一种提高微生物培养效果的方法及培养基
阅读说明：本技术 一种提高微生物培养效果的方法及培养基 (Method and culture medium for improving microbial culture effect ) 是由 尹进 李明月 于 2021-10-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及微生物发酵技术领域,具体公开了一种提高微生物培养效果的方法及培养基。本发明通过向培养基中添加聚甘油脂肪酸酯,不仅提高了微生物对脂质碳源的利用率,还提高了发酵过程中微生物生物量的积累及次生代谢产物产量；同时,解决了现有菌种进行发酵测试时,发酵效果不稳定、重复性不高的问题,为优势菌的筛选提供了必要的技术支持。(The invention relates to the technical field of microbial fermentation, and particularly discloses a method and a culture medium for improving a microbial culture effect. According to the invention, the polyglycerol fatty acid ester is added into the culture medium, so that the utilization rate of the lipid carbon source by the microorganism is improved, and the accumulation of the biomass of the microorganism and the yield of secondary metabolites in the fermentation process are also improved; meanwhile, the problems of unstable fermentation effect and low repeatability in the fermentation test of the existing strains are solved, and necessary technical support is provided for screening of dominant bacteria.)
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高微生物培养效果的方法及培养基。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(PHA，polyhydroxyalkanoates)，是有100~30000个相同或不同羟基脂肪酸单体组成的高分子聚合物。PHA是近20多年迅速发展起来的生物高分子材料，由于其同时具有良好的生物相容性能、生物可降解性和塑料的热加工性能。因此同时可作为生物医用材料和生物可降解包装材料。并且，PHA还具有非线性光学性、压电性、气体相隔性很多高附加值性能。因此，PHA已经成为近年来生物材料领域最为活跃的研究热点。PHA是很多微生物合成的一种细胞内聚酯，目前，其生产方法以微生物发酵为主。现有技术中记载了多种利用微生物利用油脂作为碳源生产PHA的方法。但是目前PHA的产量仍有待进一步的提高。
影响PHA产量的因素主要包括菌种自身的生长和代谢活性以及培养条件对菌种活性的影响。因此，菌种的筛选和培养条件的优化是当前研究的重点。一方面，菌株筛选常用的摇瓶测试作为筛选的第一步，但在实验中发现摇瓶的稳定性不高，同一菌种即便采用相同的培养液在多个摇瓶中仍会表现出不同活性，产生较大误差。而另一方面，不论以怎样的培养条件进行培养，菌种对碳源的利用都是影响PHA产量的重要因素。现有技术中，为了解决微生物对脂质碳源的利用率尝试了多种方案，但大多数方案虽然能够增强微生物的营养生殖，提高菌体数量或扩繁速度，却无法实现提高PHA的产量。
例如，采用阿拉伯树胶作为添加剂的技术方案，在多次培养中表现出较大的差异，一些培养瓶甚至发生沉淀；采用酪蛋白和磷酸盐作为添加剂在发酵初期虽可取得良好的效果，但随着发酵进行，培养体系的pH值和离子强度都发生改变，乳化效果受到影响，发酵稳定性和微生物活性都降低；而采用吐温系列作为添加剂进行尝试，并无法提高PHA的积累水平。
