用于检测尿液外泌体cnv的试剂在制备泌尿系统肿瘤检测试剂盒中的应用
阅读说明：本技术 用于检测尿液外泌体cnv的试剂在制备泌尿系统肿瘤检测试剂盒中的应用 (Application of reagent for detecting urine exosome CNV in preparation of urinary system tumor detection kit ) 是由 王晓楠 钱祺 缪家顺 张亚楠 于 2021-07-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了用于检测尿液外泌体CNV的试剂在制备泌尿系统肿瘤检测试剂盒中的应用。所述检测尿液外泌体CNV的试剂包括尿液外泌体提取试剂、外泌体DNA提取试剂和外泌体DNA建库测序试剂,进一步通过软件对外泌体DNA的测序数据进行分析处理,获得尿液外泌体CNV数据。本发明通过实验发现：尿液外泌体CNV的检测可以用来区分膀胱癌患者与膀胱良性病变患者,并且相对于尿脱落细胞CNV检测,尿液外泌体CNV检测方法对于泌尿系统肿瘤的诊断具有更高的准确性。(The invention discloses an application of a reagent for detecting urine exosome CNV in preparation of a urinary system tumor detection kit. The reagent for detecting the urine exosome CNV comprises a urine exosome extraction reagent, an exosome DNA extraction reagent and an exosome DNA library-building sequencing reagent, and further analyzes and processes sequencing data of exosome DNA through software to obtain urine exosome CNV data. The invention discovers that: the detection of the urine exosome CNV can be used for distinguishing bladder cancer patients from bladder benign lesion patients, and compared with the detection of the urine exfoliated cell CNV, the urine exosome CNV detection method has higher accuracy for the diagnosis of urinary system tumors.)
技术领域
本发明属于生物医学诊断技术领域，具体涉及用于检测尿液外泌体CNV的试剂在制备泌尿系统肿瘤检测试剂盒中的应用。
背景技术
众所周知，癌症是一种基因组疾病，癌症感兴趣的基因组畸变大多是体细胞畸变，因为肿瘤产生于正常细胞，其基因组获得性畸变。拷贝数变异(CNV)是癌症中最重要的体细胞畸变之一，因为致癌基因的激活往往归因于染色体拷贝数扩增，而抑癌基因的失活往往是由突变相关的杂合缺失或纯合缺失引起的，其中包括特定DNA片段的增殖和缺失1。现在大量研究已经发现了CNV和癌症之间的联系。
Exosome，又称为外泌体，直径30～150nm，是一种由细胞内多囊泡体(multivesicular body,MVB)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的脂质双分子膜包裹的小囊泡，其含有蛋白质、脂质和核酸，并且在各种生理和病理途径中充当细胞-细胞通信的重要介质。目前的研究表明：外泌体在体液中(血液、唾液、尿液、腹水、羊水、和脊液等)中均具有较高的丰度，对其内容物进行检测，临床应用前景广阔。
外泌体拷贝数变异，对外泌体内的核酸进行CNV的检测，作为一种新的检测手段，对肿瘤的辅助诊断有着重要作用。
虽然对肿瘤细胞或者外泌体检测方法有很多，例如有利用尿脱落细胞检测CNV的，也有检测外泌体中蛋白和RNA的。但现有技术中还没有通过检测外泌体拷贝数变异来区分肿瘤细胞与健康细胞的相关报道。
发明内容
本发明的目的是，提供用于检测尿液外泌体CNV的试剂在制备泌尿系统肿瘤检测试剂盒中的应用，提供一种新的检测泌尿系统肿瘤的方法。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
用于检测尿液外泌体CNV的试剂在制备泌尿系统肿瘤检测试剂盒中的应用。所述试剂盒通过检测尿液外泌体CNV的异常来判定是否为泌尿系统肿瘤。
