一种防护紫外皮肤损伤的多肽
阅读说明：本技术 一种防护紫外皮肤损伤的多肽 (Polypeptide for protecting ultraviolet skin injury ) 是由 张舒羽 杨婷仪 张�杰 耿凤豪 余道江 晏涛 于 2021-08-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种可防护皮肤紫外损伤的多肽。紫外防护多肽包含的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。该紫外防护多肽可转导进入人皮肤细胞,增加紫外照射后皮肤细胞的细胞活力,降低其ROS水平,增加其细胞总抗氧化能力,并可减少其细胞死亡和细胞凋亡。该紫外防护多肽氨基酸序列明确,人工合成方便,具有防治皮肤紫外损伤的潜力。(The invention relates to the technical field of biology, and particularly relates to a polypeptide capable of protecting skin from ultraviolet injury. The amino acid sequence of the ultraviolet protection polypeptide is shown as SEQ ID NO. 1. The ultraviolet protective polypeptide can be transferred into human skin cells, increase cell activity of skin cells after ultraviolet irradiation, reduce ROS level, increase total oxidation resistance of cells, and reduce cell death and apoptosis. The ultraviolet protection polypeptide has definite amino acid sequence, is convenient to artificially synthesize, and has the potential of preventing and treating skin ultraviolet injury.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种防护紫外皮肤损伤的多肽。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，它覆盖于全身的表面，约占体重的16％，总面积达1.2～2平方米。它是机体的第一道防线，防止组织和内脏器官受到外来的物理、化学、生物刺激因子对机体的侵袭。阳光是当太阳在地平面之上，经过地球大气层过滤照射到地球表面的太阳辐射，是最重要的自然光源。其中，紫外线是阳光中波长为10-400纳米(nm)的光线，按照波长可分为UVA(320-400nm)、UVB(280-320nm)和UVC(180-280nm)。UVC穿透能力低，在到达地球大气平流层时被平流层中的臭氧给吸收。因此，到达体表与人体相互作用的紫外线主要是是UVA和UVB。近年来，氟污染使大气臭氧层破坏，臭氧含量减少，致使到达地表的紫外辐射逐年增多。
太阳光到达人体体表，皮肤中的生色团以及光敏剂可吸收紫外光。其中皮肤组成成分中的生色团直接吸收光子，这导致皮肤组成成分的激发态的形成以及随后发生光化学反应，皮肤色团包括DNA、尿酸、芳香氨基酸、类维生素a、类胡萝卜素、胆红素、血红蛋白、黑色素和NAD(P)H等。此外，通过光敏作用，紫外能量还能被皮肤内的光敏剂吸收，光敏剂被激发后释放能量传递给不能吸收光子的分子。I型光化学反应包括电子转移和抽氢形成自由基的过程；II型光化学反应涉及能量与O2的转移，生成单线态氧。
由于紫外线较高的能量及紫外线与人体皮肤之间光化学反应的存在，皮肤在紫外强烈照射下产生光损伤，出现真皮血管扩张、红肿和水泡等炎症反应，长期接触紫外线可导致日光性皮炎和皮肤老化，甚至发生皮肤癌变。近年来，臭氧层的破坏使人群暴露于高剂量紫外线的机会大大增加，这导致人群皮肤损伤及皮肤癌发生的危险性显著增高，如黑色素瘤，基底细胞癌和鳞状细胞癌等。此外，高剂量紫外辐照也可使皮肤老化发生提前10年。
