具体实施方式

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员和研究人员共同理解的相同的含义。虽然与本文所述相似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明，但本文所描述的是优选的此方法和材料。对于本发明的目的，定义了以下术语。

根据本发明，术语“化妆品”是指以涂抹、喷洒或者其他类似的方法，散布于人体表面的任何部位，如皮肤、毛发、指趾甲、唇齿等，以达到清洁、保养、美容、修饰和改变外观，或者修正人体气味、保持良好的状态为目的的化学工业品或精细化工产品。

根据本发明，术语“易触及眼睛化妆品”是指在使用过程中可能进入眼前部的化妆品，这里的“眼前部”是指上下眼睑、泪腺、球结膜、眼结膜、角膜、虹膜及其他眼部附属组织，“易触及眼睛化妆品”是指非特殊用途化妆品中易触及眼睛的发用产品、护肤产品、眼部彩妆类产品、沐浴类产品，以及特殊用途化妆品中育发类、染发类及烫发类、祛斑类、防晒类产品。

根据本发明，术语“化妆品原料”是指化妆品生产过程所用过的原料，包括化妆品基质原料，如油性原料、表面活性剂、溶剂、粉质原料、高分子聚合物以及其它添加剂等；化妆品辅助原料，如香精、着色剂、珠光剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂和络合剂等；以及特殊用途原料，如脱毛剂、染发剂、烫发剂、收敛剂、抑汗剂、除臭剂、祛斑剂、防晒剂等。

根据本发明，术语“烷醇酰胺类原料”是指可用于化妆品中的烷醇酰胺化合物以及烷醇酰胺衍生物。烷醇酰胺是由烷基醇胺和脂肪酸或脂肪酸酯为原料合成的一类易生物降解，环境友好型的非离子表面活性剂。烷醇酰胺分子结构中酰胺键的存在利于氢键的形成，降低了临界胶束浓度，提高了耐水解性能，同时具有增粘、稳泡、分散、乳化、抗静电、防锈等性能，广泛用于日用品、皮革、金属清洗、纺织纤维、油田等方面。烷醇酰胺衍生物是以烷醇酰胺为原料衍生合成的一类新型绿色表面活性剂，具有比烷醇酰胺更优异的性能。

本发明是基于以下发现：通过在SH-SY5Y细胞中过表达人TRPV1受体，模拟人眼角膜神经元疼痛感知机制，并用绿色荧光钙指示剂Fluo-4,AM检测进入细胞内钙离子情况来判断人TRPV1受体激活情况，进而以此作为疼痛评价方法的基础，可用于预测化妆品原料和产品是否具有潜在的致痛风险。

本发明简要实施过程如下(实施例1-5)：首先，通过基因全合成和慢病毒包装及感染SH-SY5Y细胞的方法，并通过嘌呤霉素筛选获得一株人TRPV1受体过表达细胞株，用RT-qPCR方法检测了人TRPV1基因的过表达。其次，通过二氢辣椒素处理人TRPV1过表达细胞，用荧光显微镜和荧光酶标仪检测到了人TRPV1受体的激活，并建立了疼痛检测方法。最后，通过对化妆品原料(以椰油酰胺MEA、月桂酰胺MEA、椰油酰胺MIPA、棕榈酰胺MEA、乳酰胺MEA为例)和产品(以沐浴露A和沐浴露B为例)的检测，证明了该检测方法可用于化妆品原料和产品的检测，可用于评估化妆品原料和产品是否存在致痛风险。

同时，作为比较例6-9，建立基于兔TRPV1受体的检测方法。首先，通过基因全合成和慢病毒包装及感染SH-SY5Y细胞的方法，并通过嘌呤霉素筛选获得一株兔TRPV1受体过表达细胞株，用RT-qPCR方法检测了兔TRPV1基因的过表达。其次，通过二氢辣椒素处理兔TRPV1过表达细胞，用荧光显微镜和荧光酶标仪检测到了兔TRPV1受体的激活，并建立了基于兔TRPV1受体的疼痛评价方法。最后，通过对化妆品原料(以椰油酰胺MEA为例)检测，并与实施例4比较，证明了基于人TRPV1的疼痛评价方法的敏感性高于基于兔TRPV1受体的疼痛评价方法，基于人TRPV1受体的疼痛评价方法优于基于兔TRPV1的疼痛评价方法。

另外，作为比较例10，采用鸡胚绒毛尿囊膜试验检测椰油酰胺MEA是否存在眼刺激性。结果表明鸡胚绒毛尿囊膜试验检测椰油酰胺MEA无眼刺激性。通过与实施例4进行比较，进一步证明基于人TRPV1受体的疼痛评价方法在评价物质是否具有致痛性方面优于鸡胚绒毛尿囊膜试验。

综上所述，本发明提供了一种具有应用价值的敏感性强的基于人TRPV1受体过表达细胞株的疼痛评价方法。该检测方法可用于化妆品原料和产品的检测，用于评估化妆品原料和产品是否存在致痛风险。

下面结合具体的实施例和比较例进一步阐述本发明。但是，这些实施例和比较例仅用于说明本发明，而不构成对本发明范围的限制。下列实施例和比较例中未注明具体条件的实验方法，通常是按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按照重量计。

以下实施例和比较例中使用的试剂、耗材、仪器及购买厂商信息如下：

1、细胞、耗材与试剂

人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y购自上海阳雁生物科技有限公司；T75细胞培养瓶、黑边透明底96孔板购自美国Corning公司。胎牛血清、细胞培养基高糖DMEM、抗生素混合物(PSN)、0.25％胰酶-EDTA购自美国ThermoFisher公司。

氯化钠、氯化钾、七水硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钾、葡萄糖、DMSO购自国药集团化学试剂有限公司；HEPES购自美国Sigma公司。化妆品原料月桂酰胺MEA购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，棕榈酰胺MEA、椰油酰胺DEA购自上海麦克林生化科技有限公司，椰油酰胺MEA、椰油酰胺MIPA为本公司储备原料。

二氢辣椒素(Dihydrocapsaicin,DHC)、绿色荧光钙指示剂Fluo-4,AM、总RNA抽提试剂TRIzol购自美国ThermoFisher公司；钙离子通道抑制剂钌红(Ruthenium Red,RR)购自上海麦克林生化科技有限公司；反转录试剂盒iScript cDNA Synthesis Kit、荧光实时定量PCR试剂iTaq^TM UniversalGreen Supermix购自美国Bio-rad公司。

KRH缓冲液(Krebs-Ringer HEPES buffer)配方：125mM NaCl，5mM KCl，1.2mMMgSO₄×7H₂O，2mM CaCl₂，1.2mM KH₂PO₄×2H₂O，25mM HEPES[free acid]，6mM glucose；用1MNaOH调pH值到7.4。

2、仪器

超微量紫外分光光度NanoDrop ONE、荧光酶标仪Fluoroskan Ascent FL购自美国Thermo公司，基因扩增仪C1000 Touch、实时定量PCR仪CFX Connect购自美国Bio-rad公司，荧光显微镜DMIL LED、体式显微镜M205C购自美国Leica公司，孵化箱Rcom MARUmax。

实施例1：构建人TRPV1过表达细胞株并检测过表达情况

一、实验原理

通过全基因合成方法合成人TRPV1基因，并插入到慢病毒表达载体中，得到过表达载体pCDH-CMV-Puro-hTRPV1；通过病毒包装、病毒感染SH-SY5Y细胞以及嘌呤霉素筛选，得到人TRPV1受体过表达细胞株，并用RT-qPCR方法检测该细胞株TRPV1 mRNA过表达情况。