作为优选实施方案，所述泌尿系统肿瘤包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌、尿路上皮癌、睾丸癌。
作为优选实施方案，所述检测尿液外泌体CNV的试剂包括尿液外泌体提取试剂、外泌体DNA提取试剂和外泌体DNA建库测序试剂。
作为优选实施方案，所述的外泌体提取试剂选自超高速离心法提取外泌体所采用的试剂、超滤法提取外泌体所采用的试剂、PEG沉淀法提取外泌体所采用的试剂、磁珠法提取外泌体所采用的试剂、或者市售的尿液外泌体制备试剂盒。
作为优选实施方案，所述的外泌体DNA提取试剂选自碱裂解法提取外泌体DNA所采用的试剂、酚抽提法提取外泌体DNA所采用的试剂、硅胶膜离心柱法提取外泌体DNA所采用的试剂、磁珠法提取外泌体DNA所采用的试剂、或市售的外泌体DNA提取试剂盒。
作为优选实施方案，所述的外泌体DNA建库测序试剂选自Illumina公司的TruseqNano DNA Sample Prep Kit、NEB公司的NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit forIllumina、Kapa公司的Kapa HyperPrep kit、诺维赞公司的Universal Pro DNALibrary Prep Kit for Illumina。
作为优选实施方案，所述检测尿液外泌体CNV的方法包括以下步骤：
1)使用fastp软件对fastq格式序列的原始测序数据，将低质量序列和接头序列的截短去除，评估测序质量，关键参数为-q 25；
2)使用bwa软件将过滤后的测序数据比对到参考基因组hg19，使用SAMtools对BAM比对文件按照比对位置进行排序，进一步对BAM文件进行重复序列的去除，减少光学重复和PCR重复序列的干扰；
3)使用R包QDNAseq对步骤2中获得的BAM文件进行固定bin区间内的log2 ratio的计算鉴定，bin区间的大小分别选取500kb和1Mb；获得bin区间的log2 ratio后进一步进行segmentation，segmentation方法使用log2-transformation，对CNV进行鉴定。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明建立了一种新的检测泌尿系统肿瘤的方法，并且通过实验发现：尿液外泌体CNV的检测可以用来区分膀胱癌患者与膀胱良性病变患者，相对于尿脱落细胞CNV检测，尿液外泌体CNV检测方法对于泌尿系统肿瘤的诊断具有更高的准确性。
附图说明
图1是本发明实施例1中肿瘤细胞系22RV1细胞DNA的CNV检测结果。
图2是本发明实施例1中肿瘤细胞系22RV1细胞培养上清外泌体DNA的CNV检测结果。
图3是本发明实施例1中肿瘤细胞系H3122细胞DNA的CNV检测结果。
图4是本发明实施例1中肿瘤细胞系H3122细胞培养上清外泌体DNA的CNV检测结果。
图5是本发明实施例2中健康志愿者尿液样本外泌体DNA的CNV检测结果。
图6是本发明实施例3中膀胱癌患者的尿液外泌体的CNV检测结果。
图7是本发明实施例3中膀胱良性病变患者尿液外泌体的CNV检测结果。
图8是本发明实施例4中膀胱癌患者尿脱落细胞的CNV检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1：肿瘤细胞DNA CNV检测与肿瘤细胞外泌体DNA CNV检测
肿瘤细胞及细胞DNA提取：
准备22RV1细胞与H3122细胞各5×106个，使用QIAGEN公司的QIAamp DNA MiniKit(50)(货号51304)进行提取，详细操作流程见试剂盒说明书，获得的DNA使用30uL洗脱液进行洗脱。
肿瘤细胞培养上清外泌体收集以及外泌体DNA的提取：
准备22RV1无血清细胞培养上清与H3122无血清细胞培养上清各50mL，500g，离心10min，去除细胞碎片，上清液120000g，4℃，离心2h，去上清，沉淀用100uL PBS缓冲液重悬，之后使用QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit(50)(货号51304)进行提取，详细操作流程见试剂盒说明书，获得的DNA使用30uL洗脱液进行洗脱。
DNA样本定量：获取的DNA样本使用Nanodrop进行定量，定量后的样本各取50ng用于后续DNA文库的构建。
DNA文库构建以及测序：
将得到的细胞系DNA以及细胞系培养上清外泌体DNA使用UniversalPro DNA Library Prep Kit for Illumina(货号ND608)构建DNA文库，详细操作流程见试剂盒说明书，将制备好的文库送明码生物进行测序，双端150，每个样本数据需求量3G。
