一种绿色荧光蛋白及猪cdx2的猪肠上皮细胞系构建方法
阅读说明：本技术 一种绿色荧光蛋白及猪cdx2的猪肠上皮细胞系构建方法 (Green fluorescent protein and porcine intestinal epithelial cell line construction method of porcine CDX2 ) 是由 翟振亚 牛凯敏 吴信 刘建平 蔡力创 涂越 王汝霞 蒋泽根 欧阳克氙 刘会平 郭 于 2021-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种绿色荧光蛋白及猪CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法,其包括以下步骤：制备目的DNA片段和载体片段；将制备的目的DNA片段与载体片段连接,并导入HD5α感受态细胞,扩繁并提取质粒；将提取的质粒用慢病毒质粒包被,进行病毒扩繁、IPEC-J2细胞的转染、筛选和构建成功验证。与现有技术相比,目前尚无CDX2和GFP同时高效、稳定表达的正常肠上皮细胞系,阻碍了CDX2在肠道发育和胃肠道疾病中的作用机制研究,本发明的提出,填补了相应的空白,构建了性质和活力更好的IPEC-J2为模型构建细胞系,提高了转染效率,表达绿色荧光蛋白GFP,可以在转染过程中对转染效率进行评估,提高了试验效率。(The invention discloses a green fluorescent protein and a method for constructing a porcine intestinal epithelial cell line of a porcine CDX2, which comprises the following steps: preparing a target DNA fragment and a carrier fragment; connecting the prepared target DNA fragment with a vector fragment, introducing the target DNA fragment into HD5 alpha competent cells, and performing propagation and plasmid extraction; and coating the extracted plasmid with a lentivirus plasmid, and performing virus propagation, IPEC-J2 cell transfection, screening and construction success verification. Compared with the prior art, no normal intestinal epithelial cell line which simultaneously expresses CDX2 and GFP efficiently and stably exists at present, so that the research on the action mechanism of CDX2 in intestinal development and gastrointestinal diseases is hindered, the invention provides the method for constructing the cell line by using IPEC-J2 with better property and activity as a model, the transfection efficiency is improved, the green fluorescent protein GFP is expressed, the transfection efficiency can be evaluated in the transfection process, and the test efficiency is improved.)
技术领域
本发明涉及猪IPEC-J2细胞系的构建技术领域，尤其涉及一种绿色荧光蛋白及猪CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法。
背景技术
胃肠道癌症是世界范围内的常见病，多发病。CDX2是哺乳动物小肠发育的最关键转录因子，主要负责调控肠道细胞的增殖和分化，从而调控人和动物肠道的正常发育。在病理条件下，CDX2作为一种胃癌和大肠癌的标志基因，是治疗相关癌症的重要靶点，由于人类样本涉及伦理道德约束及病人意愿、生活环境等差异，存在背景条件和采样困难等问题。目前研究人员对于CDX2在胃肠道癌症中的作用及发病机制还知之甚少。因此，建立合适的模型对于研究胃肠道癌症的发病进程、治疗及药物筛选至关重要。
猪被认为是与人类模型最接近的动物模型之一，其消化道结构与人类相似，因此学界常以猪为研究对象，探究人类的发病机理。目前，猪来源的细胞系有IPEC-J2和IPEC-1等，这些细胞系通常不表达或仅表达较少量的 CDX2，且表达量不稳定。因此，需要建立一种正常细胞来源的、稳定表达 CDX2蛋白的细胞系，用以研究CDX2蛋白在肠道癌症中的作用，并为研究靶向药物提供模型。