二、实验方法

1、构建病毒过表达载体pCDH-CMV-Puro-hTRPV1(人)

通过全基因合成方法合成SEQ ID NO:1(具体核酸序列见后面)，该序列含人TRPV1基因蛋白质编码序列(Coding sequence，CDS)区域、CDS区域5’端限制内切酶XbaI位点TCTAGA碱基和构成Kozak序列的GCCACC碱基、以及CDS区域3’端限制内切酶NotI位点碱基GCGGCCGC。其中，人TRPV1基因核酸序列信息来自美国生物技术信息中心(NCBI)的核酸序列数据库，其核酸序列编号为NM_080704.3(核酸序列网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_080704.3)。然后，用限制性核酸内切酶XbaI和NotI，将SEQ ID NO:1插入到病毒载体pCDH-CMV-MCS-Puro中，得到病毒过表达载体pCDH-CMV-Puro-hTRPV1。在人TRPV1基因起始密码子ATG前加入GCCACC碱基，构成Kozak序列，可提高蛋白质翻译效率，提升蛋白表达水平。

2、构建人TRPV1受体过表达细胞株

按质量比例20:15:6混合病毒表达载体pCDH-CMV-Puro-hTRPV1和包装质粒pLP/VSVG、pCMV-dR8.91，用磷酸钙法转染HEK293FT细胞，收获上清并超速离心浓缩病毒，获得含TRPV1基因的病毒颗粒。用病毒颗粒感染SH-SY5Y细胞，并用3μg/ml的嘌呤霉素筛选，最终获得稳定表达的人TRPV1受体过表达细胞株。

3、检测人TRPV1受体过表达细胞株TRPV1 mRNA过表达情况

收集空载体对照细胞株和人TRPV1受体过表达细胞株细胞，用TIRzol试剂抽提总RNA，并用反转录试剂盒iScript cDNA Synthesis Kit反转录得到cDNA。用荧光实时定量PCR试剂iTaq^TM UniversalGreen Supermix进行荧光实时定量(RT-qPCR)检测，分析人TRPV1受体过表达细胞株中TRPV1 mRNA的过表达情况。本实施例所用引物序列设计如下：人TRPV1基因上游引物序列为5’-TCCCGGTGGATTGCCCTCAC-3’，下游引物序列为5’-TCTCGGTGCTGGCGGCGACA-3’；肌动蛋白基因(β-ACTIN)作内参，上游引物序列为5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’，下游引物序列为5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’。

三、实验结果

实时荧光定量检测结果表明，成功构建人TRPV1受体过表达细胞株，细胞株中TRPV1 mRNA表达显著升高。

如图1所示，人TRPV1受体过表达细胞株中TRPV1 mRNA是空载体对照细胞系的26倍。空载体对照细胞株用“pCDH-ctr”表示，人TRPV1受体过表达细胞株用“hTRPV1”表示。

实施例2：荧光显微镜观察过表达细胞株中人TRPV1受体被二氢辣椒素激活情况

一、实验原理

Fluo-4,AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，常用于检测细胞内钙离子浓度。Fluo-4,AM穿透细胞膜进入细胞后，被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-4，从而被滞留在细胞内。Fluo-4以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，其最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm。可以使用荧光显微镜、荧光酶标仪等检测细胞内钙离子浓度的变化。TRPV1受体是一种非选择性的离子通道，当TRPV1受体被二氢辣椒素等物质激活时，细胞外钙离子会通过TRPV1受体进入细胞内，与细胞内的Fluo-4结合，在激发光的激发下会产生绿色荧光。因此，通过观察记录细胞内荧光强度的变化，就可以分析判断TRPV1受体的激活情况。钌红是TRPV1受体抑制剂，可抑制钙离子通过TRPV1受体进入细胞内。

二、实验方法

1.接种细胞

将空载体对照细胞株和人TRPV1受体过表达细胞株细胞接种在96孔板中，每株细胞接种6个孔，每孔1×10⁵个细胞；在细胞培养箱中培养48小时左右(培养温度37℃，5％CO₂)，细胞融合度达到95％以上。

2.绿色荧光钙指示剂加载细胞

去掉旧培养基，每孔加入50μL含有2μM Fluo-4,AM的加载DMEM培养基，37℃孵育30分钟，让Fluo-4,AM进入细胞内并充分水解。

3.加不含/含抑制剂钌红的KRH缓冲液(KRH缓冲液配制方法见“细胞、耗材与试剂”部分)

倒掉加载培养基，用100μL KRH缓冲液漂洗一次，每株细胞6个孔中的3个孔每孔加入100μL KRH缓冲液，另外3个孔每孔加入100μL含10μM抑制剂钌红的KRH缓冲液，然后37℃孵育15分钟。

4.荧光显微镜观察与拍照

空载体对照细胞孔和人TRPV1受体过表达细胞孔每孔加入20μL浓度为60μM二氢辣椒素(终浓度10μM)，混匀后，立即在荧光显微镜下观察各孔的荧光情况，并拍照分析。

三、实验结果

人TRPV1受体过表达细胞株中的TRPV1受体被高浓度二氢辣椒素激活，介导了钙离子的内流。

如图2所示，在空载体对照细胞的不加钌红组和加钌红组中，均未观察到绿色荧光信号；在人TRPV1受体过表达细胞的不加钌红组中观察到明显的绿色荧光信号，而在加钌红组中未观察到绿色荧光信号。这表明，在高浓度二氢辣椒素的激活下，人TRPV1受体过表达细胞中的人TRPV1受体介导了钙离子内流，并且该受体介导的钙离子内流可以被抑制剂钌红抑制。空载体对照细胞株用“pCDH-ctr”表示，人TRPV1受体过表达细胞株用“hTRPV1”表示。

实施例3：用不同浓度二氢辣椒素评估基于人TRPV1受体过表达细胞株的疼痛评价方法

一、实验原理

Fluo-4,AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，常用于检测细胞内钙离子浓度。Fluo-4,AM穿透细胞膜进入细胞后，被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-4，从而被滞留在细胞内。Fluo-4以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，其最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm。可以使用荧光显微镜、荧光酶标仪等检测细胞内钙离子浓度的变化。TRPV1受体是一种非选择性的离子通道，当TRPV1受体被二氢辣椒素等物质激活时，细胞外钙离子会通过TRPV1受体进入细胞内，与细胞内的Fluo-4结合，在激发光的激发下会产生绿色荧光。因此，通过观察记录细胞内荧光强度的变化，就可以分析判断TRPV1受体的激活情况。钌红是TRPV1受体抑制剂，可抑制钙离子通过TRPV1受体进入细胞内。

二、实验方法

1.接种细胞

将空载体对照细胞株和人TRPV1受体过表达细胞株细胞接种在黑边透明底的96孔板中。针对每一个检测物(二氢辣椒素)，每株细胞各接种1个96孔板，每个孔板接种60个孔(孔板编号B2-B11，C2-C11，…，G2-G11)，每孔1×10⁵个细胞，96孔板周边孔加入100μL 1×PBS缓冲液，降低液体挥发对细胞增殖的影响。在细胞培养箱中培养48小时左右(培养条件37℃，5％CO₂)，使细胞融合度达到95％以上。

2.准备二氢辣椒素样品

用DMSO溶剂配置二氢辣椒素母液，浓度为60mM。用KRH缓冲液配置10倍等比稀释的溶液，8个浓度梯度，浓度从低到高分别为60pM、600pM、6nM、60nM、600nM、6μM、60μM、600μM。另需准备含10μM抑制剂钌红的KRH缓冲液。

