基于慢病毒的猪spp1基因载体及其构建和应用
阅读说明：本技术 基于慢病毒的猪spp1基因载体及其构建和应用 (Porcine SPP1 gene vector based on lentivirus and construction and application thereof ) 是由 王新霞 黄超群 刘有华 汪以真 于 2021-09-11 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种基于慢病毒的猪SPP1基因载体及其构建和应用,属于生物和现代农业技术领域的应用技术。重组慢病毒的猪SPP1基因载体包括含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列；原核复制子pUC Ori序列；病毒复制子SV40 ori序列；用于增强基因表达效率的WPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件；嘌呤霉素抗性基因Puro序列；T2A“自我剪切”肽序列；荧光蛋白表达标签CopGFP序列；慢病毒包装顺式元件cis；人巨细胞病毒CMV启动子；猪SPP1基因序列,所述慢病毒包装顺式元件cis采用第三代慢病毒载体。上述载体能够直接感染真核细胞,从而实现猪SPP1基因在真核细胞中共表达的目的,为进一步研究猪SPP1基因的功能奠定基础。(The invention provides a porcine SPP1 gene vector based on lentivirus and construction and application thereof, belonging to the application technology in the technical field of biology and modern agriculture. The porcine SPP1 gene vector of the recombinant lentivirus comprises an ampR sequence of an ampicillin-containing resistance gene; a prokaryotic replicon pUC Ori sequence; the viral replicon SV40 ori sequence; the WPRE enhanced woodchuck hepatitis B virus post-transcriptional regulatory element is used for enhancing gene expression efficiency; puromycin resistance gene Puro sequence; T2A "self-cleaving" peptide sequence; fluorescent protein expression tag CopGFP sequence; lentiviral packaging cis-elements cis; human cytomegalovirus CMV promoter; the porcine SPP1 gene sequence, and the lentiviral packaging cis-element cis adopts a third-generation lentiviral vector. The vector can directly infect eukaryotic cells, so that the aim of co-expression of the pig SPP1 gene in the eukaryotic cells is fulfilled, and a foundation is laid for further researching the function of the pig SPP1 gene.)
技术领域
本发明涉及一种基于慢病毒的猪SPP1基因载体及其构建和应用，属于生物和现代农业
技术领域
的应用技术。背景技术
1979年，人们首次在恶性上皮细胞中发现一种分泌蛋白，即分泌型磷酸蛋白1（Secreted phosphoprotein 1，SPP1），也被称为骨唾液蛋白1、骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）和早期1型T淋巴细胞激活蛋白（Eta-1）。SPP1主要以吸附在钙化基质的固定化蛋白和可溶性细胞因子两种形式存在，在多个物种的多种组织中表达，如人、牛、猪和鸡。SPP1具有多种生物学功能，它不仅能影响破骨细胞的运动和融合，调控雪旺细胞的增殖和凋亡，而且还可能在动物脂肪沉积中起着关键的调控作用。肥胖已经成为全球死亡率和慢性病发病率持续增高的重要因素之一，然而，目前却尚无有效的手段能够很好的治疗肥胖。猪在生理功能和生理结构等各方面与人类高度相似，这使得猪成为研究人类肥胖及其并发症的常见模式生物，越来越多的研究尝试以猪为模型以期开发出更有效的肥胖治疗方法。同时畜牧生产中，猪肌内脂肪含量与猪肉的风味、多汁性、嫩度等肉品质评定指标息息相关，因此研究猪在生长发育过程中的脂肪沉积机制对于促进畜牧业发展以及保障人类公共卫生健康具有重要意义。然而，目前调控家畜脂肪沉积和改善肉品质的分子机制仍知之甚少。分泌型磷酸蛋白1（Secreted phosphoprotein 1，SPP1）基因已被证明在多个物种中表达，能参与多种生理过程。已有研究表明，SPP1基因在多个猪种的脂肪组织中相对表达水平较高，以小鼠为模型的研究表明，SPP1的表达水平与小鼠的体重和脂肪量的变化密切相关，但是目前，针对SPP1基因在猪脂肪组织中的功能研究甚少。
猪SPP1基因（Sus scrofa secreted phosphoprotein 1，SPP1)，全长cDNA序列1430bp，GenBank登录号NM_214023，编码区912 bp，编码303个氨基酸，蛋白分子量33，669Da。
慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1（人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体，可以将外源基因有效的整合到宿主染色体上，具有感染谱广泛，可以有效感染分裂期和静止期细胞，感染效率高等优点，感染效率可达传统质粒转染方法的数倍，因此成为导入外源基因的有力工具。在体外实验和体内实验的研究中，慢病毒正在获得越来越广泛的应用。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于慢病毒的猪SPP1基因载体及其构建和应用。
为了解决上述问题，技术方案如下：
一种基于慢病毒的猪SPP1基因载体，包括按照以下顺序组装的序列：
猪SPP1基因序列如SEQ ID NO.14所述；
用于起始慢病毒mRNA转录的EF-1α启动子，如SEQ ID NO.9所示；
用作荧光蛋白表达标签的CopGFP序列，如SEQ ID NO.7所示；
用于连接同时转录表达蛋白质的T2A“自我剪切”肽序列；如SEQ ID NO.6所示；
用于真核细胞筛选的嘌呤霉素抗性基因Puro序列，如SEQ ID NO.5所示；
用于增强基因的表达效率的WPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，如SEQID NO.4所示；
用于慢病毒包装的慢病毒3’terminal truncated LTR序列，如SEQ ID NO.11所示；