紫外线导致皮肤损伤的作用机制复杂。近几年国内外许多学者用中、西药物疗法或外科的方法，通过清除氧自由基、修复胶原组织、调节免疫功能等来治疗皮肤紫外损伤。目前，皮肤紫外辐射防护剂主要有黄酮类化合物、萜类化合物、鞣质类、香豆素类等。但这些防护剂干预皮肤光损伤的具体作用机制了解得不够深入，无大量动物水平以上的实验结果支撑，且其干预皮肤光损伤的流行病学调查和临床实验非常少。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种可防护皮肤紫外损伤的多肽。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种防护皮肤紫外损伤的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地，所述多肽的分子量为1809.872Da。
本发明还提供了一种氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽在制备防紫外辐射的防护剂中应用。
本发明还提供了一种氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽在制备治疗皮肤疾病的药物中的应用。
进一步地，所述防护剂或药物是增加人成纤维细胞活力的防护剂或药物。
进一步地，所述防护剂或药物是降低人成纤维细胞ROS水平的防护剂或药物。
进一步地，所述防护剂或药物是提高人成纤维细胞总抗氧化能力的防护剂或药物。
进一步地，所述防护剂或药物是延长人成纤维细胞生命周期的防护剂或药物。
进一步地，所述防护剂或药物是减少人成纤维细胞凋亡的防护剂或药物。
更进一步地，所述人成纤维细胞为人成纤维细胞WS1。
本发明最后提供了一种治疗皮肤损伤的药物，其包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽及药学上可接受的辅料。
进一步地，其为水浸剂、粉剂、洗剂、酊剂、油剂、乳剂、软膏、硬膏或气雾剂。
本发明的多肽的序列如SEQ ID NO：1所示，经试验证明，该多肽可转导进入人皮肤细胞，增加紫外照射后皮肤细胞的细胞活力，降低其ROS水平，增加其细胞总抗氧化能力，并可减少其细胞死亡和细胞凋亡；该多肽人工合成方便，防治皮肤紫外损伤的潜力巨大，具备实际应用推广价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的
具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1 FITC标记后的多肽进WS1细胞能力检测。
图2 FITC标记后的多肽处理0h进入WS1细胞能力检测。
图3 FITC标记后的多肽处理2h进入WS1细胞能力检测。
图4 FITC标记后的多肽处理4h进入WS1细胞能力检测。
图5 FITC标记后的多肽处理12h进入WS1细胞能力检测。
图6 FITC标记后的多肽处理24h进入WS1细胞能力检测。
图7多肽增加30mJ/cm2照后WS1细胞的细胞活力检测。
图8多肽降低30mJ/cm2照后WS1细胞的ROS水平检测。
图9多肽增加30mJ/cm2照后WS1细胞的ABTS总抗氧化水平检测。
图10多肽降低30mJ/cm2照后WS1细胞的细胞死亡检测。
图11多肽降低30mJ/cm2照后WS1细胞的凋亡水平检测。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得，其中，多肽的氨基酸序列SEQ ID NO：1SGSGGGRISSGNFGSRSLQ，由生工生物工程(上海)股份有限公司化学合成；
由本发明多肽制成的水浸剂、粉剂、油剂、乳剂、软膏剂、硬膏剂、气雾剂的制备工艺成熟，参照现有技术常规方法即可制成。
实施例1含有本发明多肽的水浸剂的制备
取氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽，加去离子水混匀，过滤灭菌制得水浸剂。
实施例2含有本发明多肽的粉剂的制备
取氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽，加矫味剂混匀，按物料的干湿程度使用干法粉碎或湿法粉碎，粉末过筛制得粉剂。
实施例3含有本发明多肽的油剂的制备
取氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽，添加凡士林(油性基质)均匀混合制得油剂。
实施例4含有本发明多肽的乳剂的制备
取氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽，加阿拉伯胶(乳化剂)和液状石蜡研磨制成初乳后，加入羟苯乙酯溶液混合研磨或加入高压匀质机研磨制得乳剂。
实施例5含有本发明多肽的软膏的制备
取氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽，加羊毛脂、凡士林均匀混合制得软膏。
实施例6含有本发明多肽的硬膏的制备
取氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽，加铅肥皂炸料、炼油、下丹、去火毒、滩涂后制得硬膏。
实施例7含有本发明多肽的气雾剂的制备
取氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽，加聚乙二醇，储于带阀门的耐压容器中制得气雾剂。
以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果
试验例1多肽的自主进入人成纤维细胞WS1检测
采用fmoc法合成N端采用FITC标记的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽(由生工生物工程(上海)股份有限公司提供)。合成后的多肽溶于灭菌去离子水(ddH2O，pH＝7.4)，中，配成浓度为10mmol/L的溶液。体外培养的WS1细胞，生长到密度为50％时，加入终浓度为10μmol/L的多肽溶液，12小时后加入DAPI染核30min。弃掉培养液，用PBS漂洗三次，去除游离的荧光多肽后置于共聚焦荧光显微镜下拍照。
结果显示加入本发明多肽的WS1细胞胞质中能观察到绿色荧光信号(图1所示)，空白对照组的细胞中没有绿色荧光，这表明该类多肽具有进入细胞的功能。
试验例2多肽以时间依赖性进入人成纤维细胞WS1细胞作用检测
采用fmoc法合成N端采用FITC标记的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽(由生工生物工程(上海)股份有限公司提供)。合成后的多肽溶于灭菌去离子水(ddH2O，pH＝7.4)，中，配成浓度为10mmol/L的溶液。体外培养的WS1细胞，生长到密度为50％时，加入终浓度为15μmol/L的多肽溶液，于0、2、4、12、24小时后，用PBS漂洗三次，去除游离的荧光多肽后置于共聚焦荧光显微镜下拍照。
结果显示加入本发明多肽的WS1细胞胞质中能观察到绿色荧光信号(图2～6所示)，空白对照组的细胞中没有绿色荧光，这表明该类多肽具有进入细胞的功能。
试验例3多肽增加紫外照后的人成纤维细胞WS1的细胞活力
根据实验设计，96孔板细胞培养，分为0mJ/cm2非照射组(NC)、30mJ/cm2照射对照组(sham)、30mJ/cm2照射甘氨酸组(Gly)、30mJ/cm2照射多肽组(19Aa,多肽氨基酸序列如SEQID NO:1所示)。96孔板每孔加入100μL 3000个WS1细胞于37℃，5％CO2细胞培养箱内培养；照射前24h，NC组、sham组每孔加入100μL的DMEM培养基处理，Gly组每孔加入100μL的10μM的Gly溶液处理，19Aa组每孔加入100μL的10μM的19Aa多肽溶液处理；待细胞贴壁增殖至孔面积约80％以上时，弃去上清，加入适量PBS覆盖细胞；WS1细胞UVB辐照，时间75s，剂量30mJ/cm2；弃PBS，加入10％DMEM培养基于培养箱中继续培养24h；照后24h，弃去细胞培养基，加10％的CCK-8溶液继续孵育WS1细胞1.5h，后在酶标仪上测定吸光度：450nm波长。
结果显示，UVB照前多肽(19Aa)处理可增加受照后WS1细胞的细胞活力(图7所示)。对照组与治疗组比较有统计学意义，****代表P＜0.0001。
试验例4多肽降低紫外照后的人成纤维细胞WS1的ROS水平
根据实验设计，6孔板细胞培养，分为0mJ/cm2非照射对照组(sham)、0mJ/cm2非照射甘氨酸组(Gly)、0mJ/cm2非照射多肽组(19Aa,多肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)；30mJ/cm2照射对照组(sham)、30mJ/cm2甘氨酸组(Gly)、30mJ/cm2照射多肽组(19Aa,多肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)。6孔板每孔加入1.5mL 60000个WS1细胞于37℃，5％CO2细胞培养箱内培养；照射前24h，sham组每孔加入1.5mL的DMEM培养基处理，Gly组每孔加入1.5mL的10μM的Gly溶液处理，19Aa组每孔加入1.5mL的10μM的19Aa多肽溶液处理；待细胞贴壁增殖至孔面积约80％以上时，弃去上清，加入适量PBS覆盖细胞，WS1细胞UVB辐照，时间75s，剂量30mJ/cm2；弃PBS，加入10％DMEM培养基于培养箱中继续培养24h；照后24h，收集WS1细胞DCFH-DA染色，流式检测细胞ROS水平。
结果显示，UVB照前多肽(19Aa)处理可降低受照后WS1细胞的ROS水平(图8所示)。对照组与治疗组比较有统计学意义，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001。
