具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

含有HSV-2Us5基因的细胞系的制备：

1)HSV-2Us5基因编码区的克隆：

以本实验室已经构建的表达载体pcDNA3.1(+)-gJ(该载体是将HSV-2包膜糖蛋白gJ的基因(GenBank:KU310668.1)序列插入到pcDNA3.1(+)的EcoRI和XbaI这两个酶切位点之间)为模板，PCR扩增包膜糖蛋白gJ的基因(US5)，正向引物：5’-CGCGGATCCATGGATCGGTATGCC-3’，反向引物：5’-GCCGTTTAAACTCATGGGGCAAATTG-3’。最终获得包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(HSV-2US5序列)，该序列编码SEQ ID NO.3所示的蛋白(HSV-2包膜糖蛋白gJ序列)。

以上方案中，为了实现和载体的连接，在正向和反向引物的5’端分别加了BamH I酶切位点(5’-GGATCC-3’)和Pme I酶切位点(5’-GTTTAAAC-3’)和相应的保护碱基。

2)慢病毒载体的构建

将克隆得到的HSV-2US5基因片段的PCR产物和本实验室构建的慢病毒载体pLenti6.3-CMV-β7-IRES2-EGFP/V5-DEST(Chang Li etal,Binding of HIV-1virions toα4β7expre ssing cells and impact of antagonizingα4β7on HIV-1infection ofprimary CD4⁺T cells.VIROLOGICA SINICA 2014,29(6):381-392)均进行双酶切(BamHI和PmeI)，其反应体系如下：

37℃反应30分钟。

然后，双酶切质粒与PCR产物分别利用试剂盒按照说明书进行纯化回收，回收结果利用1％琼脂糖凝胶检测其浓度。

目标基因与表达质粒载体的连接与转化，具体步骤如下：

a.配置连接反应体系(10μl)

10×T4 DNA ligase Buffer 1μl

T4 DNA ligase 1μl

DNA片段(片段的摩尔数控制在载体的3-10倍)

ddH₂O至 10μl

b.25℃连接4h；

c.全量加入100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置25min；

d.42℃加热90s后，冰水浴放置3min；

e.加入890μl LB液体培养基，37℃，150rpm/min振荡培养60min；

f.在含有氨苄霉素(Amp，100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜；

g.挑取单菌落于划板的LB固体培养基(Amp，100mg/L)培养16小时左右，同时PCR菌落检测阳性克隆。

h.挑取菌落PCR阳性的克隆进行测序鉴定，使用的测序引物如下：

正向引物:5’-CGCGGATCCATGGATCGGTATGCC-3’

反向引物:5’-GCCGTTTAAACTCATGGGGCAAATTG-3’

I.测序结果如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，通过序列比对发现在US5的第258bp处有一个点突变(C变为T)，但是对应的氨基酸并未改变，不影响蛋白序列。将鉴定正确的pLenti6.3-J2-EGFP克隆保存质粒和菌种。

3)包装慢病毒

(1)利用质粒提取试剂盒(操作参照说明书进行)提取含HSV-2gJ基因序列的慢病毒表达载体(pLenti6.3-J2-EGFP)质粒和辅助质粒psPAX-2和pMD-2G。

(2)转染前20h将HEK293T细胞铺于六孔板中，1.2×10⁶细胞/孔。

(3)取8μL脂质体稀释在250μL OPTI-MEM中，室温静置5min。

(4)将慢病毒质粒(pLenti6.3-J2-EGFP)与辅助质粒(psPAX-2+pMD-2G)以适当比例(9:8:1)(六孔板每孔总质粒量为4ug)混合，并用250μl OPTI-MEM稀释。