用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40 ori序列，如SEQ ID NO.3所示；
用以控制质粒复制的原核复制子pUC Ori序列，如SEQ ID NO.2所示；
含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列，如SEQ ID NO.1所示；
用于慢病毒包装的慢病毒5’terminal truncated LTR序列，如SEQ ID NO.10所示；
用于慢病毒包装的RRE顺式元件序列，如SEQ ID NO.12所示；
用于慢病毒包装的cPPT顺式元件序列，如SEQ ID NO.13所示；
用于起始猪SPP1基因的真核转录的人CMV启动子，如SEQ ID NO.8所示；
其中，慢病毒包装顺式元件，包括：如SEQ ID NO.10所示的慢病毒5’terminaltruncated LTR、如SEQ ID NO.11所示的慢病毒3’terminal truncated LTR、如SEQ IDNO.12所示的RRE顺式元件、如SEQ ID NO.13所示的cPPT顺式元件。
一种所述的猪SPP1基因载体的构建方法，包括以下步骤：
（一）将含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、病毒复制子SV40 ori序列、用于增强基因的表达效率的WPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件、嘌呤霉素抗性基因Puro序列、T2A“自我剪切”肽序列、荧光蛋白表达标签的CopGFP序列、用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件cis、人巨细胞病毒CMV启动子、用于起始慢病毒mRNA转录的EF-1α启动子克隆到慢病毒骨架质粒上；
(二) 将猪SPP1基因经过重组反应克隆至慢病毒骨架质粒上，得到表达猪SPP1基因的重组慢病毒质粒。
一种所述的猪SPP1基因载体的应用，将猪SPP1基因载体转染猪的前体脂肪细胞，用于研究猪SPP1基因的生物学功能。
本发明所采用的载体骨架为第三代慢病毒载体，包括来自人巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）的启动子来起始猪SPP1基因的转录；插入来自HIV-1的截断5’长重复序列（HIV-1 truncated 5’LTR）来介导病毒包装和病毒基因组的反转录及病毒包装信号HIV-1 psi(ψ)；载体还插入了HIV-1 Rev response element(RRE)，该元件允许Rev辅助的未剪接病毒mRNA出核；增加了来自HIV-1整合酶基因的cPPT和来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件WPRE元件，提高了转导效率和基因的表达效率以及病毒滴度；用于荧光蛋白表达标签的CopGFP序列与puromycin抗性基因编码序列经T2A翻译后切割位点串联，在来源于人类靶向延长因子1α基因的EF-1α启动子的控制下表达。表达的串联蛋白会剪接分割为绿色荧光蛋白（CopGFP）和puromycin抗性蛋白，分别发挥生物活性。
本发明所述猪SPP1基因载体中包括：猪SPP1基因的CDS（Coding sequence）编码区。
本发明的有益效果：
1.本发明所采用的基因载体是基于HIV1的慢病毒基因过表达载体。采用来源于人巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）的启动子来启动目的基因的表达，人巨细胞病毒启动子可在多数种类细胞中稳定表达。采用来源于人类靶向延长因子1α基因的EF-1α启动子驱动表达CopGFP基因和Puromycin抗性基因，从而可以使用Puromycin筛选出稳定过表达目的基因的细胞，CopGFP基因有助于判断病毒包装效率以及感染效率，同时有利于稳定细胞的筛选。
2.本发明所采用的基因载体为高拷贝质粒，载体整体结构紧凑，同时包含了生产慢病毒所必须的病毒元件以及提高病毒滴度及基因表达效率的元件，产生高滴度复制缺陷的慢病毒颗粒可以直接用于感染细胞或者纯化浓缩后感染细胞。
3.本发明构建了基于慢病毒的猪SPP1基因载体，从而为更好的研究猪SPP1基因在脂肪沉积中的作用打下坚实的基础。
附图说明
图1是本发明实施例1中重组慢病毒骨架质PCDH-CMV-MCS-EF1A-CopGFP-Puro的载体结构示意图。
图2是本发明实施例1中含有猪SPP1基因的重组慢病毒质粒PCDH-CMV-SPP1-EF1A-CopGFP-Puro的载体结构示意图。
图3是本发明实施例1中PCR（polymerase chain reaction）扩增猪SPP1 基因后，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的电泳图。
图4是本发明实施例1中慢病毒重组质粒PCDH-CMV-SPP1-EF1A-CopGFP-Puro转染猪脂肪前体细胞后，于倒置荧光相差显微镜40倍物镜下拍摄的绿色荧光蛋白的荧光。
图5是本发明实施例1中慢病毒重组质粒PCDH-CMV-SPP1-EF1A-CopGFP-Puro及慢病毒骨架质粒PCDH分别转染猪脂肪前体细胞后SPP1表达的WB检测情况。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步的阐述。
以下实施例仅用于说明和解释本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
重组慢病毒质粒PCDH-CMV-SPP1-EF1A-CopGFP-Puro的构建
步骤一：猪的原代前体脂肪细胞的分离和培养：
采用来自浙江科强生态养殖有限公司健康的3日龄杜长大三元杂交仔猪，无菌状态下取仔猪颈部、肩胛及背部皮下脂肪组织，用含1％Pen-Srep的PBS缓冲液漂洗2-3次，用眼科剪和镊子尽量去除肉眼可见的血管和其他结缔组织，然后在无菌环境下将脂肪组织充分剪碎，剪切至1mm3左右，随后加入适量体积的0.1％的Ⅰ型胶原酶消化液，在37℃恒温摇床中震荡消化组织，期间每隔10min吹打一次，使其分散。消化结束后，用等体积完全培养液中和消化液，当组织块分散成絮状后，依次用150目和200目的滤网过滤去除杂质和未消化的组织，收集过滤液，于离心机中1，500r/min转速下离心10min，弃去上清，加入完全培养基，吹打均匀，制成细胞悬液，以适宜密度接种至10cm细胞培养皿中，置于37℃，饱和湿度，5％CO2的培养箱中培养，24h后换液，以去除未贴壁的细胞。
步骤二：采用Trizol法提取猪前体脂肪细胞总RNA
（一）将步骤一中得到的密度在60-80％的猪前体脂肪细胞弃去培养基，PBS缓冲液清洗脂肪细胞两遍，每10cm细胞培养皿加入1ml胰蛋白酶消化细胞30-60sec后，加入2ml含1％Pen-Srep和10％FBS的完全培养基终止消化，随后转移至5ml离心管中，于离心机中1，000r/min离心5min。
（二）经（一）离心后弃去离心管中上清，加入1ml PBS缓冲液轻柔吹打洗涤细胞后转移至1.5ml EP管中，于离心机中1，000r/min离心5min。
（三）经（二）离心后弃去1.5ml EP管中上清，加入1-2ml Trizol试剂后用移液枪反复吹打使其混匀，并将EP管转移至冰上以防止从细胞中提取的总RNA在常温下分解。
