一种通用型car-t细胞的制备方法
阅读说明：本技术 一种通用型car-t细胞的制备方法 (Preparation method of universal CAR-T cell ) 是由 李相鲁 彭一洪 张严冬 于 2021-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种通用型CAR-T细胞的制备方法,包括如下步骤：采集供者的外周血,分离CD3阳性的T淋巴细胞；对CD3阳性的T淋巴细胞进行激活；将携带通用型嵌合抗原受体(CAR)基因序列的慢病毒转染活化的人T淋巴细胞。本发明通过对通用型CAR-T细胞制备工艺中的关键步骤和关键条件进行优化,有效提高了CAR-T细胞的CAR表达率；进一步通过设计特异靶向TRAC和B2M基因编码区的sgRNA对TRAC和B2M基因进行了高效敲除；再进一步配合TRAC和B2M阴性细胞的筛选,有效的防止通用型CAR-T细胞被患者自身的非靶向细胞和淋巴细胞杀伤,增强了CAR-T细胞的应用效率。(The invention discloses a preparation method of a universal CAR-T cell, which comprises the following steps: collecting peripheral blood of a donor, and separating T lymphocytes positive to CD 3; activating T lymphocytes positive for CD 3; activated human T lymphocytes are transfected with lentiviruses carrying universal Chimeric Antigen Receptor (CAR) gene sequences. The CAR expression rate of the CAR-T cells is effectively improved by optimizing key steps and key conditions in the preparation process of the universal CAR-T cells; further, the high-efficiency knockout is carried out on TRAC and B2M genes by designing sgRNA specifically targeting TRAC and B2M gene coding regions; and further matching with the screening of TRAC and B2M negative cells, the universal CAR-T cells are effectively prevented from being killed by non-target cells and lymphocytes of patients, and the application efficiency of the CAR-T cells is enhanced.)
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，尤其涉及一种通用型CAR-T细胞的制备方法。
背景技术
急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)等血液癌症，化疗和靶向药物的临床治疗效果不理想，随着肿瘤免疫学理论和技术的快速发展，免疫治疗作为一种新的治疗手段，其中的嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(ChimericAntigen Receptor T-Cell，CAR-T)越来越受到关注。
CAR-T细胞临床试验细胞的来源，大多数来自患者自身的T细胞，长期经过药物治疗细胞活性较低，无法保证制备过程中的细胞状态和活率，并且患者身体状况不适合大量采血，限制细胞数量和有效治疗时间的选择，而通用型CAR-T细胞可以有效的解决上述问题。
目前，通用型CAR-T的制备存在两方面的难点：一是转染病毒后CAR的表达率偏低，导致回输到患者体内的T细胞大部分都是没有作用的普通细胞，同时也加大患者的身体负担；二是基因敲除率效果不好，阴性细胞数量只占整体的数量少部分，虽然经过磁珠阴性分选后可以去除绝大部分阳性细胞，阴性细胞数量少，时间成本和费用都存在着大量浪费。