3.绿色荧光钙指示剂加载细胞

去掉旧培养基，每孔加入50μL含有2μM Fluo-4,AM的加载DMEM培养基，37℃孵育25-30分钟。

4.加不含/含抑制剂钌红的KRH缓冲液

倒掉加载培养基，用100μL KRH缓冲液漂洗一次，然后在孔B2-B11、C2-C11和D2-D11中每孔加入100μL KRH缓冲液，在孔E2-E11、F2-F11和G2-G11中每孔加入100μL含10μM抑制剂钌红的KRH缓冲液，放细胞培养箱中，37℃孵育15分钟。

5.荧光酶标仪采集数据

从培养箱中取出96孔板，去掉盖子，放入荧光酶标仪中，测基础荧光值。然后用多道移液枪在空白对照孔(列2中的6个孔)中立即加入20μL KRH缓冲液，在检测孔(列3-列10，共8列48孔)中依次加入20μL不同浓度的二氢辣椒素样品(8个梯度，终浓度从低到高为10pM、100pM、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM)。混匀后，立即用荧光酶标仪测各孔的反应荧光值。

6.数据分析

将荧光酶标仪采集的数据导入Excel表格中，先计算出加入检测物质前后各孔荧光差值(即反应荧光值-基础荧光值)，然后检测组各孔扣除空白对照孔差值后，并以10μM二氢辣椒素的数值作为100％，检测组不同浓度孔数值与之相比得到相对百分比。用GraphPadPrism 7软件进行非线性回归分析，根据量-效关系方程Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC₅₀-X)*HillSlope))(设置参数Bottom＝0和Top＝100)得到量-效关系曲线和EC₅₀值。对不能进行非线性曲线拟合的数据，进行线性回归分析。对同一浓度下检测组(不含抑制剂)数值与检测组(含抑制剂)数值差异进行t检验，每组进行独立分析。

三、实验结果

基于人TRPV1受体过表达细胞株的疼痛评价方法证明二氢辣椒素以浓度依赖的方式激活人TRPV1受体，具有量-效关系，EC₅₀值为1.35nM。

如图3所示，A图表明用不同浓度的二氢辣椒素处理空载体对照细胞后，不加抑制剂钌红组(pCDH-ctr)与加抑制剂钌红组(pCDH-ctr+RR)均没有产生荧光信号。图B表明在不加抑制剂钌红组(hTRPV1)中，较低浓度(如10pM)的二氢辣椒素处理人TRPV1受体过表达细胞时没有产生荧光信号，人TRPV1受体没有被激活；较高浓度(如10nM)的二氢辣椒素处理人TRPV1受体过表达细胞时，收集到了荧光信号，表明人TRPV1受体被二氢辣椒素激活，细胞外钙离子内流，产生荧光信号，并具有浓度依赖的特性。在加抑制剂钌红组(hTRPV1+RR)未观察到荧光，表明人TRPV1受体被抑制，钙离子未进入细胞内。根据GraphPad Prism 7软件的分析，得到相应的量-效关系曲线和EC₅₀值。二氢辣椒素在人TRPV1受体过表达细胞株中激活人TRPV1的EC₅₀值为1.35nM。p值<0.05表示两组数值之间差异具有统计学意义，用“*”表示；p值<0.01表示两组数值之间差异具有高度统计学意义，用“**”表示。

实施例4：基于人TRPV1受体过表达细胞株的疼痛评价方法检测化妆品原料

一、实验原理

Fluo-4,AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，常用于检测细胞内钙离子浓度。Fluo-4,AM穿透细胞膜进入细胞后，被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-4，从而被滞留在细胞内。Fluo-4以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，其最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm。可以使用荧光显微镜、荧光酶标仪等检测细胞内钙离子浓度的变化。TRPV1受体是一种非选择性的离子通道，当TRPV1受体被二氢辣椒素等物质激活时，细胞外钙离子会通过TRPV1受体进入细胞内，与细胞内的Fluo-4结合，在激发光的激发下会产生绿色荧光。因此，通过观察记录细胞内荧光强度的变化，就可以分析判断TRPV1受体的激活情况。钌红是TRPV1受体抑制剂，可抑制钙离子通过TRPV1受体进入细胞内。

二、实验方法

1.接种细胞

将人TRPV1受体过表达细胞株细胞接种在黑边透明底的96孔板中。针对每一个检测物(5种化妆品原料：椰油酰胺MEA、月桂酰胺MEA、椰油酰胺MIPA、棕榈酰胺MEA和乳酰胺MEA)，接种1个96孔板，每个孔板接种60个孔(孔板编号B2-B11，C2-C11，…，G2-G11)，每孔1×10⁵个细胞，96孔板周边孔加入100μL 1×PBS缓冲液，降低液体挥发对细胞增殖的影响。在细胞培养箱中培养48小时左右(培养条件37℃，5％CO₂)，使细胞融合度达到95％以上。

2.准备待检测样品

用KRH缓冲液配置椰油酰胺MEA、月桂酰胺MEA、椰油酰胺MIPA、棕榈酰胺MEA和乳酰胺MEA母液，浓度为6mM，不易溶解物质用超声促溶。然后用KRH缓冲液配置3.16倍等比稀释的溶液，8个浓度梯度，浓度从低到高分别为1.9μM、6μM、19μM、60μM、190μM、600μM、1.9mM、6mM。另需准备阳性对照样品60μM的二氢辣椒素(KRH缓冲液)，以及含10μM抑制剂钌红的KRH缓冲液。

3.绿色荧光钙指示剂加载细胞

去掉旧培养基，每孔加入50μL含有2μM Fluo-4,AM的加载DMEM培养基，37℃孵育30分钟。

4.加不含/含抑制剂钌红的KRH缓冲液

倒掉加载培养基，用100μL KRH缓冲液漂洗一次，然后在孔B2-B11、C2-C11和D2-D11中每孔加入100μL KRH缓冲液，在孔E2-E11、F2-F11和G2-G11中每孔加入100μL含10μM抑制剂钌红的KRH缓冲液，放细胞培养箱中，37℃孵育15分钟。

5.荧光酶标仪采集数据

从培养箱中取出96孔板，去掉盖子，放入荧光酶标仪中，测基础荧光值。然后用多道移液枪在空白对照孔(列2中的6个孔)中立即加入20μL KRH缓冲液，在阳性对照孔(列11中的6个孔)中加入20μL 60μM的二氢辣椒素(终浓度为10μM)。在检测孔(列3-列10，共8列48孔)中依次加入20μL 3.16倍等比稀释的样品(8个浓度梯度，终浓度从低到高为316nM、1μM、3.16μM、10μM、31.6μM、100μM、316μM、1mM)。混匀后，立即用荧光酶标仪测各孔的反应荧光值。

6.数据分析

将荧光酶标仪采集的数据导入Excel表格中，先计算出加入检测物质前后各孔荧光差值(即反应荧光值-基础荧光值)，然后检测组各孔扣除空白对照孔差值后，并以10μM二氢辣椒素的数值作为100％，检测组不同浓度孔数值与之相比得到相对百分比。用GraphPadPrism 7软件进行非线性回归分析，根据量-效关系方程Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC₅₀-X)*HillSlope))(设置参数Bottom＝0和Top＝100)得到量-效关系曲线和EC₅₀值。对不能进行非线性曲线拟合的数据，进行线性回归分析。对同一浓度下检测组(不含抑制剂)数值与检测组(含抑制剂)数值差异进行t检验，每组进行独立分析。

三、实验结果

基于人TRPV1受体过表达细胞株的疼痛评价方法检测化妆品原料椰油酰胺MEA、月桂酰胺MEA、椰油酰胺MIPA、棕榈酰胺MEA和乳酰胺MEA，发现椰油酰胺MEA、月桂酰胺MEA和椰油酰胺MIPA有人TRPV1激活剂活性，存在致痛风险；而棕榈酰胺MEA和乳酰胺MEA没有产生荧光信号，不存在致痛风险。