但是，现有技术中以IPEC-1细胞系为对象，pcDNA3.1质粒系统为基础，使用脂质体转染试剂(Lipofectamine 2000)构建的IPEC-1细胞系。IPEC-1 该系统的不足和缺陷在于：该系统转染效率较低，需要经过长时间G418试剂的筛选(约21天)；理论上导入细胞的质粒大部分并未直接整合进入细胞的基因组，因此在传代5代及更高的细胞代次时，可能出现目的基因表达降低甚至丢失等现象；此外，pcDNA3.1质粒系统不带有荧光蛋白等标记，无法在转染过程中对于转染效率进行直观判断，在获得细胞系后，也无法对目的蛋白表达情况进行简单有效的判断和鉴定。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种绿色荧光蛋白及猪 CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法，以解决现有细胞系转染效率低，传代表达降低甚至丢失的技术问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的实施例提供了一种绿色荧光蛋白及猪CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法，其包括以下步骤：
制备目的DNA片段和载体片段，所述目的DNA片段包含CDX2蛋白；
将制备的目的DNA片段与载体片段连接，并导入HD5α感受态细胞，扩繁并提取质粒；
将提取的质粒用慢病毒质粒包被，进行病毒扩繁。
其中，所述制备目的DNA片段和载体片段中，采用EcoR I和BamH I 双酶切质粒制备目的DAN片段和载体片段，其中，所述目的DNA片段包括 pUC57-pig CDX2、EcoR I、BamHI，所述载体片段包括 pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro、EcoR I、BamH I。
其中，所述目的DNA片段与载体片段连接步骤中还包括：将目的DNA 片段和载体片段回收纯化，连接后的连接产物包括： pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro、pig CDX2；其中，所述pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro为回收纯化后的载体，所述pig CDX2为回收纯化后的目的DNA片段。
其中，所述导入HD5α感受态细胞包括以下步骤：
将连接产物导入HD5α感受态细胞；
将导入HD5α感受态细胞的连接产物涂布于LB AMP平板；
将涂布后的LB AMP平板放入37℃温箱培养；
从HD5α感受态细胞中大规模提取质粒。
其中，所述将提取的质粒用慢病毒包被，进行病毒扩繁包括以下步骤：
将从HD5α感受态细胞中提取得到的质粒转染于HEK283细胞；
间隔12H收集含有病毒的培养液，采用70000g超速离心收集病毒颗粒。
其中，所述收集病毒颗粒包括以下步骤：
将细胞从液氮中取出，快速放入37℃水浴锅中，轻摇冻存管使冻存液解冻；
把解冻后的细胞转移到含有培养基的离心管中，离心收集细胞，室温 1200rpm离心3min，弃上清；
用完全培养基悬浮细胞，接种到培养皿中，轻轻吹打混匀，37℃5％CO2 饱和湿度条件下培养；
将病毒上清液与IPEC-J2细胞共同培养。
其中，所述将提取的质粒用慢病毒质粒包被，进行病毒扩繁步骤还包括细胞传代的步骤，所述细胞传代包括：
用0.25％胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞；
用PBS将细胞润洗2次，每次清洗转速为1200rpm，时长为3min；
加入完全培养基，吹打细胞，制成单细胞悬液，按1:3的比例传代，37℃、5％CO2饱和湿度条件下扩大培养。
其中，所述细胞传代步骤之后还包括细胞筛选步骤，所述细胞筛选步骤包括：
病毒感染48h后，更换含20μg/m puromycin的培养基；
每2-3天更换新鲜含puromycin的培养基，以替换含大量死细胞的培养基，直到抗性群落能被识别出；
待抗性细胞长满以后，传代、扩大培养、鉴定及冻存。
其中，所述待抗性细胞长满以后，传代、扩大培养、鉴定及冻存步骤后还包括：待细胞稳转后，继续加入puromycin培养基进行维持的步骤。
其中，所述制备目的DNA片段和载体片段和将制备的目的DNA片段与载体片段连接，并导入HD5α感受态细胞，扩繁并提取质粒的步骤中均包括进行电泳验证的步骤。
与现有技术相比，目前尚无CDX2和GFP同时高效、稳定表达的正常肠上皮细胞系，阻碍了CDX2在肠道发育和胃肠道疾病中的作用机制研究，本发明的提出，填补了相应的空白，构建了性质和活力更好的IPEC-J2为模型构建细胞系，提高了转染效率，表达绿色荧光蛋白GFP，可以在转染过程中对转染效率进行评估，提高了试验效率。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明技术手段，可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征及优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，详细说明如下。
附图说明
图1为本发明实施例的绿色荧光蛋白及猪CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法的流程图。
图2为本发明实施例的绿色荧光蛋白及猪CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法的载体结构图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所述的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行结合和组合。