（四）将氯仿加入（三）中1.5ml EP管内，使得Trizol试剂与氯仿的体积比为5:1，猛烈晃动15sec或vortex混匀，室温放置2-3min。
（五）将通过（四）得到的含总RNA的溶液离心10min，离心时温度为4℃，离心速率为12，000r/min，离心后可见三个分层，上层无色水相为本发明提取的RNA，标记好新的1.5mlEP管，用移液枪将含总RNA的上层无色水相转移至新的EP管内，吸取时注意不能碰到中间层。
（六）向（五）中的EP管内加入与上层无色水相等体积的冰冷异丙醇，颠倒数次混匀后，-20℃下静置30min后在4℃，12，000r/min的条件下离心10min，离心完成后在管底可见白色胶冻样物质。
（七）经（六）离心后小心弃去EP管中上清，加入1ml 2-4℃的75％乙醇（DEPC水配制），温和混匀。在4℃，10，000r/min的条件下离心5min，小心吸尽上清后于EP管管底可见白色胶冻样物质，即为提取得到的RNA。打开EP管管盖，于室温下放置3-5min，待RNA略干后，加入20μL DEPC水以溶解RNA，注意避免RNA过分干燥。使用RNA浓度测定仪检测RNA的浓度，测出的A260/A280的比值在1.8-2.1之间。
步骤三：使用PCR扩增仪将细胞总RNA逆转录为cDNA
（一）采用Thermo Scientific公司的Thermo Scientific RevertAid RT试剂盒，实验操作按产品说明书进行。具体如下：将步骤二中所得到的猪前体脂肪细胞的RNA按照2ug的总量进行反转录，并利用DEPC水将2ug的RNA样品稀释至12ul，反应体系为下表1：
表1
试剂
体积（ul）
RevertAid 逆转录酶
1
5X 反应缓冲液
4
dNTP 混合物
2
RNA+DEPC水
12
随机引物
1
Total（ul/well）
20
将20ul反应体系放入PCR仪器中反转，仪器设置程序如下：25℃ 10min，42℃ 1h，70℃ 10min。反转结束后将得到的DNA样品置于-40℃保存。
（二）根据猪SPP1基因的CDS序列，设计PCR引物。采用武汉爱博泰克公司具有优良保真性的DNA聚合酶进行PCR反应，并依据说明书，将DNA模板总量控制在5ng，利用DEPC水将5ng的DNA模板稀释至11.5ul。总的PCR反应体系为下表2：
表2
试剂
体积（ul）
2X Master Mix
12.5
引物SPP1-PCDH-SwaI-F
0.5
引物SPP1-PCDH-SwaI-R
0.5
DNA模板+DEPC水
11.5
Total（ul/well）
25
猪SPP1基因的CDS全长序列如SEQ ID NO.14所示，PCR引物SPP1-PCDH-SwaI-F序列如SEQ ID NO.15所示，PCR引物SPP1-PCDH-SwaI-R序列如SEQ ID NO.16所示。
步骤四：将步骤三中所得到的PCR产物，经过2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，确认如图3所示的912bq的PCR产物，随后割胶回收置于Eppendorf管内，采用天根公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收相应的片段(步骤如表3），并测定产物的浓度和纯度, 测出的A260/A280的比值在1.8-1.88之间；
表3琼脂糖凝胶DNA回收步骤
步骤五：构建猪SPP1基因载体
（一）将含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、病毒复制子SV40 ori序列、用于增强基因的表达效率的WPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件、嘌呤霉素抗性基因Puro序列、T2A“自我剪切”肽序列、荧光蛋白表达标签的CopGFP序列、用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件cis、人巨细胞病毒CMV启动子存储于慢病毒骨架质粒上。
（二）使用SwaI限制性内切酶对PCDH-CMV-MCS-EF1A-CopGFP-Puro质粒进行酶切，回收对应的酶切产物，并通过同源重组方法，将通过PCR反应或琼脂糖凝胶回收得到的猪SPP1基因的PCR产物，克隆至慢病毒骨架质粒PCDH-CMV-MCS-EF1A-CopGFP-Puro上，（PCDH-CMV-MCS-EF1A-CopGFP-Puro大小是8201bq，载体序列见SEQ ID NO.17，载体图谱见附图1），得到表达猪SPP1基因的重组慢病毒质粒PCDH-CMV-SPP1-EF1A-CopGFP-Puro (载体图谱见附图2）。
步骤六：将刚从-80℃冰箱取出的含感受态细胞的离心管置于冰上，待刚刚解冻时加入步骤三得到的DNA溶液以连接（需注意连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的十分之一)，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min后，放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激40sec，快速将管转移到冰中，冷却2-3min，随后每管加900μl LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，震荡培养1h使细胞复苏。随后，将离心管置于10，000rpm下离心5min，吸取100μl上清重悬离心管底部的沉淀，将得到的转化菌液全部涂布于含有AmpR的LB琼脂平板上，倒置平皿，做好标记，于恒温培养箱中37℃培养24h后挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，阳性菌落扩增。
步骤七：对步骤六中得到的阳性菌落进行测序，测序引物CMV-F序列如SEQ IDNO.18所示，测序引物CMV-R序列如SEQ ID NO.19所示。测序准确的菌落即为含重组慢病毒质粒PCDH-CMV-SPP1-EF1A-CopGFP-Puro的菌落。
步骤八：采用诺唯赞公司质粒大提试剂盒提取PCDH-CMV-SPP1-EF1A-CopGFP-Puro质粒，并利用Invitrogen Lipofectamine 2000转染试剂将重组慢病毒质粒PCDH-CMV-SPP1-EF1A-CopGFP-Puro和慢病毒包装辅助质粒pMD2.G质粒以及慢病毒包装辅助质粒psPAX2共转染到293T细胞中（psPAX2和pMD2.G质量比例为PCDH：psPAX2：pMD2.G＝5ug:3ug:2ug），转染48h后收集细胞上清液，使用0.22um滤头过滤上清液除菌，随后按体积加入5×PEG8000溶液，每20-30min混合一次，共进行3-5次，4℃放置6h或4℃放置过夜后在4℃离心机中4000g离心20min。吸弃上清，静置管子1-2min，吸走残余液体。加入适量病毒溶解液溶解病毒沉淀并测量病毒滴度，将病毒液分成500ul每管，放入-20℃冰箱中冻存。
步骤九：将步骤一中得到的猪脂肪前体细胞以每孔50，000-70，000个细胞的数量接种到12孔板中，并吹打混匀，使细胞在孔板里分布均匀，防止中心聚集，放入37℃，5％的CO2培养箱。待细胞完全贴壁并且细胞密度在60％-80％之间时，将每孔培养基更换为500ul预热好的含15％FBS的无抗培养基，并加入等体积的病毒液，使得病毒液和培养基的体积比为1：1，随后向每个孔中加入polybrene试剂，使polybrene终浓度为2μg/ml。加入后前后或左右方向晃动孔板，使得孔板里的液体混匀，放入37℃，5％的CO2培养箱中培养。12孔板中六个孔同时转染上述病毒，记为处理组，相对应的设置六个阴性对照组。