如图4A所示，在不加抑制剂钌红组(hTRPV1)和加抑制剂钌红组(hTRPV1+RR)中，较低浓度(如1μM)的椰油酰胺MEA处理人TRPV1受体过表达细胞时均没有产生荧光信号，人TRPV1受体没有被激活；而用较高浓度(如100μM)的椰油酰胺MEA处理人TRPV1受体过表达细胞时，不加抑制剂钌红组(hTRPV1)产生荧光信号，加抑制剂钌红组(hTRPV1+RR)未产生荧光信号，表明人TRPV1受体被椰油酰胺MEA激活，介导了钙离子内流，且激活具有浓度依赖性。根据GraphPad Prism 7软件分析，得到椰油酰胺MEA激活人TRPV1受体的量-效关系曲线和EC₅₀值34.37μM。

如图4B所示，在不加抑制剂钌红组(hTRPV1)和加抑制剂钌红组(hTRPV1+RR)中，较低浓度(如1μM)的月桂酰胺MEA处理人TRPV1受体过表达细胞时均没有产生荧光信号，人TRPV1受体没有被激活；而用较高浓度(如1000μM)的月桂酰胺MEA处理人TRPV1受体过表达细胞时，不加抑制剂钌红组(hTRPV1)产生荧光信号，加抑制剂钌红组(hTRPV1+RR)未产生荧光信号，表明人TRPV1受体被月桂酰胺MEA激活，介导了钙离子内流，且激活具有浓度依赖性。根据GraphPad Prism 7软件分析，得到月桂酰胺MEA激活人TRPV1受体的量-效关系曲线和EC₅₀值364μM。

如图4C所示，在不加抑制剂钌红组(hTRPV1)和加抑制剂钌红组(hTRPV1+RR)中，较低浓度(如1μM)的椰油酰胺MIPA处理人TRPV1受体过表达细胞时均没有产生荧光信号，人TRPV1受体没有被激活；而用较高浓度(如1000μM)的椰油酰胺MIPA处理人TRPV1受体过表达细胞时，不加抑制剂钌红组(hTRPV1)产生荧光信号，加抑制剂钌红组(hTRPV1+RR)未产生荧光信号，表明人TRPV1受体被椰油酰胺MIPA激活，介导了钙离子内流，且激活具有浓度依赖性。根据GraphPad Prism 7软件分析，得到椰油酰胺MIPA激活人TRPV1受体的量-效关系曲线和EC₅₀值145.3μM。

如图4D所示，在不加抑制剂钌红组(hTRPV1)和加抑制剂钌红组(hTRPV1+RR)中，不同浓度的棕榈酰胺MEA处理人TRPV1受体过表达细胞时均没有产生荧光信号。这表明棕榈酰胺MEA不具有人TRPV1激活剂活性，没有致痛风险。

如图4E所示，在不加抑制剂钌红组(hTRPV1)和加抑制剂钌红组(hTRPV1+RR)中，不同浓度的乳酰胺MEA处理人TRPV1受体过表达细胞时均没有产生荧光信号。这表明乳酰胺MEA不具有人TRPV1激活剂活性，没有致痛风险。

在图4中，p值<0.05表示两组数值之间差异具有统计学意义，用“*”表示；p值<0.01表示两组数值之间差异具有高度统计学意义，用“**”表示。

实施例5：基于人TRPV1受体过表达细胞株的疼痛评价方法检测沐浴露产品

一、实验原理

Fluo-4,AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，常用于检测细胞内钙离子浓度。Fluo-4,AM穿透细胞膜进入细胞后，被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-4，从而被滞留在细胞内。Fluo-4以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，其最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm。可以使用荧光显微镜、荧光酶标仪等检测细胞内钙离子浓度的变化。TRPV1受体是一种非选择性的离子通道，当TRPV1受体被二氢辣椒素等物质激活时，细胞外钙离子会通过TRPV1受体进入细胞内，与细胞内的Fluo-4结合，在激发光的激发下会产生绿色荧光。因此，通过观察记录细胞内荧光强度的变化，就可以分析判断TRPV1受体的激活情况。钌红是TRPV1受体抑制剂，可抑制钙离子通过TRPV1受体进入细胞内。

二、实验方法

1.接种细胞

将人TRPV1受体过表达细胞株细胞接种在黑边透明底的96孔板中。针对每一个检测物(5种化妆品原料：椰油酰胺MEA、月桂酰胺MEA、椰油酰胺MIPA、棕榈酰胺MEA和乳酰胺MEA)，接种1个96孔板，每个孔板接种60个孔(孔板编号B2-B11，C2-C11，…，G2-G11)，每孔1×10⁵个细胞，96孔板周边孔加入100μL 1×PBS缓冲液，降低液体挥发对细胞增殖的影响。在细胞培养箱中培养48小时左右(培养条件37℃，5％CO₂)，使细胞融合度达到95％以上。

2.准备待检测样品

沐浴露A的制备

沐浴露B的制备

用KRH缓冲液配置沐浴露A和沐浴露B测试母液，浓度为6％(质量体积比)。然后用KRH缓冲液配置3.16倍等比稀释的溶液，8个浓度梯度，浓度从低到高分别为0.0019％、0.006％、0.019％、0.06％、0.19％、0.6％、1.9％、6％。另需准备阳性对照样品60μM的二氢辣椒素(KRH缓冲液)，以及含10μM抑制剂钌红的KRH缓冲液。

3.绿色荧光钙指示剂加载细胞

去掉旧培养基，每孔加入50μL含有2μM Fluo-4,AM的加载DMEM培养基，37℃孵育30分钟。

4.加不含/含抑制剂钌红的KRH缓冲液

倒掉加载培养基，用100μL KRH缓冲液漂洗一次，然后在孔B2-B11、C2-C11和D2-D11中每孔加入100μL KRH缓冲液，在孔E2-E11、F2-F11和G2-D11中每孔加入100μL含10μM抑制剂钌红的KRH缓冲液，放细胞培养箱中，37℃孵育15分钟。

5.荧光酶标仪采集数据

从培养箱中取出96孔板，去掉盖子，放入荧光酶标仪中，测基础荧光值。然后用多道移液枪在空白对照孔(列2中的6个孔)中立即加入20μL KRH缓冲液，在阳性对照孔(列11中的6个孔)中加入20μL 60μM的二氢辣椒素(终浓度为10M)。在检测孔(列3-列10，共8列48孔)中依次加入20μL 3.16倍等比稀释的样品(8个梯度，终浓度从低到高为0.000316％、0.001％、0.00316％、0.01％、0.0316％、0.1％、0.316％、1％)。混匀后，立即用荧光酶标仪测各孔的反应荧光值。

6.数据分析

将荧光酶标仪采集的数据导入Excel表格中，先计算出加入检测物质前后各孔荧光差值(即反应荧光值-基础荧光值)，然后检测组各孔扣除空白对照孔差值后，并以10μM二氢辣椒素的数值作为100％，检测组不同浓度孔数值与之相比得到相对百分比。用GraphPadPrism 7软件进行非线性回归分析，根据量-效关系方程Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC₅₀-X)*HillSlope))(设置参数Bottom＝0和Top＝100)得到量-效关系曲线和EC₅₀值。对不能进行非线性曲线拟合的数据，进行线性回归分析。对同一浓度下检测组(不含抑制剂)数值与检测组(含抑制剂)数值差异进行t检验，每组进行独立分析。