因此，提高微生物对脂质的利用率、同时稳定菌种在多批次培养中的发酵水平，对优势菌的筛选具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高微生物培养效果的方法及培养基，该方法和培养基能够有效地提高微生物对脂质碳源的利用率、提高微生物的生物量、提高微生物的次生代谢产物产量以及提高微生物的多次发酵效果的稳定性。
本发明研究表明，在以脂质为主要碳源或唯一碳源进行微生物培养的过程中，常常出现多次培养间效果不稳定、碳源利用率不足、微生物生物量积累不足、次生代谢产物产量较低的情况，而原因是多种多样的，各种因素之间还存在相互影响。经进一步研究，在培养基中添加聚甘油脂肪酸酯类物质对解决以上问题具有积极且有效的作用。
为了解决上述问题，避免上述情况的发生，本发明通过大量客观实验采用多种物质作为添加剂进行了对比和筛选，先后根据乳化效果、加入添加剂后混合物的稳定性和均一性等参考指标，筛选出了洗洁精、聚甘油脂肪酸酯和皂苷这三种综合效果较好的添加剂。进一步，本发明通过结合生物量积累水平和次生代谢产物产量的实验对比，最终筛选出聚甘油脂肪酸酯可更有利于提高微生物对脂质碳源的利用率，并在多批次发酵实验中表现出良好的稳定性，且不会受到添加浓度的明显影响。
聚甘油脂肪酸酯（PGFE）简称聚甘油酯，是由聚甘油与脂肪酸形成酯。本发明中，所述聚甘油脂肪酸酯选自：二聚至十聚甘油硬脂酸酯系列、二聚至十聚甘油油酸酯系列、二聚至十聚甘油棕榈酸酯系列、二聚至十聚甘油肉豆蔻酸酯系列、二聚至十聚甘油月桂酸酯系列、聚甘油的聚蓖麻酸酯系列、二聚甘油二聚羟基硬脂酸酯、三聚甘油二异硬脂酸酯、乳酸单甘酯、琥珀酸单甘酯、柠檬酸单甘酯、油酸单甘酯、辛酸葵酸酸单甘酯、二乙酰洒石酸单/双甘酯中至少一种。
在本发明的
具体实施方式
中，以十聚甘油单月桂酸酯作为示例性说明，应当理解的是，以上聚甘油脂肪酸酯的可选种类由于与十聚甘油单月桂酸酯具有相同或相似的性质，因此在实际操作中可以进行等同替换。
本发明通过实验研究发现，在以脂质为碳源的培养基中添加聚甘油脂肪酸酯，经高温灭菌后混合物仍可保持良好的均一性，在多次发酵中表现出良好的稳定性。以含有聚甘油脂肪酸酯的培养基对菌种进行发酵，其能够更有效的利用油脂，获得更高的生物量，同时提高次生代谢产物PHA的积累。本发明实施例中，所述次生代谢产物为PHA。
第一方面，本发明提供了一种提高微生物培养效果的方法，利用培养基进行微生物发酵，所述培养基以脂质为碳源，并添加有聚甘油脂肪酸酯；所述提高微生物培养效果包括（1）~（4）中的至少一项：
（1）提高微生物对脂质碳源的利用率；
（2）提高微生物的生物量；
（3）提高微生物的次生代谢产物产量；
（4）提高微生物的发酵稳定性。
作为优选，所述培养基为液体培养基。
进一步地，所述培养基中，脂质与聚甘油脂肪酸酯的摩尔比为12:1~61:1，典型非限制性的可选为61:1、56:1、52:1、48:1、42:1、36:1、28:1、24:1、18:1、12:1等。
其中，所述脂质为植物油、动物油或厨余废弃油脂。
所述植物油选自棕榈油、花生油、大豆油、芝麻油、橄榄油、葵花油、菜籽油、玉米油、棉籽油、桐油、乌臼油、松子油、蓖麻油和麻疯树籽油中的一种或多种。
所述动物油选自鱼油、鸡油、牛油、羊油和猪油中的一种或多种。
作为优选，所述培养基中，脂质的浓度为8~12g/L，聚甘油脂肪酸酯的浓度为0.6~3g/L。典型非限制性地，脂质的浓度可为8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L，聚甘油脂肪酸酯的浓度可为0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.6g/L、1.8g/L、2g/L、2.2g/L、2.4g/L、2.6g/L、2.8g/L、3g/L。
在本发明的具体实施方式中，作为示例性说明，所述脂质为植物油，更具体为棕榈油。
更进一步地，所述培养基还含有水和如下浓度的无机盐：1.57g/L硫酸铵，5.66g/L十二水合磷酸二氢钠，1.5g/L磷酸二氢钾，0.2g/L七水硫酸镁，0.01g/L 二水氯化钙，0.02g/L七水硫酸亚铁，0.0003g/L 硼酸，0.0002g/L六水氯化钴，0.0001g/L七水硫酸锌，0.03g/L四水氯化锰，0.03g/L二水钼酸钠，0.02g/L六水氯化镍，0.01g/L五水硫酸铜。