步骤十：分别在转染后18h、36h和54h各更换一次培养基，培养基为含15％胎牛血清和1％Pen-Srep的有抗培养基。转染后48h，利用倒置荧光相差显微镜，40倍镜下观察处理组细胞中绿色荧光蛋白表达情况，结果见附图4。
步骤十一：转染后72h，吸弃培养基，向每个孔中加入500ul的PBS缓冲液，清洗细胞，吸弃缓冲液，重复二次，第三次加入PSB缓冲液后，用刮板收集各孔细胞，做好标记，进行转染效率的检验。利用RIPA裂解液（已加入Roche的蛋白酶抑制剂）提取收集得到的各孔细胞的蛋白样品，进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转膜，用杭州华安生物公司的SPP1抗体4℃孵育过夜，然后用辣根过氧酶标记的山羊抗兔的二抗室温下孵育2h，最后在膜上加入化学发光液进行显色，结果用SPP1抗体能检测到SPP1蛋白分子的表达，检测结果见附图5。
上述实施例仅是对本发明的说明，不是对本发明的限定，应当指出，对于本技术领域的普通技术工人来说，在不脱离本发明原理的前提下，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 基于慢病毒的猪SPP1基因载体及其构建和应用
<141> 2021-09-11
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 60
agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 120
cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 180
ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 240
gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 300
cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 360
cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 420
ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 480
catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 540
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cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 780
cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 840
acggaaatgt tgaatactca t 861
<210> 2
<211> 589
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 120
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 180
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcttttttg gaggcc 136
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ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
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<210> 6
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54
<210> 7
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccgccatgg agatcgagtg ccgcatcacc ggcaccctga acggcgtgga gttcgagctg 60
gtgggcggcg gagagggcac ccccaagcag ggccgcatga ccaacaagat gaagagcacc 120
aaaggcgccc tgaccttcag cccctacctg ctgagccacg tgatgggcta cggcttctac 180
cacttcggca cctaccccag cggctacgag aaccccttcc tgcacgccat caacaacggc 240
ggctacacca acacccgcat cgagaagtac gaggacggcg gcgtgctgca cgtgagcttc 300
agctaccgct acgaggccgg ccgcgtgatc ggcgacttca aggtggtggg caccggcttc 360
cccgaggaca gcgtgatctt caccgacaag atcatccgca gcaacgccac cgtggagcac 420
ctgcacccca tgggcgataa cgtgctggtg ggcagcttcg cccgcacctt cagcctgcgc 480
gacggcggct actacagctt cgtggtggac agccacatgc acttcaagag cgccatccac 540
cccagcatcc tgcagaacgg gggccccatg ttcgccttcc gccgcgtgga ggagctgcac 600
agcaacaccg agctgggcat cgtggagtac cagcacgcct tcaagacccc catcgccttc 660
gcc 663
<210> 8
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180
tgggaggttt atataagcag agct 204
<210> 9
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa 60
cgggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 120
gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 180
tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac ag 212
<210> 10
<211> 181
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60
ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120
tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180
a 181
<210> 11
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggaagggct aattcactcc caacgaaaat aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agca 234