三、实验结果

基于人TRPV1受体过表达细胞株的疼痛评价方法预测沐浴露A样品不存在致痛风险，沐浴露B样品存在致痛风险。

如图5A所示，在不加抑制剂钌红组(hTRPV1)和加抑制剂钌红组(hTRPV1+RR)中，较低浓度(如1μM)的沐浴露A样品处理人TRPV1受体过表达细胞时均没有产生荧光信号，人TRPV1受体没有被激活；而在较高浓度(如0.1％-1％)的沐浴露A样品处理人TRPV1受体过表达细胞时，不加抑制剂钌红组(hTRPV1)和加抑制剂钌红组(hTRPV1+RR)均采集到荧光信号，但没有产生TRPV1受体特异的荧光信号。该疼痛评价方法预测沐浴露A样品不存在致痛风险。

如图5B所示，在不加抑制剂钌红组(hTRPV1)和加抑制剂钌红组(hTRPV1+RR)中，较低浓度(如1μM)的沐浴露B样品处理人TRPV1受体过表达细胞时均没有产生荧光信号，人TRPV1受体没有被激活；而在较高浓度(如0.0316％-1％)的沐浴露B样品处理人TRPV1受体过表达细胞时，不加抑制剂钌红组(hTRPV1)和加抑制剂钌红组(hTRPV1+RR)均采集到荧光信号，且在不加抑制剂钌红组(hTRPV1)中产生人TRPV1受体特异的荧光信号。该疼痛评价方法预测沐浴露B样品存在致痛风险。

在图5中，p值<0.05表示两组数值之间差异具有统计学意义，用“*”表示；p值<0.01表示两组数值之间差异具有高度统计学意义，用“**”表示。

比较例6：构建兔TRPV1过表达细胞株并检测过表达情况

一、实验原理

通过全基因合成方法合成兔TRPV1基因，并插入到慢病毒表达载体，得到过表达载体pCDH-CMV-Puro-oTRPV1；通过病毒包装、病毒感染SH-SY5Y细胞以及嘌呤霉素筛选，得到兔TRPV1受体过表达细胞株，并用RT-qPCR方法检测该细胞株TRPV1 mRNA过表达情况。

二、实验方法

1、构建病毒过表达载体pCDH-CMV-Puro-oTRPV1(兔)

通过全基因合成方法合成SEQ ID NO:2(具体核酸序列见后面)，该序列含兔TRPV1基因CDS区域、CDS区域5’端限制内切酶XbaI位点TCTAGA碱基和构成Kozak序列的GCCACC碱基、以及CDS区域3’端限制内切酶NotI位点碱基GCGGCCGC。其中，兔TRPV1基因核酸序列信息来自美国生物技术信息中心(NCBI)的核酸序列数据库，其核酸序列编号为NM_001082166(核酸序列网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001082166)。然后，用限制性核酸内切酶XbaI和NotI，将SEQ ID NO:2插入到病毒载体pCDH-CMV-MCS-Puro中，得到病毒过表达载体pCDH-CMV-Puro-oTRPV1。在兔TRPV1基因起始密码子ATG前加入GCCACC碱基，构成Kozak序列，可提高蛋白质翻译效率，提升蛋白表达水平。

2、构建兔TRPV1受体过表达细胞株

按质量比例20:15:6混合病毒表达载体pCDH-CMV-Puro-hTRPV1和包装质粒pLP/VSVG、pCMV-dR8.91，用磷酸钙法转染HEK293FT细胞，收获上清并超速离心浓缩病毒，获得含TRPV1基因的病毒颗粒。用病毒颗粒感染SH-SY5Y细胞，并用3μg/ml的嘌呤霉素(puromycin)筛选，最终获得稳定表达的兔TRPV1受体过表达细胞株。

3、检测兔TRPV1受体过表达细胞株TRPV1 mRNA过表达情况

收集空载体对照细胞株和兔TRPV1受体过表达细胞株细胞，用TIRzol试剂抽提总RNA，并用反转录试剂盒iScript cDNA Synthesis Kit反转录得到cDNA。用荧光实时定量PCR试剂iTaq^TM Universal Green Supermix进行荧光实时定量(RT-qPCR)检测，分析兔TRPV1受体过表达细胞株中TRPV1 mRNA的过表达情况。本比较例所用引物序列设计如下：兔TRPV1基因上游引物序列为5’-TCCCGGTGGATTGCCCTCAC-3’，下游引物序列为5’-TCTCGGTGCTGGCGGCGACA-3’；肌动蛋白基因(β-ACTIN)作内参，上游引物序列为5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’，下游引物序列为5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’。

三、实验结果

实时荧光定量检测结果表明，成功构建兔TRPV1受体过表达细胞株，细胞株中TRPV1 mRNA表达显著升高。

如图1所示，兔TRPV1受体过表达细胞株中TRPV1 mRNA是空载体对照细胞系的77倍。空载体对照细胞株用“pCDH-ctr”表示，兔TRPV1受体过表达细胞株用“oTRPV1”表示。

比较例7：荧光显微镜观察过表达细胞株中兔TRPV1受体被二氢辣椒素激活情况

一、实验原理

Fluo-4,AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，常用于检测细胞内钙离子浓度。Fluo-4,AM穿透细胞膜进入细胞后，被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-4，从而被滞留在细胞内。Fluo-4以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，其最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm。可以使用荧光显微镜、荧光酶标仪等检测细胞内钙离子浓度的变化。TRPV1受体是一种非选择性的离子通道，当TRPV1受体被二氢辣椒素等物质激活时，细胞外钙离子会通过TRPV1受体进入细胞内，与细胞内的Fluo-4结合，在激发光的激发下会产生绿色荧光。因此，通过观察记录细胞内荧光强度的变化，就可以分析判断TRPV1受体的激活情况。钌红是TRPV1受体抑制剂，可抑制钙离子通过TRPV1受体进入细胞内。

二、实验方法

1.接种细胞

将兔TRPV1受体过表达细胞株细胞接种在96孔板中，每株细胞接种6个孔，每孔1×10⁵个细胞；在细胞培养箱中培养48小时左右(培养温度37℃，5％CO₂)，细胞融合度达到95％以上。

2.绿色荧光钙指示剂加载细胞

去掉旧培养基，每孔加入50μL含有2μM Fluo-4,AM的加载DMEM培养基，37℃孵育30分钟，让Fluo-4,AM进入细胞内并充分水解。

3.加不含/含抑制剂钌红的KRH缓冲液

倒掉加载培养基，用100μL KRH缓冲液漂洗一次，每株细胞6个孔中的3个孔每孔加入100μL KRH缓冲液，另外3个孔每孔加入100μL含10μM抑制剂钌红的KRH缓冲液，然后37℃孵育15分钟。

4.荧光显微镜观察与拍照

空载体对照细胞孔和兔TRPV1受体过表达细胞孔每孔加入20μL浓度为60μM二氢辣椒素(终浓度10μM)，混匀后，立即在荧光显微镜下观察各孔的荧光情况，并拍照分析。

三、实验结果

兔TRPV1受体过表达细胞株中的TRPV1受体被高浓度二氢辣椒素激活，介导了钙离子的内流。

如图2所示，在空载体对照细胞的不加钌红组和加钌红组中，均未观察到绿色荧光信号；在兔TRPV1受体过表达细胞的不加钌红组中观察到明显的绿色荧光信号，而在加钌红组中未观察到绿色荧光信号。这表明，在高浓度二氢辣椒素的激活下，兔TRPV1受体过表达细胞中的兔TRPV1受体介导了钙离子内流，并且该受体介导的钙离子内流可以被抑制剂钌红抑制。空载体对照细胞株用“pCDH-ctr”表示，兔TRPV1受体过表达细胞株用“oTRPV1”表示。