请参阅图1，本实施例公开了一种绿色荧光蛋白及猪CDX2的猪肠上皮细胞系构建方法，其包括：
步骤S100、制备目的DNA片段和载体片段，并利用凝胶电泳进行验证，其中所述目的DNA片段包含CDX2蛋白；
制备目的DNA片段和载体片段中，采用EcoR I和BamH I双酶切质粒制备目的DAN片段和载体片段，其中，所述目的DNA片段包括pUC57-pig CDX2、EcoR I、BamH I，反应试剂为10×Buffer K和ddH2O，所述载体片段包括pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro、EcoR I、BamH I，反应试剂为10 ×Buffer K和ddH2O；其中，酶切体系如下：
步骤S200、将制备的目的DNA片段(CDX2)与载体片段连接，并导入 HD5α感受态细胞，扩繁并提取质粒，进行电泳验证；
具体的，将回收纯化的目的片段pig CDX2(EcoRI/BamHI)与回收纯化的载体pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro(EcoRI/BamHI)连接，连接产物命名为pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro-pig CDX2。连接体系如下：
步骤S300、提取质粒并用慢病毒包被后，进行病毒扩繁。也即包括，将导入HD5α感受态细胞的质粒转染于HEK283细胞；间隔12H收集含有病毒的培养液，采用70000g超速离心收集病毒颗粒。
所述步骤S300包括以下步骤：
(1)连接产物的转化：
将连接产物导入HD5α感受态细胞；
将导入HD5α感受态细胞的连接产物涂布于LB AMP平板；
将涂布后的LB AMP平板放入37℃温箱培养以获得感染细胞；
从HD5α感受态细胞中大规模提取质粒。
(2)重组子筛选：
挑取单个菌落，接种于LB AMP液体培养基中，37℃250rpm培养过夜。培养好的菌液做菌落PCR鉴定。设计引物，上游引物选取载体上面的序列，下游引物选取目的基因上面的序列PCR条带大约1516bp
引物：CMV-F:CGCTAATGGGCGGTAGGCGT
PLVX-R:TTGGCTGCCCTTTCACTTCC
反应条件：
94℃10min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min30sec，30cycles；72℃ 10min，4℃4min
反应体系：
载体结构图如附图2所示。
(3)细胞复苏及培养：
将细胞从液氮中取出，快速放入37℃水浴锅中，轻摇冻存管使冻存液解冻；
把解冻后的细胞转移到含有5mL培养基的离心管中，离心收集细胞，室温 1200rpm离心3min，弃上清；
用完全培养基(含10％FBS+1％双抗)悬浮细胞，接种到培养皿中，轻轻吹打混匀，37℃5％CO2饱和湿度条件下培养；
将病毒上清液与IPEC-J2细胞共同培养。
细胞培养基IPEC-J2(DMEM+10％FBS+1％Penicillin-Streptomycin Solution)
(4)细胞传代：细胞的密度达到80％时，对细胞进行传代，
用0.25％胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞；
用PBS将细胞润洗2次，1200rpm，3min；
加入完全培养基，吹打细胞，制成单细胞悬液，按1:3的比例传代，37℃、 5％CO2饱和湿度条件下扩大培养。
(5)慢病毒感染：
病毒感染前一天将IPEC-J2细胞接种于24孔细胞培养板，感染当日细胞汇合度达到30～60％；
每孔加入10ul CDX2表达慢病毒(GFP)病毒液，37℃培养箱中培养24h后更换新鲜培养基；
感染48h后可检测到GFP的表达。
(6)细胞筛选步骤包括：
病毒感染48h后，更换含20μg/m puromycin的培养基；
每2-3天更换新鲜含puromycin的培养基，以替换含大量死细胞的培养基。
直到抗性群落能被识别出；
待抗性细胞长满以后，传代，扩大培养，鉴定、冻存。
CDX2-GFP稳转后，后续培养加入Puro进行维持。
在得到上述细胞株后，利用染色质免疫印迹法进行CDX2表达量验证，结果表明，相对于未转染的细胞，转染后的细胞CDX2蛋白表达量为原来的3倍以上，且稳定表达GFP。相对于未转染细胞，表达量得到大幅提高。可用于后续药物筛选及科学研究。
本实施的绿色荧光蛋白和CDX2蛋白的IPEC-GFP-CDX2细胞系构建方法利用pLVX-mCMV-ZsGreen-PGK-Puro质粒系统为基础，慢病毒转染的绿色荧光蛋白(Greenfluorescent protein，GFP)-CDX2共表达的IPEC-J2 细胞系。利用慢病毒的生物学特性，可以直接将目的基因导入宿主的基因组，将稳定表达和药物筛选的时间缩短(3天左右)，因此提高了转染效率，减少了药物对细胞的伤害。
传统的pcDNA3.1质粒没有荧光蛋白表达，因此难以对转染效率和时间和基因表达丢失情况进行直观判断，仅能通过后续蛋白免疫印迹或者荧光定量PCR等方法进行验证，步骤较多且繁琐。为了克服这个缺点，本发明在过表达CDX2的同时，同时表达绿色荧光蛋白GFP，可以在转染过程中对转染效率进行评估，提高了试验效率。
上述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。本发明的保护范围以权利要求书为准。
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