(5)将稀释后的质粒加入脂质体中，轻轻混匀，室温静置20min。

(6)将脂质体-质粒混合液缓慢加入6孔板中，轻晃培养板摇匀，37℃培养48h。由于gJ与GFP荧光蛋白构成双顺反子，可以通过荧光蛋白来监测gJ表达。

(7)收集培养上清，0.45μM滤器过滤后，添加1/10体积的FBS，分装置于-80℃保存。

4)慢病毒滴度测定

1)转染前～20h将CHO细胞铺24孔板中。

2)测定当天，将慢病毒10倍倍比稀释，取0.5mL每孔加入培养板，放入培养箱中继续培养48h。

3)荧光显微镜下计数表达荧光蛋白的细胞数，计算出每mL病毒液中所含的感染性病毒数(MOI/mL)。

5)慢病毒转导细胞并筛选稳定表达细胞系

(1)转导前24h，将HEK293T细胞铺于24孔板，以转导时细胞覆盖培养孔表面约30％为宜；

(2)按每个细胞30MOI加入步骤3)中包装好的慢病毒，添加8μg/mL polybrene；

(3)感染4～8h，换成新鲜完全培养基，放入培养箱继续培养；

(4)感染后24～48h，添加10μg/mL灭稻瘟菌素S(Blasticidin S；Sigma)；

(5)每隔1～2天，换成新鲜的添加有10μg/mL灭稻瘟菌素S的完全培养基以去除死细胞；

(6)待单层细胞长满后传代，继续用含灭稻瘟菌素S的完全培养基进行培养筛选

(7)约2周后，收集存活细胞，用流式对GFP⁺细胞进行分选纯化；

(8)继续筛选数代，直至获得稳定携带有pLenti6.3-J2-EGFP慢病毒表达载体的细胞系，命名为293-J。

(9)我们筛选出了多株稳定表达gJ的293-J(包括293-J1，293-J2，293-J3)，取gJ表达效果最好的一株293-J3于2021年9月16日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为：CCTCC NO:C2021263，分类命名：人肾上皮细胞293-J，地址，中国武汉武汉大学。

按照上述方法，本发明同时获得了多株稳定表达gJ的CHO-J细胞系。取gJ表达效果最好的一株于2021年9月16日送到中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为：CCTCCNO:C2021264，分类命名：中国仓鼠卵巢细胞CHO-J，地址，中国武汉武汉大学。

实施例2：

HSV-2包膜糖蛋白gJ在提高分泌型OPD抗体在哺乳动物细胞中表达量的应用：

1)转染前20h将实施例1制备的293-J1，293-J2，293-J3和HEK293T(对照)分别细胞铺于六孔板中，1.0×10⁶细胞/孔。

2)取5μL脂质体稀释在250μL OPTI-MEM中，室温静置5min。

3)将表达分泌型OPD抗体的质粒pcDNA3.4-OPD(该载体是将OPD抗体基因序列：SEQID NO.4所示核苷酸序列)插入到pcDNA3.4-TOPO的XbaI和AgeI两个酶切位点之间)2ug稀释在250μl OPTI-MEM中。

4)将稀释后的质粒加入脂质体中，轻轻混匀，室温静置20min。

5)将脂质体-质粒混合液缓慢加入6孔板中，轻晃培养板摇匀，37℃培养48h。

6)收集培养上清，0.45μM滤器过滤，收集的细胞用细胞裂解液裂解。

7)WB检测上清中的抗体和细胞裂解液中的内参actin，抗体和内参蛋白的显色条带如图1所示。

8)利用Image J软件对抗体的条带进行灰度分析，通过比较灰度值来确定抗体的产量高低。

获得的几个稳定表达gJ的细胞系(293-J1、293-J2、293-J3)分泌OPD抗体的量分别是原始细胞株293T的3.4、10.4和12.6倍，其中gJ表达量最高的293-J细胞系(CCTCC NO:C2021263)，分泌的OPD抗体的量最高。

9)用protein A的纯化柱纯化，最终每个样品浓缩成0.5ml。

10)CBA试剂盒测定获得的分泌型抗体的蛋白浓度。

WB结果和CBA测定出的蛋白浓度结果显示实施例1获得的几个稳定表达gJ的细胞系(293-J1、293-J2、293-J3)分泌的OPD抗体的量均高于原始细胞株293T，其中gJ表达量最高的293-J3，分泌的OPD抗体的量最高。

CHO-J细胞系的操作同上：

实施例1获得的多株CHO-J细胞系分泌的OPD抗体的量，均高于CHO原始细胞株，其中gJ表达量最高的CHO-J细胞系(CCTCC NO:C2021264)，分泌的OPD抗体的量最高。

实施例3：

HSV-2包膜糖蛋白gJ在提高分泌型SFTSV纳米抗体在哺乳动物细胞中表达量的应用：

1)转染前20h将293-J1、293-J3和HEK293T细胞分别铺于六孔板中，1.0×10⁶细胞/孔。

2)取5μL脂质体稀释在250μL OPTI-MEM中，室温静置5min。

3)将表达分泌型SFTSV纳米抗体的质粒SNB02(Xinlin Wu etal,A single-domainantibod y inhibits SFTSV and mitigates virus-induced pathogenesis in vivo.JCIInsight.2020Jul 9；5(13):e136855.)2ug稀释在250μl OPTI-MEM中。

4)将稀释后的质粒加入脂质体中，轻轻混匀，室温静置20min。

5)将脂质体-质粒混合液缓慢加入6孔板中，轻晃培养板摇匀，37℃培养48h。

6)收集培养上清，0.45μM滤器过滤，收集的细胞用细胞裂解液裂解。

7)WB检测上清中的抗体和细胞裂解液中的内参actin，抗体和内参蛋白的显色条带如图2所示。

8)利用Image J软件对抗体的条带进行灰度分析，通过比较灰度值来确定抗体的产量高低。实施例1获得的稳定表达gJ的细胞系(293-J1和293-J3)分泌的SFTSV纳米抗体的量均高于原始细胞株293T，293-J1分泌SFTSV纳米抗体的量是原始细胞株293T的1.8倍，而293-J3分泌SFTSV纳米抗体的量是原始细胞株293T的3.5倍，其中gJ表达量最高的293-J3，分泌的SFTSV纳米抗体的量最高。

