③牛肉膏蛋白胨液体培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，CaCl2 10mM，水1 000ml，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。
④水琼脂
琼脂18～20g，水1 000ml，121℃灭菌20min。
⑤牛肉膏蛋白胨半固体培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，CaCl2 10mM，琼脂10～12g，水1 000ml，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。
⑥蛋白胨水
蛋白胨10g，CaCl2 10mM，水1000ml，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。
⑦0.05％亚甲基蓝水溶液
亚甲基兰0.05g，水100ml。
⑧氯仿
⑨革兰氏染色液一套
1.2材料：
环境水样、培养皿、试管、离心管、枪头
1.3菌种：大肠杆菌
如实验室无保存的大肠杆菌菌株，也可利用水样预检时进行分离纯化，获得大肠杆菌。
2.仪器设备
超净台、摇床、培养箱、水浴锅、显微镜、离心机、涡旋振荡器、移液器、酒精灯、接种环、离心管架、试管架。
3.实施步骤
Day 1：
1.准备培养基和材料：乳糖蛋白胨水液体培养基，10管，每管5ml。
2.采集水样：选择有可能被人畜粪便污染的水体为研究对象。
3.水样预检：初发酵，以无菌操作向乳糖蛋白胨液体培养基内注入10、1和0.1ml水样，每样做三个重复，同时做一个空白对照，混匀后置37℃静置过夜培养。产酸产气者为阳性。阴性者继续培养24h±3h再行检查。
Day 2：
1.准备培养基和材料：伊红美兰平板，若干。
2.观察乳糖蛋白胨水是否产酸产气，如无，换水样重复day 1的工作，如有，进行后续工作。
3.平板分离实验：轻摇初发酵试验阳性管，用接种环以无菌操作取上述阳性管的培养物，在伊红美兰平板上划线接种，平板倒置于37℃温箱培养18～24h，每个阳性管划线接种一个伊红美兰平板。
Day 3：
1.准备培养基和材料：乳糖蛋白胨水,若干，每管5ml。伊红美兰平板，2板；革兰氏染色液，1套。
2.观察伊红美兰平板实验结果，如有呈深紫红色、有金属光泽的菌落(图1)，为典型大肠菌菌落，同时在伊红美兰平板上进一步划线分离。
3.取典型菌落的部分培养物作涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌。
4.复发酵试验：无菌操作取该菌落的另一部分培养物再接种于乳糖蛋白胨发酵管内，同时做一个空白对照，37℃静置培养24h。
Day 4：
1.准备培养基和材料：牛肉膏蛋白胨液体培养基，每管5ml，2管；氯仿；离心管若干。
2.观察复发酵的乳糖蛋白胨水是否产酸产气。如产酸产气，同时革兰染色为阴性无芽孢杆菌，则证实水体中存在总大肠菌群，即有较高的成功概率分离到大肠杆菌的噬菌体。同时可结合革兰氏染色、生理生化特征和菌落特征推测分离的菌株为大肠杆菌，该菌株可用于后续噬菌体培养，但如想一步明确其分类地位，需要补充相关实验。
3.制备菌悬液：无菌操作从伊红美兰平板上取1个单菌落接种5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃ 150rpm培养约1～3hour。
4.处理水样：取污水样品2ml，10000rpm离心1min，取上清液加入0.2ml氯仿涡旋1min，静置，上清为水体中噬菌体原样品。
5.增殖培养：于5ml肉膏蛋白胨液体培养基中，加入制备的噬菌体原样品1ml，大肠杆菌菌悬液0.2ml，37℃150rpm振荡过夜培养。
Day 5:
1.准备培养基及材料：水琼脂500ml，灭菌后保温于50℃水浴锅中；牛肉膏蛋白胨半固体培养基400ml，灭菌后保温于50℃水浴锅中；1％蛋白胨水100ml；氯仿。无菌离心管、培养皿等。
2.制备菌悬液，无菌操作从伊红美兰平板上取1个单菌落接种5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃培养1～3hour。
3.制备底层平板：准备无菌平板，每皿加入约5ml水琼脂，冷却待凝固。
4.制备裂解液：取2ml前述噬菌体增殖液，10000rpm离心1min收集上清液，上清加0.2ml氯仿涡旋处理1min，静置，上层液体为富集的噬菌体样品。
5.裂解液稀释：取2ml离心管若干个，每管加入0.9ml蛋白胨水，用1％的蛋白胨水将富集的噬菌体样品10倍倍比稀释到10-3～10-7。
6.混合宿主菌：选择10-3～10-7稀释梯度噬菌体裂解液混合宿主菌，混合比例为每1ml噬菌体稀释液加入50μl制备的宿主菌菌悬液，颠倒混匀。
7.制备夹层平板：将混匀的宿主-噬菌体混合液倾倒在已经凝固的底层平板上，随即倾入一层保温的牛肉膏蛋白胨半固体培养基，混匀，每皿约10ml，待凝固后，上层再倒入一层保温的水琼脂，每皿约10ml，待凝固。
8.培养：待夹层平板彻底凝固后，倒置37℃培养过夜。
Day 6：
1.准备试剂：0.05％亚甲基蓝水溶液。
2.平板清洗：取出培养的夹层平板，缓缓用流水洗去表面污染的杂菌，用吸水纸吸干残水。
3.染色：用0.05％的亚甲基蓝水溶液覆盖平板表面，染色2min，每皿约需10～20ml染色液。
4.观察：倾去染液，吸水纸吸去残水，观察噬菌斑。背景为蓝色，大肠杆菌菌苔呈现不透明云雾状，噬菌斑为深蓝色空斑。
备注：如实验室有大肠杆菌环境菌株，且确信水样总大肠菌群阳性，可直接从Day4工作2开始，实验前后历时3天。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种重组马立克病毒MDLV21株的构建及应用