因此，急需开发一种可同时提高CAR表达率及基因敲除率的CAR-T细胞制备工艺，降低资金和时间成本，并为利用CAR-T细胞对患者进行有效治疗提供技术支持。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种通用型CAR-T细胞的制备方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种通用型CAR-T细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1、采集供者的外周血，分离CD3阳性的T淋巴细胞；
S2、T淋巴细胞的激活：
配制培养基：30～50mL X-VIVO，700～1500IU IL-2，25～60IUIL-7，48～70IU IL-15，1.5～6.5mL HAS；利用所述培养基重悬S1分离得到的T淋巴细胞，调整细胞密度为0.5×106～1×106个/mL，接种于经CD3抗体、CD28抗体和重组人纤维蛋白包被的孔板中，进行细胞激活；
S3、将携带通用型嵌合抗原受体基因序列的慢病毒转染活化的人T淋巴细胞，即得。
其中，所述孔板包被了CD3抗体、CD28抗体和重组人纤维蛋白，包被步骤如下：
(1)配制包被液：CD3抗体750～920μL，CD28抗体540～810μL，重组人纤维蛋白520～960μL，0.9％氯化钠注射用水定容至5mL；
(2)包被六孔板，每孔加4mL包被液，10000g、4℃、离心6h；
(3)放置于37℃培养箱中，孵育10h。
进一步地，S3具体包括以下步骤：
取激活的T淋巴细胞，并向每1.5～5.5×106个细胞中加入5～25μL聚凝胺(polybrene)和8～25μL鱼精蛋白(Protamine)，将携带通用型嵌合抗原受体基因序列的慢病毒以MOI＝3.95～6.65的病毒量转染激活的T淋巴细胞，在1000g、4℃条件下离心90min后，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养72h，流式细胞仪检测，筛选嵌合抗原受体表达阳性的细胞。
本发明制备方法中，所述通用型嵌合抗原受体可选为本领域常规使用的通用型嵌合抗原受体，在本发明的一个
具体实施方式
中，以CD19作为示例性说明。
经过实验验证，利用前述制备方法制备的通用型CAR-T细胞具有良好的CAR表达率，且T细胞激活所使用的培养基配方、孔板包被的抗体种类与用量以及慢病毒转染的滴度等，均对提高CAR表达率具有积极影响。
更进一步地，为了防止通用型CAR-T细胞和患者自身淋巴细胞互相杀伤，本发明所述的制备方法还包括步骤S4：对嵌合抗原受体表达阳性的细胞进行TRAC基因和B2M基因的敲除。
其中，敲除TRAC基因可防止通用型CAR-T细胞被患者的非靶向细胞杀伤，敲除B2M基因可防止通用型CAR-T细胞被患者的淋巴细胞杀伤。
所述敲除方式可采用本领域通用的基因编辑方式进行。
作为一种示例性说明，在本发明的一个具体实施方式中，步骤S4中，利用Cas9与特异靶向TRAC和B2M基因编码区的sgRNA进行基因敲除。
作为优选，特异靶向TRAC基因编码区的sgRNA为：
TRAC-sgRNA1：5’-CTTCCAGAGCGACAGTGATGTGG-3’；
TRAC-sgRNA2：5’-CCAATTCACGGATCTTGATTCTC-3’。
作为优选，特异靶向B2M基因编码区的sgRNA为：
B2M-sgRNA1：5’-ACACTGAAGTCGACTGACTG-3’；
B2M-sgRNA2：5’-ACTCGCTCTTTCTAGCCTGG。
本发明提供的上述sgRNA相比针对同样靶标序列的sgRNA具有更高效的基因敲除效率。
进一步地，步骤S4具体包括如下步骤：
(1)加入以下剂量成分配制CAS9和sgRNA试剂，并于37℃下孵育90min；
(2)配制电转液：40～110μL P3 Solution和35～100μL Supplement 1(试剂盒为P3 rimary Cell 4D-Necleofector X Kit LP3)；
(3)步骤(1)和步骤(2)配制的试剂混合，加入1.5～7.5×107个细胞，利用电转仪进行电转导；
(4)培养72h，流式细胞仪检测，筛选TRAC和B2M基因表达阴性的细胞。
为了更进一步地提高CAR-T细胞中TRAC和B2M基因的阴性率，本发明所述制备方法还包括步骤S5：
(1)取S4筛选得到的TRAC和B2M基因表达阴性的细胞，并向每5×107个细胞加入500μL PE anti–Human HLA ABC，于37℃下孵育90min；
(2)离心清洗，加入400μL Anti–PE beads和400μL CD3 Microbeads Human，于37℃下孵育90min；
(3)通过磁力架分离出阴性细胞；
(4)培养48h，流式细胞仪检测，筛选TRAC和B2M基因表达阴性的细胞。