应当理解的是，前述方法中，所述微生物为能够以脂质为碳源进行发酵代谢的微生物。作为优选，所述微生物选自罗氏真养菌（Ralstonia eutropha）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、红球菌（Rhodococcus opacus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的一种或多种。
更为具体地，在本发明的一些实施例中，所述微生物为罗氏真养菌，具体为Ralstonia eutropha H16。具体发酵方法为：将微生物接种至前述培养基，使初始OD值为0.05，然后在30℃，220 rpm的条件下培养48h。
再进一步地，为了更好地提高微生物的培养效果，还可在发酵步骤之前增加活化步骤，活化阶段使用的培养基可采用本领域常规使用的活化培养基，包括水、酵母提取物、蛋白胨、果糖和氯化钠。活化方法也可采用本领域常规的活化方法，例如先划线培养再摇菌培养。
在一些具体实施例中，以罗氏真养菌作为发酵菌种，则所述划线培养的培养基中含有水和5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、3g/L果糖、10g/L氯化钠和1.5g/L的琼脂粉；所述摇菌培养的培养基中含有水和5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、3g/L果糖和10g/L氯化钠。
在一些具体实施例中，所述划线培养的条件包括30℃培养48h，所述摇菌培养的条件包括30℃，220 rpm，培养8h。
本发明一个具体实施例中，还进一步提供了一种PHA的制备方法，其以棕榈油为碳源，在十聚甘油单月桂酸酯存在条件下，对罗氏真养菌进行发酵，获得含有PHA的发酵液。
第二方面，本发明提供了一种用于提高微生物培养效果的培养基，其特征在于，所述培养基以脂质为碳源，并添加有聚甘油脂肪酸酯；所述提高微生物培养效果包括（1）~（4）中的至少一项：
（1）提高微生物对脂质碳源的利用率；
（2）提高微生物的生物量；
（3）提高微生物的次生代谢产物产量；
（4）提高微生物的发酵稳定性。
进一步地，所述培养基中，脂质与聚甘油脂肪酸酯的摩尔比为12:1~61:1。
作为优选，所述培养基中，脂质的浓度为8~12g/L，聚甘油脂肪酸酯的浓度为0.6~3g/L。
更为具体地，所述培养基包括：水和10g/L棕榈油，0.6~3g/L十聚甘油单月桂酸酯，1.57g/L硫酸铵，5.66g/L十二水合磷酸二氢钠，1.5g/L磷酸二氢钾，0.2g/L七水硫酸镁，0.01g/L 二水氯化钙，0.02g/L七水硫酸亚铁，0.0003g/L 硼酸，0.0002g/L六水氯化钴，0.0001g/L七水硫酸锌，0.03g/L四水氯化锰，0.03g/L二水钼酸钠，0.02g/L六水氯化镍，0.01g/L五水硫酸铜。
本发明的有益效果在于：
本发明通过向发酵培养基中加入特定的添加剂，不仅提高了微生物对脂质碳源的利用率和次级代谢产物的产量，同时还解决了现有发酵测试方法稳定性不强、重复性不高的问题，稳定了微生物在多批次培养中的发酵水平，为优势菌株的筛选提供了必要且良好的技术支持。
附图说明
图1为添加不同浓度十聚甘油单月桂酸酯后，视觉观察乳液的乳化状态；图下标注浓度表示十聚甘油单月桂酸酯/培养基，瓶上标注为每瓶中十聚甘油单月桂酸酯母液的添加体积，后续提到此部分均以图下标注浓度为准。
图2为添加不同浓度十聚甘油单月桂酸酯后，光学显微镜观察到的乳液的乳化状态；图下标注浓度表示十聚甘油单月桂酸酯/培养基，分别在10倍物镜和40倍物镜下观察。
图3为添加不同浓度洗洁精后，视觉观察乳液的乳化状态；图下标注浓度表示洗洁精/培养基，瓶上标注为每瓶中洗洁精母液的添加体积，后续提到此部分均以图下标注浓度为准。
图4为添加不同浓度洗洁精后，光学显微镜观察到的乳液的乳化状态；图下标注浓度表示洗洁精/培养基，分别在10倍物镜和40倍物镜下观察。
图5为添加不同浓度皂苷后，视觉观察乳液的乳化状态；图下标注浓度表示皂苷/培养基，瓶上标注为每瓶中皂苷母液的添加体积，后续提到此部分均以图下标注浓度为准。
图6为添加不同浓度皂苷后，光学显微镜观察到的乳液的乳化状态；图下标注浓度表示皂苷/培养基，均在10倍物镜下观察。
具体实施方式
本发明提供了聚甘油脂肪酸酯在提高微生物培养效果中应用、提高微生物培养效果的方法及培养基，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售商品，皆可通过常规购买途径获得。