比较例8：用不同浓度二氢辣椒素评估基于兔TRPV1受体过表达细胞株的疼痛评价方法

一、实验原理

Fluo-4,AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，常用于检测细胞内钙离子浓度。Fluo-4,AM穿透细胞膜进入细胞后，被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-4，从而被滞留在细胞内。Fluo-4以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，其最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm。可以使用荧光显微镜、荧光酶标仪等检测细胞内钙离子浓度的变化。TRPV1受体是一种非选择性的离子通道，当TRPV1受体被二氢辣椒素等物质激活时，细胞外钙离子会通过TRPV1受体进入细胞内，与细胞内的Fluo-4结合，在激发光的激发下会产生绿色荧光。因此，通过观察记录细胞内荧光强度的变化，就可以分析判断TRPV1受体的激活情况。钌红是TRPV1受体抑制剂，可抑制钙离子通过TRPV1受体进入细胞内。

二、实验方法

1.接种细胞

将兔TRPV1受体过表达细胞株细胞接种在黑边透明底的96孔板中。针对每一个检测物(二氢辣椒素)，每株细胞各接种1个96孔板，每个孔板接种60个孔(孔板编号B2-B11，C2-C11，…，G2-G11)，每孔1×10⁵个细胞，96孔板周边孔加入100μL 1×PBS缓冲液，降低液体挥发对细胞增殖的影响。在细胞培养箱中培养48小时左右(培养条件37℃，5％CO₂)，使细胞融合度达到95％以上。

2.准备二氢辣椒素样品

用DMSO溶剂配置二氢辣椒素母液，浓度为60mM。用KRH缓冲液配置10倍等比稀释的溶液，8个浓度梯度，从低到高分别为190nM、600nM、1.9μM、6μM、19μM、60μM、190μM、600μM。另需准备含10μM抑制剂钌红的KRH缓冲液。

3.绿色荧光钙指示剂加载细胞

去掉旧培养基，每孔加入50μL含有2μM Fluo-4,AM的加载DMEM培养基，37℃孵育30分钟。

4.加不含/含抑制剂钌红的KRH缓冲液

倒掉加载培养基，用100μL KRH缓冲液漂洗一次，然后在孔B2-B11、C2-C11和D2-D11中每孔加入100μL KRH缓冲液，在孔E2-E11、F2-F11和G2-G11中每孔加入100μL含10μM抑制剂钌红的KRH缓冲液，放细胞培养箱中，37℃孵育15分钟。

5.荧光酶标仪采集数据

从培养箱中取出96孔板，去掉盖子，放入荧光酶标仪中，测基础荧光值。然后用多道移液枪在空白对照孔(列2中的6个孔)中立即加入20μL KRH缓冲液，在检测孔(列3-列10，共8列48孔)中依次加入20μL不同浓度的二氢辣椒素样品(8个浓度梯度，终浓度从低到高为31.6nM、100nM、316nM、1μM、3.16μM、10μM、31.6μM、100μM)。混匀后，立即用荧光酶标仪测各孔的反应荧光值。

6.数据分析

将荧光酶标仪采集的数据导入Excel表格中，先计算出加入检测物质前后各孔荧光差值(即反应荧光值-基础荧光值)，然后检测组各孔扣除空白对照孔差值后，并以10μM二氢辣椒素的数值作为100％，检测组不同浓度孔数值与之相比得到相对百分比。用GraphPadPrism 7软件进行非线性回归分析，根据量-效关系方程Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC₅₀-X)*HillSlope))(设置参数Bottom＝0和Top＝100)得到量-效关系曲线和EC₅₀值。对不能进行非线性曲线拟合的数据，进行线性回归分析。对同一浓度下检测组(不含抑制剂)数值与检测组(含抑制剂)数值差异进行t检验，每组进行独立分析。

三、实验结果

基于兔TRPV1受体过表达细胞株的疼痛评价方法证明二氢辣椒素以浓度依赖的方式激活兔TRPV1受体，具有量-效关系，EC₅₀值为354.7nM。

如图8所示，表明在不加抑制剂钌红组(hTRPV1)中，在较高浓度(如1μM)的二氢辣椒素处理兔TRPV1受体过表达细胞时，收集到了荧光信号，表明兔TRPV1受体被二氢辣椒素激活，细胞外钙离子内流，产生荧光信号。在加抑制剂钌红组(hTRPV1+RR)未观察到荧光，表明兔TRPV1受体被抑制，钙离子未进入细胞内。根据GraphPad Prism 7软件的分析，得到相应的量-效关系曲线和EC₅₀值。二氢辣椒素在兔TRPV1受体过表达细胞株中激活兔TRPV1的EC₅₀值为354.7nM。p值<0.05表示两组数值之间差异具有统计学意义，用“*”表示；p值<0.01表示两组数值之间差异具有高度统计学意义，用“**”表示。

与实施例3比较，表明人TRPV1过表达受体细胞株对二氢辣椒素的敏感性高于兔TRPV1过表达受体细胞株，更适合于疼痛评价方法。

比较例9：基于兔TRPV1受体过表达细胞株的疼痛评价方法检测椰油酰胺MEA

一、实验原理

Fluo-4,AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，常用于检测细胞内钙离子浓度。Fluo-4,AM穿透细胞膜进入细胞后，被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-4，从而被滞留在细胞内。Fluo-4以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，其最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm。可以使用荧光显微镜、荧光酶标仪等检测细胞内钙离子浓度的变化。TRPV1受体是一种非选择性的离子通道，当TRPV1受体被二氢辣椒素等物质激活时，细胞外钙离子会通过TRPV1受体进入细胞内，与细胞内的Fluo-4结合，在激发光的激发下会产生绿色荧光。因此，通过观察记录细胞内荧光强度的变化，就可以分析判断TRPV1受体的激活情况。钌红是TRPV1受体抑制剂，可抑制钙离子通过TRPV1受体进入细胞内。

二、实验方法

1.接种细胞

将兔TRPV1受体过表达细胞株细胞接种在黑边透明底的96孔板中。针对检测物椰油酰胺MEA，接种1个96孔板，每个孔板接种60个孔(孔板编号B2-B11，C2-C11，…，G2-G11)，每孔1×10⁵个细胞，96孔板周边孔加入100μL 1×PBS缓冲液，降低液体挥发对细胞增殖的影响。在细胞培养箱中培养48小时左右(培养条件37℃，5％CO₂)，使细胞融合度达到95％以上。

2.准备待检测样品

用KRH缓冲液配置椰油酰胺MEA母液，浓度为6mM，然后用KRH缓冲液配置3.16倍等比稀释的溶液，8个浓度梯度，浓度从低到高分别为1.9μM、6μM、19μM、60μM、190μM、600μM、1.9mM、6mM。另需准备阳性对照样品60μM的二氢辣椒素(KRH缓冲液)，以及含10μM抑制剂钌红的KRH缓冲液。

3.绿色荧光钙指示剂加载细胞

去掉旧培养基，每孔加入50μL含有2μM Fluo-4,AM的加载DMEM培养基，37℃孵育30分钟。

4.加不含/含抑制剂钌红的KRH缓冲液

倒掉加载培养基，用100μL KRH缓冲液漂洗一次，然后在孔B2-B11、C2-C11和D2-D11中每孔加入100μL KRH缓冲液，在孔E2-E11、F2-F11和G2-G11中每孔加入100μL含10μM抑制剂钌红的KRH缓冲液，放细胞培养箱中，37℃孵育15分钟。