第二方面，本发明提供了前述制备方法制备的通用型CAR-T细胞，及其在制备肿瘤治疗药物方面的应用。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明通过对通用型CAR-T细胞制备工艺中的关键步骤和关键条件进行优化，有效提高了CAR-T细胞的CAR表达率。同时，通过设计特异靶向TRAC和B2M基因编码区的sgRNA对TRAC和B2M基因进行了高效敲除。再进一步配合TRAC和B2M阴性细胞的筛选，有效的防止通用型CAR-T细胞被患者自身的非靶向细胞和淋巴细胞杀伤，增强了CAR-T细胞的应用效率。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1制备的CAR-T细胞的CAR表达情况。
图2为本发明对比例1制备的CAR-T细胞的CAR表达情况。
图3为本发明实施例2制备的CAR-T细胞的CAR表达情况。
图4为本发明实施例2中利用Cas9和sgRNA对CAR-T细胞进行基因编辑后，TRAC和B2M基因的敲除情况。
图5为本发明实施例2中对基因敲除后的CAR-T细胞进行TRAC和B2M阴性细胞分选后的分选情况。
图6为本发明对比例2制备的CAR-T细胞的CAR表达情况。
图7为本发明对比例2中利用Cas9和sgRNA对CAR-T细胞进行基因编辑后，TRAC和B2M基因的敲除情况。
图8为本发明对比例2中对基因敲除后的CAR-T细胞进行TRAC和B2M阴性细胞分选后的分选情况。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
步骤1：制备抗体包被孔板
1.1配制包被液：CD3抗体830μL，CD28抗体620μL，重组人纤维蛋白900μL，0.9％氯化钠注射用水定容至5mL。
1.2包被六孔板，每孔加4mL包被液，10000g、4℃、离心6h。
1.3放于37℃培养箱中，孵育10h。
步骤2：分离T细胞
2.1体检健康的志愿者献血，800g、常温、离心40min，PBS重悬血细胞。
2.2重悬液20mL加淋巴细胞分离液15mL，轻柔将重悬液加在淋巴细胞分离液上层，1000g、4℃，离心90min。
2.3配制磁珠分离液：EDTA 1200μL、HSA 900μL、0.9％氯化钠注射用水20mL。
2.4吸取白膜层细胞进行计数，加入磁珠分离液混匀。
2.5加入CD3磁珠，4℃静置90min。
2.6用磁力柱分离得到CD3阳性的T细胞。
步骤3：T细胞的激活
3.1配制培养基：
表1：培养基配方
名称
X-VIVO
IL-2
IL-7
IL-15
HSA
单位
mL
IU
IU
IU
mL
用量
30
1000
50
65
5.2
利用所配制的培养基将步骤2.6分离得到的CD3阳性的T细胞进行重悬。
3.2调整细胞密度为0.85×106个/mL，加入到步骤1中包被的六孔板中激活。
步骤4：转染四质粒慢病毒
4.1细胞换液，每2.5×106个细胞加入10μL聚凝胺(polybrene)和15μL鱼精蛋白(Protamine)。
4.2将携带通用型嵌合抗原受体(CAR)基因序列(CD19)的慢病毒以MOI＝4.60的病毒量转染细胞，1000g、4℃，离心90min。
4.3培养72h，流式细胞仪检测，如图1所示，CAR表达率为55.8％。
对比例1
步骤1：制备抗体包被孔板
1.1配制包被液：CD3抗体600μL，CD28抗体900μL，重组人纤维蛋白500μL，0.9％氯化钠注射用水定容至5mL。
1.2包被六孔板，每孔加4mL包被液，10000g、4℃、离心6h。
1.3放于37℃培养箱中，孵育10h。
步骤2：分离T细胞
2.1体检健康的志愿者献血，800g、常温、离心40min，PBS重悬血细胞。
2.2重悬液20mL加淋巴细胞分离液15mL，轻柔将重悬液加在淋巴细胞分离液上层，1000g、4℃，离心90min。
2.3配制磁珠分离液：EDTA 1200μL、HSA 900μL、0.9％氯化钠注射用水20mL。
2.4吸取白膜层细胞进行计数，加入磁珠分离液混匀。
2.5加入CD3磁珠，4℃静置90min。
2.6用磁力柱分离得到CD3阳性的T细胞。
步骤3：T细胞的激活
3.1配制培养基：
表2：培养基配方
名称
X-VIVO
IL-2
IL-7
IL-15
HSA
单位
mL
IU
IU
IU
mL
用量
60
600
62
75
7
利用所配制的培养基将步骤2.6分离得到的CD3阳性的T细胞进行重悬。
3.2调整细胞密度为0.85×106个/mL，加入到步骤1中包被的六孔板中激活。
步骤4：转染四质粒慢病毒
4.1细胞换液，每2.5×106个细胞加入26μL聚凝胺(polybrene)和26μLProtamine。
4.2将携带通用型嵌合抗原受体(CAR)基因序列(CD19)以MOI＝3.5的病毒量转染细胞，1000g、4℃，离心90min。
4.3培养72h，流式细胞仪检测，如图2所示，CAR表达率为14.4％。
通过对比实施例1和对比例2可以看出，实施例1在CAR表达率相较对比例2具有显著提高。说明本发明通过采用特定的T细胞培养基配方、特定的抗体包被孔板对T细胞进行培养与激活，并采用特定的病毒滴度，可有效提高了慢病毒转染后T细胞的CAR表达率。