所述微生物，是一群个体微小、构造简单的单细胞或多细胞生物，包括细菌、真菌和放线菌等。本发明中所述的微生物为能够以脂质为碳源的微生物。主要包括以脂质为碳源的细菌。例如，可选择的微生物包括罗氏真养菌（Ralstonia eutropha）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、红球菌（Rhodococcus opacus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的至少一种。在本发明的具体实施方式中，以细菌中的Ralstonia eutrophaH16作为示例性说明。
本发明所述脂质是指由脂肪酸与醇脱水缩合生成的酯或其衍生物，不溶于水而易溶于有机溶剂。脂质包括油脂（甘油三酯）和类脂（磷脂、糖酯和固醇类）。一般将常温下呈液态的油脂称为油，而呈固态的油脂称为脂肪。基本所有的脂质都可以作为微生物生长的碳源。但在本发明实施例中，优选常温下为液态的油脂作为微生物发酵的碳源。在本发明的具体实施方式中，以油脂中的棕榈油作为示例性说明。
本发明所述聚甘油脂肪酸酯：是由聚甘油和脂肪酸在高温下酯化而成的酯。在本发明的具体实施方式中，以十聚甘油单月桂酸酯作为示例性说明。
所述洗洁精主要成分是表面活性剂。在本发明的具体实施方式中，以包含C10-16醇聚氧乙烯醚硫酸酯钠、C8-16烷基葡糖苷、C10-16烷基苯磺酸钠、椰油酰胺丙基氧化胺、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯等多种成分的洗洁精作为示例性说明。
所述皂苷由皂苷元和糖组成，其中皂苷元为三萜类的皂苷称为三萜皂苷。在本发明的具体实施方式中，以奎拉皂苷作为示例性说明。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 添加不同添加剂后的混合物对比（预实验）
1、添加剂母液的配制与灭菌：
聚甘油脂肪酸酯：称取3 g十聚甘油单月桂酸酯，加入10 mL水，在121℃ ；20 min的条件下高温灭菌。
洗洁精：称取1 g 洗洁精，加入10 mL水，通过0.22 μm滤膜，过滤除菌。
奎拉皂苷：称取3 g奎拉皂苷，加入15 mL水，在121℃；20 min的条件下高温灭菌。
2、乳液混合物制备过程：
称取相应添加剂溶解于水中，其中聚甘油脂肪酸酯和奎拉皂苷水溶液在121℃，15min的条件下高温灭菌，洗洁精水溶液则使用0.22 μm滤膜过滤除菌。将灭菌后的脂质和相应添加剂水溶液按量加入发酵培养基中，直接在220 rpm的摇床中震荡，从而获得相应乳液混合物。
乳液中包括：水、添加剂（具体浓度见表1）、10g/L棕榈油，1.57g/L硫酸铵，5.66g/L十二水合磷酸二氢钠，1.5g/L磷酸二氢钾，0.2g/L七水硫酸镁，0.01g/L 二水氯化钙，0.02g/L七水硫酸亚铁，0.0003g/L 硼酸，0.0002g/L六水氯化钴，0.0001g/L七水硫酸锌，0.03g/L四水氯化锰，0.03g/L二水钼酸钠，0.02g/L六水氯化镍，0.01g/L五水硫酸铜。
3、乳液混合物状态检测：
在220 rpm的摇床中震荡30 min后，对相应乳液混合物进行视觉观察和光学显微镜检测。视觉观察主要看液面油滴的大小和数量，油滴越大，数量越多，则表明效果越差；反之，则表明效果好。显微镜检测时油滴越小，数量越多，则表明效果越好；反之，则表明效果差。具体检测结果见图1-图6，观察到的效果见表1。
表1 不同添加剂的使用浓度与效果
如图1-图6和表1所示，三种添加剂在到达合理浓度后，都能够取得良好的效果，三种添加剂的水溶液在进行高温灭菌（聚甘油脂肪酸酯和奎拉皂苷）或过滤除菌（洗洁精）后，均产生均一的液体，不会出现沉淀的情况；同时，它们对于pH、离子强度等因素均不敏感，不会受到发酵过程中pH变化的影响；最后，这三种添加剂的使用成本均较低。
实施例2 添加剂对脂质碳源利用率的影响
本实施例以罗氏真养菌Ralstonia eutropha H16为例，用于说明添加剂对脂质碳源利用率的影响，具体如下：
种子培养：将罗氏真养菌Ralstonia eutropha H16在种子培养基固体平板上划线接种，并在30℃下培养48 h。然后挑取单克隆接种到装有3 mL种子培养基的10 mL摇菌管中，在30℃，220 rpm的条件下培养12 h-16 h，得到浑浊的菌液；接下来将菌液按初始OD值为0.1转接到装有10 mL种子培养基的100 mL锥形瓶中，在30℃，220 rpm，培养8 h；此时再次将菌液按初始OD值为0.1转入新的装有15 mL种子培养基的150 mL锥形瓶中，在30℃，220rpm的条件下培养12 h-16 h。种子培养基包括水和：5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、3g/L果糖和10g/L氯化钠（固体培养基加入1.5g/L的琼脂粉）。