CHO-J细胞系表达SFTSV纳米抗体的操作同上：

实施例1获得的多株CHO-J细胞系中SFTSV纳米抗体的表达均高于CHO原始细胞株，其中gJ表达量最高的CHO-J细胞系(CCTCC NO:C2021264)，分泌的SFTSV纳米抗体的量最高。

实施例4：

HSV-2包膜糖蛋白gJ在提高胞内表达的外源蛋白(HSV-2的极早期蛋白US1)在哺乳动物细胞中表达量的应用：

1)转染前20h将293-J3和HEK293T细胞分别铺于六孔板中，1.0×10⁶细胞/孔。

2)取5μL脂质体稀释在250μL OPTI-MEM中，室温静置5min。

3)将表达HSV-2极早期蛋白US1的质粒US1-Flag(Mudan Zhang etal,HSV-2Immediate-Early Protein US1 Inhibits IFN-βProduction by SuppressingAssociation of IRF-3with IFN-βPromoter.J Immunol.2015Apr 1；194(7):3102-15.)2ug稀释在250μl OPTI-MEM中。

4)将稀释后的质粒加入脂质体中，轻轻混匀，室温静置20min。

5)将脂质体-质粒混合液缓慢加入6孔板中，轻晃培养板摇匀，37℃培养48h。

6)收集细胞并用细胞裂解液裂解。

7)WB检测细胞裂解液中的US1-flag和内参actin，US1-flag和内参蛋白的显色条带如图3所示。

8)利用Image J软件对抗体的条带进行灰度分析，通过比较灰度值来确定抗体的产量高低。实施例1获得的稳定表达gJ的细胞系(293-J3)表达US1-flag的量是原始细胞株293T的6.4倍。

CHO-J细胞系表达US1-flag的操作同上：

实施例1获得的多株CHO-J细胞系中US1-flag的表达均高于CHO原始细胞株，其中gJ表达量最高的CHO-J细胞系(CCTCC NO:C2021264)，表达的US1-flag的量最高。

实施例5：

HSV-2包膜糖蛋白gJ在提高HIV-1病毒产量中的应用：

1)转染前20h将293-J1，293-J2，293-J3和HEK293T(分别对应图4中的293T-1，293T-2，293T-3)细胞分别铺于六孔板中，1.0×10⁶细胞/孔。

2)取8μL脂质体稀释在250μL OPTI-MEM中，室温静置5min。

3)将表达HIV-1包膜蛋白Env的质粒(pcDNA3.1-Env，QH 0648#1，Qin-xue Huetal，Identification of ENV Determinants in V3 that Influence the MolecularAnatomy of CCR5Utilization.J.Mol.Biol.(2000)302,359±375)和不含包膜蛋白的框架质粒(pNL4-3.Luc.R^-E^-，Connor,R.I.etal.Vpr is required forcient replicationof humanciency virus type-1in mononuclear phagocytes.Virology,1995,206,935-944)(2:3质量比，共5ug)稀释在250μl OPTI-MEM中。

4)将稀释后的质粒加入脂质体中，轻轻混匀，室温静置20min。

5)将脂质体-质粒混合液缓慢加入6孔板中，轻晃培养板摇匀，37℃培养72h。

6)收集培养上清，0.45μM滤器过滤。

7)将p24ELISA试剂盒中的96孔板取出，按试剂盒说明书步骤操作。

8)OD₄₅₀读板，以OD₆₅₀做参比。

9)绘制标准曲线，计算样品中p24浓度，比较不同细胞株包装生产病毒的能力差异。

如图4所示，实施例1获得的几个稳定表达gJ的细胞系(293-J1、293-J2、293-J3)包装出的HIV-1病毒量均高于原始细胞株293T。

序列表

<110> 中国科学院武汉病毒研究所

<120> HSV-2包膜糖蛋白gJ在提高外源基因在哺乳动物细胞中表达量的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 279

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggatcggt atgccgttcg gacctggggg attgtgggaa tcctcgggtg tgctgctgtt 60

ggggccgcac ccaccggccc cgcgtccgat acaacaaacg cgaccgcacg cctccccacg 120

caccccccac tcatccgttc cgggggcttt gccgtccccc tcatcgtggg ggggctgtgt 180

ctcatgattc tggggatggc gtgtctactc gaggtcctgc gtcgcctggg tcgcgagttg 240

gcgaggtgct gcccccacgc gggccaattt gccccatga 279

<210> 2

<211> 1562

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt ttatcgataa gcttgggagt tccgcgttac 60

ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 120

aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 180

ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 240

gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 300

cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 360

gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc 420

aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt 480

tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 540

ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc 600

acgctgtttt gacctccata gaagacaccg actctagagg atccatggat cggtatgccg 660

ttcggacctg ggggattgtg ggaatcctcg ggtgtgctgc tgttggggcc gcacccaccg 720

gccccgcgtc cgatacaaca aacgcgaccg cacgcctccc cacgcacccc ccactcatcc 780

gttccggggg ctttgccgtc cccctcatcg tgggggggct gtgtctcatg attctgggga 840

tggcgtgtct actcgaggtc ctgcgtcgcc tgggtcgcga gttggcgagg tgctgccccc 900

atgcgggcca atttgcccca tgagtttaaa cttatctcga ggctcctctc cctccccccc 960

ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt 1020

attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt 1080

cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa 1140

tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac 1200

cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg 1260

tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt 1320

tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca 1380

gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tacacatgct ttacatgtgt 1440

ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg 1500

aaaaacacga tgataatatg gccacaacca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg 1560

gg 1562

<210> 3

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Asp Arg Tyr Ala Val Arg Thr Trp Gly Ile Val Gly Ile Leu Gly

1 5 10 15

Cys Ala Ala Val Gly Ala Ala Pro Thr Gly Pro Ala Ser Asp Thr Thr

20 25 30

Asn Ala Thr Ala Arg Leu Pro Thr His Pro Pro Leu Ile Arg Ser Gly

35 40 45

Gly Phe Ala Val Pro Leu Ile Val Gly Gly Leu Cys Leu Met Ile Leu

50 55 60

Gly Met Ala Cys Leu Leu Glu Val Leu Arg Arg Leu Gly Arg Glu Leu

65 70 75 80

Ala Arg Cys Cys Pro His Ala Gly Gln Phe Ala Pro

85 90

<210> 4

<211> 1524

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggacgcca tgctgcgcgg actgtgctgc gtgctgctac tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60

agccccagcc aggagatcca cgcccgattc aggagaggag ccagaggagg atccgagatc 120

gtgctgaccc agtcccccgc tacactgtcc ctgtcccctg gagagagggc caccctgtcc 180

tgcagggcta gccagagcgt gtcctcctac ctggcctggt atcagcagaa gcccggccaa 240

gctcccaggc tgctgatcta cgacgcctcc aacagggcca caggcatccc tgccaggttc 300

tccggttctg gttctggcac cgacttcacc ctgaccatct cctccctgga gcccgaggac 360

ttcgccgtgt actactgcca gcagtcctcc aactggccca ggaccttcgg ccagggcacc 420

aaggtggaga tcaagagggg cggcggcggc tctggaggag gaggaagcgg aggaggagga 480

tcccaggtgc agctggtgga gtccggagga ggcgtggtgc aacctggcag gtccctgagg 540

ctggactgca aggcctccgg catcaccttc tccaacagcg gcatgcactg ggtgaggcag 600

gctcctggaa agggcctgga gtgggtggcc gtgatctggt acgacggctc caagaggtac 660

tacgccgact ccgtgaaggg caggttcacc atctccaggg acaactccaa gaacaccctg 720

ttcctgcaga tgaactccct gagggccgag gacaccgccg tgtactactg cgccaccaac 780

gacgactact ggggacaggg caccctggtg accgtgtcct ccgcttccac caaggagagc 840

aagtatggac caccttgccc accatgtcct gcaccagagt ttctgggcgg cccatccgtg 900

ttcctgtttc ctccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc agaggtgaca 960

tgcgtggtgg tggacgtgtc tcaggaggat cccgaggtgc agttcaactg gtacgtggat 1020

ggcgtggagg tgcacaatgc caagacaaag ccaagggagg agcagtttaa ttccacctac 1080

cgcgtggtgt ctgtgctgac agtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtataag 1140

tgcaaggtga gcaataaggg cctgcccagc tccatcgaga agaccatctc caaggcaaag 1200

ggacagccca gggagcctca ggtgtacaca ctgcccccta gccaggagga gatgaccaag 1260

aaccaggtgt ccctgacatg tctggtgaag ggcttctatc cctccgacat cgccgtggag 1320

tgggagtcta atggccagcc tgagaacaat tacaagacca caccacccgt gctggactcc 1380

gatggctctt tctttctgta tagccggctg accgtggata agtccagatg gcaggagggc 1440

aacgtgtttt cttgcagcgt gatgcacgaa gcactgcaca atcactacac tcagaagtcc 1500

ctgtccctgt ccctgggcaa atga 1524

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcggatcca tggatcggta tgcc 24

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccgtttaaa ctcatggggc aaattg 26

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcggatcca tggatcggta tgcc 24

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gccgtttaaa ctcatggggc aaattg 26