实施例2
步骤1：制备抗体包被孔板
1.1配制包被液：CD3抗体750μL，CD28抗体600μL，重组人纤维蛋白540μL，0.9％氯化钠注射用水定容至5mL。
1.2包被六孔板，每孔加4mL包被液，10000g、4℃、离心6h。
1.3放于37℃培养箱中，孵育10h。
步骤2：分离T细胞
2.1体检健康的志愿者献血，800g、常温、离心40min，PBS重悬血细胞。
2.2重悬液20mL加淋巴细胞分离液15mL，轻柔将重悬液加在淋巴细胞分离液上层，1000g、4℃，离心90min。
2.3配制磁珠分离液：EDTA 1200μL、HSA 900μL、0.9％氯化钠注射用水20mL。
2.4吸取白膜层细胞进行计数，加入磁珠分离液混匀。
2.5加入CD3磁珠，4℃静置90min。
2.6用磁力柱分离得到CD3阳性的T细胞。
步骤3：T细胞的激活
3.1配制培养基：
表3：培养基配方
名称
X-VIVO
IL-2
IL-7
IL-15
HSA
单位
mL
IU
IU
IU
mL
用量
45
1400
55
60
3.5
利用所配制的培养基将步骤2.6分离得到的CD3阳性的T细胞进行重悬。
3.2调整细胞密度为0.85×106个/mL，加入到步骤1中包被的六孔板中激活。
步骤4：转染四质粒慢病毒
4.1细胞换液，每5.5×106个细胞加入15μL聚凝胺(polybrene)和20μL鱼精蛋白(Protamine)。
4.2将携带通用型嵌合抗原受体(CAR)基因序列(CD19)以MOI＝5.50的病毒量转染细胞，1000g、4℃，离心90min。
4.3培养72h，流式细胞仪检测，如图3，CAR表达率为63.0％。
步骤5：制备sgRNA
5.1从TRAC和B2M基因编码区中各选取两个sgRNA。
表4：sgRNA序列
编号
sgRNA序列
TRAC-sgRNA1
CTTCCAGAGCGACAGTGATGTGG
TRAC-sgRNA2
CCAATTCACGGATCTTGATTCTC
B2M-sgRNA1
ACACTGAAGTCGACTGACTG
B2M-sgRNA2
ACTCGCTCTTTCTAGCCTGG
5.2使用geneart_precision gRNA synthesis kit合成sgRNA。
表5：PCR反应体系
试剂
IVT管1Trac-2
NTP mix
9.3μL
引物
6.1μL
5X TranscriptAid Reaction Buffer
5.2μL
TranscriptAid Enzyme Mix
3.6μL
步骤6：电转敲除基因
6.1配制CAS9和sgRNA，37℃、孵育90min。
表6：CAS9与sgRNA配制表
物料名称
用量(μg)
CAS9
72
TRAC-sgRNA1
28
TRAC-sgRNA2
11
B2M-sgRNA1
9
B2M-sgRNA2
16
6.2配制电转液：92μL P3 Solution和86μL Supplement 1(试剂盒为P3 rimaryCell 4D-Necleofector X Kit LP3)。
6.3将6.1和6.2试剂混合，加入6.5×107个细胞，LONZA电转仪电转。
6.4培养72h，流式细胞仪检测基因敲除，如图4所示，基因敲除率为72.1％。
步骤7：TRAC和B2M阴性细胞分选
7.1细胞换液，5×107个细胞加入500μL PE anti–Human HLA ABC，37℃、孵育90min。
7.2离心清洗，加入400μL Anti–PE beads和400μL CD3 Microbeads Human，37℃、孵育90min。
7.3通过磁力架分离出阴性细胞。
7.4培养48h，流式细胞仪检测，如图5所示，阴性分选后，TRAC和B2M阴性细胞率为99.7％。
对比例2
步骤1：制备抗体包被孔板
1.1配制包被液：CD3抗体600μL，CD28抗体900μL，重组人纤维蛋白500μL，0.9％氯化钠注射用水定容至5mL。
1.2包被六孔板，每孔加4mL包被液，10000g、4℃、离心6h。
1.3放于37℃培养箱中，孵育10h。
步骤2：分离T细胞
2.1体检健康的志愿者献血，800g、常温、离心40min，PBS重悬血细胞。
2.2重悬液20mL加淋巴细胞分离液15mL，轻柔将重悬液加在淋巴细胞分离液上层，1000g、4℃，离心90min。
2.3配制磁珠分离液：EDTA 1200μL、HSA 900μL、0.9％氯化钠注射用水20mL。
2.4吸取白膜层细胞进行计数，加入磁珠分离液混匀。
2.5加入CD3磁珠，4℃静置90min。
2.6用磁力柱分离得到CD3阳性的T细胞。
步骤3：T细胞的激活
3.1配制培养基：
表7：培养基配方
名称
X-VIVO
IL-2
IL-7
IL-15
HSA
单位
mL
IU
IU
IU
mL
用量