测序数据CNV分析：
1)使用fastp软件对原始测序数据(fastq格式序列)对低质量序列和接头序列的截短去除，评估测序质量，关键参数：-q 25。
2)使用bwa软件将过滤过后的测序数据比对到参考基因组(hg19)，使用SAMtools对BAM比对文件按照比对位置进行排序，进一步对BAM文件进行重复序列的去除，减少光学重复和PCR重复序列的干扰。
3)使用R包QDNAseq对步骤2中获得的BAM文件进行固定bin区间内的log2 ratio的计算鉴定，bin区间的大小选取500 kb。获得bin区间的log2 ratio后进一步进行segmentation，segmentation方法使用log2-transformation，对CNV进行分析。分析结果如下：图1为肿瘤细胞系22RV1细胞DNA CNV分析结果，图2为肿瘤细胞系22RV1细胞培养上清外泌体DNA CNV分析结果，图3为肿瘤细胞系H3122细胞DNA CNV分析结果，图4为肿瘤细胞系H3122细胞培养上清外泌体DNA CNV分析结果。
由图1与图2可知：细胞系22RV1细胞基因组DNA的CNV检测结果与其对应的外泌体DNA的CNV检测结果是一致的。由图3与图4可知：细胞系H3122细胞基因组DNA的CNV检测结果与其对应的外泌体DNA的CNV检测结果是一致的。说明细胞的基因组层面的CNV的异常也可以通过外泌体DNA的CNV异常检测到。
实施例2：健康人尿液外泌体CNV检测
健康人尿液外泌体及外泌体DNA制备：取健康志愿者尿液样本6例(编号依次为U1-U6)，各30mL，1600g离心10min，取上清，之后加入1/2体积的PEG8000(质量体积比为30％)的水溶液，混匀，4℃放置过夜。之后，3000g，离心10min，使用100uL PBS重悬，得尿液外泌体重悬液。将得到的外泌体使用QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit(50)(货号51304)进行提取，详细操作流程见试剂盒说明书。获得的DNA使用30uL洗脱液进行洗脱，并使用Nanodrop进行定量，定量后的样本各取50ng用于后续DNA文库的构建。
具体的健康人尿液外泌体DNA文库构建、测序以及CNV分析流程和实施例1相同。尿液外泌体DNA的CNV分析结果如图5所示。检测结果显示：尿液外泌体的DNA可用于CNV的分析检测，且健康志愿者尿液外泌体DNA的CNV检测结果都是正常的。
实施例3：膀胱癌患者与膀胱良性病变患者尿液外泌体CNV检测
取膀胱癌患者尿液样本5例(编号T1-T5)各30mL，膀胱良性病变患者尿液样本5例(编号N1-N5)各30mL，外泌体及外泌体DNA的制备流程如实施例2所示，外泌体样本DNA文库的构建、测序以及CNV的分析如实施例1所示。
膀胱癌患者的尿液外泌体的CNV检测结果如图6所示，膀胱良性病变患者尿液外泌体的CNV检测如图7所示。检测结果显示：膀胱癌患者的尿液样本中均可检出明显的CNV异常，而膀胱良性病变患者尿液外泌体的CNV基本上都是正常的。说明尿液外泌体CNV的检测可以用来区分膀胱癌患者与膀胱良性病变患者，可以用来作为膀胱癌的辅助诊断。
实施例4：本发明专利与尿脱落细胞DNA的CNV检测对比
取实施例3中膀胱癌患者的尿液样本1600g离心10min后的细胞沉淀(编号依次为S1-S5)加入100uL PBS重悬，得尿液脱落细胞的重悬液。将得到的尿脱落细胞重悬液使用QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit(50)(货号51304)进行提取，详细操作流程见试剂盒说明书。获得的DNA使用30uL洗脱液进行洗脱，并使用Nanodrop进行定量，定量后的样本各取50ng用于后续DNA文库的构建。尿脱落细胞样本DNA文库的构建、测序以及CNV的分析如实施例1所示。膀胱癌患者的尿脱落细胞的CNV检测如图8所示。检测结果显示：5例膀胱癌患者的尿脱落细胞中仅3例样本可以检测到CNV的异常，进一步数据对比发现，尿脱落细胞CNV异常的3例样本(S1，S3，S4)与尿液外泌体CNV(T1，T3，T4)的异常位点是一致的。实施例3中检测的5例膀胱癌患者的尿液外泌体CNV均为异常；而尿脱落细胞的CNV检测只有其中3例为异常，另外两例未检测出。该数据说明：相对于尿脱落细胞CNV检测，尿液外泌体CNV检测方法对于泌尿系统肿瘤的诊断具有更高的准确性。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
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