5.荧光酶标仪采集数据

从培养箱中取出96孔板，去掉盖子，放入荧光酶标仪中，测基础荧光值。然后用多道移液枪在空白对照孔(列2中的6个孔)中立即加入20μL KRH缓冲液，在阳性对照孔(列11中的6个孔)中加入20μL 60μM的二氢辣椒素(终浓度为10μM)。在检测孔(列3-列10，共8列48孔)中依次加入20μL 3.16倍等比稀释的样品(8个浓度梯度，终浓度从低到高为316nM、1μM、3.16μM、10μM、31.6μM、100μM、316μM、1mM)。混匀后，立即用荧光酶标仪测各孔的反应荧光值。

6.数据分析

将荧光酶标仪采集的数据导入Excel表格中，先计算出加入检测物质前后各孔荧光差值(即反应荧光值-基础荧光值)，然后检测组各孔扣除空白对照孔差值后，并以10μM二氢辣椒素的数值作为100％，检测组不同浓度孔数值与之相比得到相对百分比。用GraphPadPrism 7软件进行非线性回归分析，根据量-效关系方程Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC₅₀-X)*HillSlope))(设置参数Bottom＝0和Top＝100)得到量-效关系曲线和EC₅₀值。对不能进行非线性曲线拟合的数据，进行线性回归分析。对同一浓度下检测组(不含抑制剂)数值与检测组(含抑制剂)数值差异进行t检验，每组进行独立分析。

三、实验结果

基于兔TRPV1受体过表达细胞株的疼痛评价方法检测化妆品原料椰油酰胺MEA，发现椰油酰胺MEA有兔TRPV1激活剂活性，EC₅₀值2251μM，存在致痛风险。

如图9所示，在不加抑制剂钌红组(oTRPV1)和加抑制剂钌红组(oTRPV1+RR)中，较低浓度(如1μM)的椰油酰胺MEA处理兔TRPV1受体过表达细胞时均没有产生荧光信号，兔TRPV1受体没有被激活；而用较高浓度(如1000μM)的椰油酰胺MEA处理兔TRPV1受体过表达细胞时，不加抑制剂钌红组(hTRPV1)产生荧光信号，加抑制剂钌红组(hTRPV1+RR)未产生荧光信号，表明兔TRPV1受体被椰油酰胺MEA激活，介导了钙离子内流，且激活具有浓度依赖性。根据GraphPad Prism 7软件分析，得到椰油酰胺MEA激活兔TRPV1受体的量-效关系曲线和EC₅₀值2251μM。

在图4中，p值<0.05表示两组数值之间差异具有统计学意义，用“*”表示；p值<0.01表示两组数值之间差异具有高度统计学意义，用“**”表示。

与实施例4比较，表明人TRPV1过表达受体细胞株对椰油酰胺MEA的敏感性高于兔TRPV1过表达受体细胞株，更适合于疼痛评价方法。

比较例10：鸡胚绒毛尿囊膜试验测试椰油酰胺MEA眼刺激性情况

一、实验原理

鸡胚绒毛尿囊膜试验(Hen’s Egg Test on the Chorioallantoic Membrane，HET-CAM)是用来进行体外眼刺激性评估的一种方法。该方法所用孵化鸡胚中期的绒毛尿囊膜血管系统与眼结膜组织结构类似，并具有完整、清晰和透明的特点。在试验中，将一定量受试物直接与鸡胚绒毛尿囊膜接触一段时间后，观察绒毛尿囊膜毒性效应指标(如出血、凝血和血管融解)的变化，然后组合得到一个评分，用于评估受试物的眼刺激性。试验采用终点法。

二、实验方法

1.鸡胚孵育

白莱杭鸡受精SPF鸡胚购回后置孵化箱中，气室端朝上，在温度为37.5±0.5℃、相对湿度为55-70％条件下孵化，每小时水平方向倾斜45度自动翻蛋3-6次，自动换气，孵化至第9天时用于试验。

2.准备待检测样品

准备0.9％生理盐水，作为阴性对照样品。用0.9％生理盐水配置1％脂肪醇醚硫酸钠盐混合物(Texapon ASV)溶液，作为阳性对照样品。用KRH缓冲液配置2％的椰油酰胺MEA母液，然后用0.9％生理盐水配置成0.06％的椰油酰胺MEA作为待测样品。然后放在37℃水浴锅中，温育15分钟以上。

3.绒毛尿囊膜制备

9日龄鸡胚照蛋检查，并在蛋壳表面标记气室位置，用镊子剥去蛋壳标记位置，露出白色蛋膜。用移液器加入1-2毫升0.9％生理盐水湿润蛋膜，并吸出，然后用镊子小心去除蛋膜，保证绒毛尿囊膜完整性。

4.试验测试过程

取0.3毫升样品滴加CAM上，确保至少50％的CAM面被样品覆盖。作用3分钟后，用0.9％生理盐水轻轻冲洗绒毛尿囊膜上的样品，在30秒内冲洗完成后观察。每组测试至少3只鸡胚。

5.结果观察

观察并记录出血、凝血和血管溶解毒性效应变化程度。拍照并保存试验图片。

三、实验结果

鸡胚绒毛尿囊膜试验显示0.06％的椰油酰胺MEA无眼刺激性。

如图10所示，图A显示绒毛尿囊膜在0.9％的生理盐水处理前和处理后没有明显变化，未观察到绒毛尿囊膜有出血、凝血和血管溶解变化；图B显示绒毛尿囊膜在1％ASV处理后，出现中等程度的出血现象；图C显示绒毛尿囊膜在0.06％椰油酰胺MEA处理后，未见明显变化，未观察到绒毛尿囊膜有出血、凝血和血管溶解现象。

与实施例4比较，在疼痛评估方法中椰油酰胺MEA的EC₅₀值为34.37μM，远低于鸡胚绒毛尿囊膜试验中0.06％的椰油酰胺MEA的物质的量浓度2465.3μM，也即在鸡胚绒毛尿囊膜试验中未检测出眼刺激的椰油酰胺MEA浓度在疼痛评估方法中可以引起显著的TRPV1特异的信号，预测有致痛风险。这表明基于人TRPV1过表达受体细胞株的疼痛评估方法在预测疼痛方面具有明显的优势，而鸡胚绒毛尿囊膜试验在评价疼痛方面有局限性。因此，基于人TRPV1过表达受体细胞株的疼痛评估方法在预测物质是否具有致痛风险评价方面具有较高的应用价值，可用于大规模筛选化妆品配方筛选，指导更温和化妆品开发。

序列表

<110> 上海家化联合股份有限公司

<120> 基于人TRPV1受体过表达细胞株的评价方法

<130> 203078

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2540

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tctagagcca ccatgaagaa atggagcagc acagacttgg gggcagctgc ggacccactc 60