试验例5多肽增加紫外照后的人成纤维细胞ABTS总抗氧化能力
根据实验设计，6孔板细胞培养，分为0mJ/cm2非照射组(NC)、30mJ/cm2照射对照组(sham)、30mJ/cm2照射甘氨酸组(Gly)、30mJ/cm2照射多肽组(19Aa,多肽氨基酸序列如SEQID NO:1所示)。6孔板每孔加入1.5mL 60000个WS1细胞于37℃，5％CO2细胞培养箱内培养。照射前24h，NC组、sham组每孔加入1.5mL的DMEM培养基处理，Gly组每孔加入1.5mL的10μM的Gly溶液处理，19Aa组每孔加入1.5mL的10μM的19Aa多肽溶液处理；待细胞贴壁增殖至孔面积约80％以上时，弃去上清，加入适量PBS覆盖细胞，WS1细胞UVB辐照，时间75s，剂量30mJ/cm2；弃PBS，加入10％DMEM培养基于培养箱中继续培养24h；照后24h，提取细胞蛋白，ABTS法检测细胞总抗氧化能力。
结果显示，UVB照前多肽(19Aa)处理可增加受照后WS1细胞的总抗氧化能力(图9所示)。对照组与治疗组比较有统计学意义，*P＜0.05，**代表P＜0.01。
试验例6多肽降低紫外照后的人成纤维细胞WS1的细胞死亡率
根据实验设计，96孔板细胞培养，分为0mJ/cm2非照射组+非照射最大酶活性组(NC)、30mJ/cm2照射对照组+照射最大酶活性组(sham)、30mJ/cm2照射Gly组+照射甘氨酸最大酶活性组(Gly)、30mJ/cm2照射多肽组+照射多肽最大酶活性组(19Aa，,多肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，最大酶活性组每孔加入10μL的乳酸脱氢酶(LDH)释放试剂裂解细胞释放LDH作为每组不同处理的乳酸脱氢酶最大酶活性孔。96孔板每孔加入100μL2000个WS1细胞于37℃，5％CO2细胞培养箱内培养，待检测时细胞密度不超过80-90％。照射前24h，NC组、sham组每孔加入100μL的DMEM培养基，Gly组每孔加入100μL的10μM的Gly溶液处理，19Aa组每孔加入100μL的10μM的19Aa多肽溶液处理；待细胞贴壁增殖至孔面积约80％以上时，弃去上清，加入适量PBS覆盖细胞，WS1细胞UVB辐照，时间75s，剂量30mJ/cm2；照后每孔立即更换为无血清培养基后放入37℃、5％CO2细胞培养箱内继续培养23h；23h后，向“样品最大酶活性对照孔”加入LDH释放试剂，继续孵育1h。多孔板离心机400g离心5分钟，取上清液进行LDH释放检测。酶标仪测定吸光度：490nm波长。
结果显示，UVB照前多肽(19Aa)处理可降低受照后WS1细胞的细胞死亡率(图10所示)。对照组与治疗组比较有统计学意义，**代表P＜0.01。
试验例7多肽减少紫外照后的人成纤维细胞WS1的细胞凋亡
根据实验设计，6孔板细胞培养，分为0mJ/cm2非照射组(NC)、0mJ/cm2照射N-乙酰半胱氨酸组(NAC)、0mJ/cm2照射多肽组(19Aa，多肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)、30mJ/cm2照射对照组(sham)、30mJ/cm2照射N-乙酰半胱氨酸组(NAC)、30mJ/cm2照射多肽组(19Aa)。6孔板每孔加入1.5mL 60000个WS1细胞于37℃，5％CO2细胞培养箱内培养。照射前24h，NC组、sham组每孔加入1.5mL的DMEM培养基，NAC组每孔加入1.5mL的10μM的NAC溶液处理，19Aa组每孔加入1.5mL的10μM的19Aa多肽溶液处理；待细胞贴壁增殖至孔面积约80％以上时，弃去上清，加入适量PBS覆盖细胞，WS1细胞UVB辐照，时间75s，剂量30mJ/cm2；弃PBS，加入10％DMEM培养基于培养箱中继续培养24h；照后24h，收集细胞进行Annexin-V/PI双染，流式检测细胞凋亡水平。
结果显示，UVB照前多肽(19Aa)处理可降低受照后WS1细胞的细胞凋亡(图11所示)。对照组与治疗组比较有统计学意义，****代表P＜0.0001。
综上，本发明多肽可转导进入人皮肤细胞，增加紫外照射后皮肤细胞的细胞活力，降低其ROS水平，增加其细胞总抗氧化能力，并减少其细胞死亡和细胞凋亡。本发明多肽人工合成方便，防治皮肤紫外损伤的潜力巨大，具备实际应用推广价值。
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Ser Gly Ser Gly Gly Gly Arg Ile Ser Ser Gly Asn Phe Gly Ser Arg
1 5 10 15
Ser Leu Gln
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