发酵培养：将种子液按初始OD值为0.05转接到装有30 mL 发酵培养基（直接加入碳源和添加剂）的250 mL锥形瓶中，在30℃，220 rpm的条件下发酵培养48 h。摇瓶发酵结束后，离心收集细胞，用30%的乙醇洗涤后烘干，称重获得细胞干重，并通过气相色谱法检测获得相应PHA含量。
发酵培养基包括水和：碳源（果糖或棕榈油），添加剂（无、十聚甘油单月桂酸酯、洗洁精或皂苷），1.57g/L硫酸铵，5.66g/L十二水合磷酸二氢钠，1.5g/L磷酸二氢钾，0.2g/L七水硫酸镁，0.01g/L 二水氯化钙，0.02g/L七水硫酸亚铁，0.0003g/L 硼酸，0.0002g/L六水氯化钴，0.0001g/L七水硫酸锌，0.03g/L四水氯化锰，0.03g/L二水钼酸钠，0.02g/L六水氯化镍，0.01g/L五水硫酸铜。
根据碳源和添加剂的不同，将实验分为如下几组，含有添加剂的受试组中添加剂的浓度皆采用实施例1（预实验）中表现较优的浓度：
①、碳源为果糖，其在培养基中的浓度为25g/L；不含添加剂。
②、碳源为棕榈油，其在培养基中的浓度为10g/L；不含添加剂。
③、碳源为棕榈油，其在培养基中的浓度为10g/L；添加剂为十聚甘油单月桂酸酯，其在培养基中的浓度为0.6g/L。
④、碳源为棕榈油，其在培养基中的浓度为10g/L；添加剂为十聚甘油单月桂酸酯，其在培养基中的浓度为1.5g/L。
⑤、碳源为棕榈油，其在培养基中的浓度为10g/L；添加剂为十聚甘油单月桂酸酯，其在培养基中的浓度为3g/L。
⑥、碳源为棕榈油，其在培养基中的浓度为10g/L；添加剂为洗洁精，其在培养基中的浓度为0.2g/L。
⑦、碳源为棕榈油，其在培养基中的浓度为10g/L；添加剂为洗洁精，其在培养基中的浓度为1g/L。
⑧、碳源为棕榈油，其在培养基中的浓度为10g/L；添加剂为奎拉皂苷，其在培养基中的浓度为2g/L。
⑨、碳源为棕榈油，其在培养基中的浓度为10g/L；添加剂为奎拉皂苷，其在培养基中的浓度为4g/L。
各组发酵后检测的细胞干重、代谢产物PHA含量和PHA titer等检测结果见下表2。细胞干重通过将发酵液离心收集菌体，然后烘干称重后计算获得；PHA含量和PHA titer均采用气相法检测后计算获得。
其中，碳源利用率（%）=实际产生PHA（PHA titer）的量/碳源理论上能够转化为PHA的量×100%。
其中，PHA含量（wt%）=PHA产量/细胞干重×100%。
表2 实验组各参数检测结果
结果表明，组①~②中，组①使用的碳源不同，未使用棕榈油做碳源，而使用25g/L的果糖做碳源，可以看作本实验的阳性对照；组②直接使用10g/L的棕榈油做碳源，未添加任何添加剂，可以当作本实验的阴性对照。此外，实验组均使用棕榈油做碳源，均加入了相应的乳化剂，不同添加剂的添加量为实施例1（预实验）中表现出效果最好的浓度，在其他浓度下，各添加剂皆无法达到更优于表2记载的效果。
从表2可以看出，发酵后所有添加聚甘油脂肪酸酯和1g/L洗洁精的实验组，细胞干重、PHA含量和PHA titer等远高于阴性对照，而与阳性对照水平相当。表明添加适量的聚甘油脂肪酸酯和洗洁精时，微生物可以正常生长，且对碳源棕榈油的利用率明显提高，并且各实验组SD值较小，说明培养效果更稳定。而添加洗洁精的受试组虽表现出良好的效果，但其在不同浓度下，效果波动较大，不利于大规模实践中使用，故以聚甘油脂肪酸酯为最优选的方案。从添加剂本身的性质和发酵结果来看，这一方法显著优于已开发的其他方法。
而添加0.2g/L洗洁精和添加皂苷的实验组，在细胞干重、PHA含量和PHA titer上，均低于阳性对照。这表明微生物在利用脂质碳源进行发酵时，添加剂的种类及某些种类添加剂的添加浓度都可对发酵效果产生至关重要的影响。
综上所述，本发明通过对添加剂进行筛选，不仅提高了培养基的均一性和稳定性，还提高了微生物对脂质碳源的利用率，并有效提升了微生物生长发酵的稳定性和重复性，为优势菌的筛选提供了良好的技术支持。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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