60
600
62
75
7
利用所配制的培养基将步骤2.6分离得到的CD3阳性的T细胞进行重悬。
3.2调整细胞密度为0.85×106个/mL，加入到步骤1中包被的六孔板中激活。
步骤4：转染四质粒慢病毒
4.1细胞换液，每2.5×106个细胞加入26μL聚凝胺(polybrene)和26μL鱼精蛋白(Protamine)。
4.2将携带通用型嵌合抗原受体(CAR)基因序列(CD19)以MOI＝3.5的病毒量转染细胞，1000g、4℃，离心90min。
4.3培养72h，流式细胞仪检测，如图6所示，CAR表达率为11.5％。
步骤5：制备sgRNA
5.1从TRAC和B2Mbeta-2-microglobμLin基因编码区中各选取两个sgRNA。
表8：sgRNA序列
编号
sgRNA序列
TRAC-sgRNA1
GATCGAGAGCGAGAGTGATCTGC
TRAC-sgRNA2
ATCATCCAGGAATGTTGATTCTA
B2M-sgRNA1
GTTCATGAAGTCCTCGCGCT
B2M-sgRNA2
TTACACTATGTCTCGCCTGC
5.2使用geneart_precision gRNA synthesis kit合成sgRNA。
表9：PCR反应体系
试剂
IVT管1Trac-2
NTP mix
9.3μL
引物
6.1μL
5X TranscriptAid Reaction Buffer
5.2μL
TranscriptAid Enzyme Mix
3.6μL
步骤6：电转敲除基因
6.1配制CAS9和sgRNA，37℃、孵育90min。
表10：CAS9与sgRNA配制表
物料名称
用量(μg)
CAS9
82
TRAC-sgRNA1
36
TRAC-sgRNA2
20
B2M-sgRNA1
11
B2M-sgRNA2
24
6.2配制电转液：120μL P3 Solution和120μL Supplement 1(试剂盒为P3 rimaryCell 4D-Necleofector X Kit LP3)。
6.3将6.1和6.2试剂混合，加入5.5×107个细胞，LONZA电转仪电转。
6.4培养72h，流式细胞仪检测，如图7所示，基因敲除率为45.6％。
步骤7：TRAC和B2M阴性细胞分选
7.1细胞换液，5×107个细胞加入500μL PE anti–Human HLA ABC，37℃、孵育90min。
7.2离心清洗，加入400μL Anti–PE beads和400μL CD3 Microbeads Human，37℃、孵育90min。
7.3通过磁力架分离出阴性细胞。
7.4培养48h，流式细胞仪检测，如图8所示，阴性分选后，TRAC和B2M阴性细胞率为65.1％。
通过对比实施例2和对比例2可以看出，实施例2在CAR表达率、基因敲除率及TRAC和B2M阴性细胞率方面，相较对比例2均有明显的提高。说明本发明通过采用特定的T细胞培养基配方、特定的抗体包被孔板对T细胞进行培养与激活，有效的提高了慢病毒转染后CAR的表达率，同时通过设计特定的sgRNA，实现了TRAC和B2M基因的高效敲除，进一步利用阴性细胞分选，得到了99.7％的阴性细胞率，可有效防止通用型CAR-T细胞和患者自身淋巴细胞互相杀伤。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 广东万海细胞生物科技有限公司
<120> 一种通用型CAR-T细胞的制备方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttccagagc gacagtgatg tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaattcacg gatcttgatt ctc 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acactgaagt cgactgactg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actcgctctt tctagcctgg 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatcgagagc gagagtgatc tgc 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcatccagg aatgttgatt cta 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gttcatgaag tcctcgcgct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttacactatg tctcgcctgc 20