<210> 12
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcctcaat 60
gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120
gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180
gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcct 234
<210> 13
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60
agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaattca aaatttt 117
<210> 14
<211> 912
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa )
<400> 14
atgagaattg cagtgatagc cttctgcctc tggggcttcg cctctgccct tccagttaaa 60
cagactaatt ctggcagctc ggaggaaaag ctgctttcca acaaatacac agatgctgta 120
gccacattgc taaagcctga cccatctcag aagcagactt tcctagcgcc acagaatact 180
atttcctcgg aggaaacgga cgacttcaaa caagagaccc tgccaagcaa gtccaacgaa 240
agccctgagc aaacagacga tgtggacgac gacgacgacg aagaccacgt ggacagcagg 300
gacacggact ccgaggaagc tgatcacgct gacgacgctg accgatccga cgagtctcat 360
cactccgatg aatccgatga gctggtcacc gatttcccca ccgacacccc agcaaccgac 420
gtcactccgg ctgtccccac gggagacccc aatgatggcc gcggggatag tgtggtctat 480
ggactgaggt caaaatctaa gaagttccgc agatccgaag cccagcagct ggatgccaca 540
gaggaagacc tcacgtcaca tgtggaaagt gaggagacgg atggtacccc caaggccatc 600
ctcgttgccc agcgcctgca cgtggcttct gacttggaca gccaagagaa ggacagtcag 660
gagacgagtc agccggatga ccgcagtgtg gaaacccgca gccaggagca gtccaaagaa 720
tacacgatca agacctatga tgggagcaat gagcattcca atgtgattga gagtcaggaa 780
aatcccaaag tcagccaaga attccacagc catgaagaca agctggtccc agactctaag 840
agcgaagaag acaaacacct gaaacttcga gtttctcatg aattagagag tgcgtcttct 900
gagatcaact ga 912
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agcgaattcg aatttaaata tgagaattgc agtgatagcc 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccgcggatcc gatttaaatt cagttgatct cagaagacgc 40
<210> 17
<211> 8201
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420
cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900
taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960
acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020
cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080
ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140
tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200
gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260
aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320
gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380
aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1800
aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1860
aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1920
atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1980
tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2040
gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2100
gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2160
tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2220
tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2280
agagctagcg aattcgaatt taaatcggat ccgcggccgc gaaggatctg cgatcgctcc 2340
ggtgcccgtc agtgggcaga gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg 2400
gtcggcaatt gaacgggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc 2460
gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc 2520
gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacagctgaa gcttcgaggg 2580