caaaaggaca cctgcccaga ccccctggat ggagacccta actccaggcc acctccagcc 120

aagccccagc tctccacggc caagagccgc acccggctct ttgggaaggg tgactcggag 180

gaggctttcc cggtggattg ccctcacgag gaaggtgagc tggactcctg cccgaccatc 240

acagtcagcc ctgttatcac catccagagg ccaggagacg gccccaccgg tgccaggctg 300

ctgtcccagg actctgtcgc cgccagcacc gagaagaccc tcaggctcta tgatcgcagg 360

agtatctttg aagccgttgc tcagaataac tgccaggatc tggagagcct gctgctcttc 420

ctgcagaaga gcaagaagca cctcacagac aacgagttca aagaccctga gacagggaag 480

acctgtctgc tgaaagccat gctcaacctg cacgacggac agaacaccac catccccctg 540

ctcctggaga tcgcgcggca aacggacagc ctgaaggagc ttgtcaacgc cagctacacg 600

gacagctact acaagggcca gacagcactg cacatcgcca tcgagagacg caacatggcc 660

ctggtgaccc tcctggtgga gaacggagca gacgtccagg ctgcggccca tggggacttc 720

tttaagaaaa ccaaagggcg gcctggattc tacttcggtg aactgcccct gtccctggcc 780

gcgtgcacca accagctggg catcgtgaag ttcctgctgc agaactcctg gcagacggcc 840

gacatcagcg ccagggactc ggtgggcaac acggtgctgc acgccctggt ggaggtggcc 900

gacaacacgg ccgacaacac gaagtttgtg acgagcatgt acaatgagat tctgatgctg 960

ggggccaaac tgcacccgac gctgaagctg gaggagctca ccaacaagaa gggaatgacg 1020

ccgctggctc tggcagctgg gaccgggaag atcggggtct tggcctatat tctccagcgg 1080

gagatccagg agcccgagtg caggcacctg tccaggaagt tcaccgagtg ggcctacggg 1140

cccgtgcact cctcgctgta cgacctgtcc tgcatcgaca cctgcgagaa gaactcggtg 1200

ctggaggtga tcgcctacag cagcagcgag acccctaatc gccacgacat gctcttggtg 1260

gagccgctga accgactcct gcaggacaag tgggacagat tcgtcaagcg catcttctac 1320

ttcaacttcc tggtctactg cctgtacatg atcatcttca ccatggctgc ctactacagg 1380

cccgtggatg gcttgcctcc ctttaagatg gaaaaaactg gagactattt ccgagttact 1440

ggagagatcc tgtctgtgtt aggaggagtc tacttctttt tccgagggat tcagtatttc 1500

ctgcagaggc ggccgtcgat gaagaccctg tttgtggaca gctacagtga gatgcttttc 1560

tttctgcagt cactgttcat gctggccacc gtggtgctgt acttcagcca cctcaaggag 1620

tatgtggctt ccatggtatt ctccctggcc ttgggctgga ccaacatgct ctactacacc 1680

cgcggtttcc agcagatggg catctatgcc gtcatgatag agaagatgat cctgagagac 1740

ctgtgccgtt tcatgtttgt ctacatcgtc ttcttgttcg ggttttccac agcggtggtg 1800

acgctgattg aagacgggaa gaatgactcc ctgccgtctg agtccacgtc gcacaggtgg 1860

cgggggcctg cctgcaggcc ccccgatagc tcctacaaca gcctgtactc cacctgcctg 1920

gagctgttca agttcaccat cggcatgggc gacctggagt tcactgagaa ctatgacttc 1980

aaggctgtct tcatcatcct gctgctggcc tatgtaattc tcacctacat cctcctgctc 2040

aacatgctca tcgccctcat gggtgagact gtcaacaaga tcgcacagga gagcaagaac 2100

atctggaagc tgcagagagc catcaccatc ctggacacgg agaagagctt ccttaagtgc 2160

atgaggaagg ccttccgctc aggcaagctg ctgcaggtgg ggtacacacc tgatggcaag 2220

gacgactacc ggtggtgctt cagggtggac gaggtgaact ggaccacctg gaacaccaac 2280

gtgggcatca tcaacgaaga cccgggcaac tgtgagggcg tcaagcgcac cctgagcttc 2340

tccctgcggt caagcagagt ttcaggcaga cactggaaga actttgccct ggtccccctt 2400

ttaagagagg caagtgctcg agataggcag tctgctcagc ccgaggaagt ttatctgcga 2460

cagttttcag ggtctctgaa gccagaggac gctgaggtct tcaagagtcc tgccgcttcc 2520

ggggagaagt gagcggccgc 2540

<210> 2

<211> 2549

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tctagagcca ccatgaagag atgggtgagc ttggactcgg gggaatctga ggacccgctt 60

ccagaagaca cctgcccaga cctcctggat ggagattcca acgccaagcc acctccagcc 120

aagccccaca tcttctccac ggccaagagc cgcagccggc tctttgggaa aggcgactca 180

gaggagacgt cccccatgga ttgctcttat gaggaaggcg aactggcccc ctgcccggcc 240

attacggtca gctctgtgat cattgtccag aggtctgggg atggccccac ctgtgccagg 300

cagctgtcgc aggactccgt ggcagccgcc ggcgccgaga agcccctgaa actctacgat 360

cgccggcgga tcttcgaggc cgtggcccag aacaactgcc aggagctgga gagcctgctg 420

tgcttcctgc agaggagcaa gaagcgcctg acggacagcg agttcaaaga ccctgagaca 480

gggaagacct gtctgctcaa agccatgctc aacctgcaca gcgggcaaaa cgacaccatc 540

ccgctgctcc tggagatcgc gcggcagacg gacagcctga aggagttcgt caacgccagc 600

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gacttcttta agaaaaccaa ggggcggcct ggcttctact ttggtgagct gcccctgtcc 780

ctggctgcgt gcaccaacca gctggccatc gtgaagttcc tgctgcagaa ctcctggcag 840

ccggcggaca tcagcgccag ggactcggtg ggcaacacgg tgctgcacgc cctggtggag 900

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ctgacgccgc tggccctggc tgccggcagt gggaagattg gggtgctggc ctacattctg 1080

cagcgggaga tcctggagcc cgagtgccgg cacctgtccc ggaagttcac cgagtgggcc 1140

tacgggcctg tgcactcctc gctctacgac ctgtcctgca tcgacacctg cgagaggaac 1200

tccgtgctgg aggtgatcgc ctacagcagc agtgagaccc ctaatcgcca cgacatgctc 1260

ttggtggagc cactgaaccg actgctgcag gacaagtggg acagagttgt caagcgcatc 1320

ttctacttca acttcttcgt ctactgcctg tacatgatca tcttcaccac cgccgcctac 1380

tacaggcccg tggatggcct gcctccttat aagctgagaa acctccctgg agactatttc 1440

cgagtcactg gagagattct gtccgtagca gggggcgtct actttttttt ccgagggatc 1500

cagtatttcc tgcagaggcg gccgtccatg aaggccctgt ttgtggacag ctacagtgag 1560

atgctcttct tcgtgcaggc cctgttcatg ctggcgacgg tggtgctgta cttcagccac 1620

tgcaaggagt atgtggcgac catggtgttc tccctggcct tgggctggat caacatgctc 1680

tactacaccc gtgggttcca gcagatgggc atctacgccg tcatgatcga gaagatgatc 1740

ctgagggacc tgtgtcgttt catgtttgtc tacctggtgt tcttgttcgg cttttccaca 1800

gcggtggtga ctctgattga ggacgggaag aacagctcga cgtctgccga gtccacgtcg 1860

cacaggtggc gggggtttgg ctgtcggtcg tccgatagct cctacaacag cctgtactcc 1920

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ctcctgctca acatgctcat cgcgctcatg ggcgagacgg tcaacaagat cgcacaggag 2100

agcaagagca tctggaagct gcagagagct atcaccatcc tggacacaga gaagggcttc 2160

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gacggcaagg acgactgcag gtggtgcttc agggtggacg aggtgaactg gaccacctgg 2280

aacaccaacg tgggcatcat caacgaggac ccgggcaact gtgagggcgt caagcgcacc 2340

ctgagcttct ccctgaggtc gggcagagtt tcagggagaa actggaagaa cttcgccttg 2400

gttccccttt taagggatgc cagtacccga gaccggcacc ccgcccctcc cgaggacgtc 2460

cacctgaggc cctttgtggg ctccctgaag ccgggggacg ccgagctctt caaggactct 2520

gtggccgcgg cagagaagtg agcggccgc 2549