gctcgcatct ctccttcacg cgcccgccgc cctacctgag gccgccatcc acgccggttg 2640
agtcgcgttc tgccgcctcc cgcctgtggt gcctcctgaa ctgcgtccgc cgtctaggta 2700
agtttaaagc tcaggtcgag accgggcctt tgtccggcgc tcccttggag cctacctaga 2760
ctcagccggc tctccacgct ttgcctgacc ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg 2820
ttttctgttc tgcgccgtta cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacgct agatggagag 2880
cgacgagagc ggcctgcccg ccatggagat cgagtgccgc atcaccggca ccctgaacgg 2940
cgtggagttc gagctggtgg gcggcggaga gggcaccccc aagcagggcc gcatgaccaa 3000
caagatgaag agcaccaaag gcgccctgac cttcagcccc tacctgctga gccacgtgat 3060
gggctacggc ttctaccact tcggcaccta ccccagcggc tacgagaacc ccttcctgca 3120
cgccatcaac aacggcggct acaccaacac ccgcatcgag aagtacgagg acggcggcgt 3180
gctgcacgtg agcttcagct accgctacga ggccggccgc gtgatcggcg acttcaaggt 3240
ggtgggcacc ggcttccccg aggacagcgt gatcttcacc gacaagatca tccgcagcaa 3300
cgccaccgtg gagcacctgc accccatggg cgataacgtg ctggtgggca gcttcgcccg 3360
caccttcagc ctgcgcgacg gcggctacta cagcttcgtg gtggacagcc acatgcactt 3420
caagagcgcc atccacccca gcatcctgca gaacgggggc cccatgttcg ccttccgccg 3480
cgtggaggag ctgcacagca acaccgagct gggcatcgtg gagtaccagc acgccttcaa 3540
gacccccatc gccttcgcca gatcccgcgc tcagtcgtcc aattctgccg tggacggcac 3600
cgccggaccc ggctccaccg gatctcgctg agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg 3660
acgtggagga gaatcccggc ccttccggga tgaccgagta caagcccacg gtgcgcctcg 3720
ccacccgcga cgacgtcccc agggccgtac gcaccctcgc cgccgcgttc gccgactacc 3780
ccgccacgcg ccacaccgtc gatccggacc gccacatcga gcgggtcacc gagctgcaag 3840
aactcttcct cacgcgcgtc gggctcgaca tcggcaaggt gtgggtcgcg gacgacggcg 3900
ccgcggtggc ggtctggacc acgccggaga gcgtcgaagc gggggcggtg ttcgccgaga 3960
tcggcccgcg catggccgag ttgagcggtt cccggctggc cgcgcagcaa cagatggaag 4020
gcctcctggc gccgcaccgg cccaaggagc ccgcgtggtt cctggccacc gtcggcgtct 4080
cgcccgacca ccagggcaag ggtctgggca gcgccgtcgt gctccccgga gtggaggcgg 4140
ccgagcgcgc cggggtgccc gccttcctgg agacctccgc gccccgcaac ctccccttct 4200
acgagcggct cggcttcacc gtcaccgccg acgtcgaggt gcccgaagga ccgcgcacct 4260
ggtgcatgac ccgcaagccc ggtgcctgag tcgacaatca acctctggat tacaaaattt 4320
gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg 4380
ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt 4440
ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg 4500
tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc accacctgtc 4560
agctcctttc cgggactttc gctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg 4620
cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt 4680
tgtcggggaa atcatcgtcc tttccttggc tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc 4740
gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg 4800
gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga 4860
tctccctttg ggccgcctcc ccgcctggta cctttaagac caatgactta caaggcagct 4920
gtagatctta gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg aagggctaat tcactcccaa 4980
cgaaaataag atctgctttt tgcttgtact gggtctctct ggttagacca gatctgagcc 5040
tgggagctct ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga 5100
gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga 5160
cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt catgtcatct tattattcag 5220
tatttataac ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga ggaacttgtt tattgcagct 5280
tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca 5340
ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggctctag 5400
ctatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt 5460
tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag aagtagtgag 5520
gaggcttttt tggaggccta gacttttgca gagacggccc aaattcgtaa tcatggtcat 5580
agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa 5640
gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc 5700
gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc 5760
aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 5820
cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 5880
ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 5940
aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 6000
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 6060
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 6120
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 6180
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 6240
cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 6300
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 6360
atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 6420
cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 6480
cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 6540
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 6600
ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 6660
tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 6720
aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 6780
tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg 6840
gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 6900
atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 6960
tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 7020
ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt 7080
ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 7140
tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 7200
ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 7260
ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 7320
tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca 7380
gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 7440
taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 7500
cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 7560
agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 7620
gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 7680
ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa 7740
ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg 7800
cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag 7860
cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg 7920
gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc 7980
atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt 8040
cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 8100
gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt 8160
cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct g 8201
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgcaaatggg cggtaggcgt g 21
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gttcacggtg ccctcc 16
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