一种雨生红球藻纯种培养的联合抗生素施用方法
阅读说明：本技术 一种雨生红球藻纯种培养的联合抗生素施用方法 (Combined antibiotic application method for pure culture of haematococcus pluvialis ) 是由 王巧晗 凌滨峰 李芸 张静 陈希凤 刘岩 李景玉 宫庆礼 于 2021-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种雨生红球藻纯种培养的联合抗生素施用方法。实验所用雨生红球藻培养基MCM培养基为：A液配方为硝酸钾500mg/L,磷酸氢二钾20mg/L,七水合硫酸镁100mg/L；B液配方为六水合氯化钙80mg/L；C液配方为乙二胺四乙酸二钠372μg/L,七水合硫酸铁417μg/L；D液配方为硫酸锌7.189μg/L,磷酸1.237μg/L,二水合氯化钴0.476μg/L,五水合硫酸铜6.242μ/L,一水合硫酸锰8.451μg/L和二水合钼酸钠0.726μg/L；配方溶剂为自来水,经高压灭菌后,依次将A液、B液、C液和D液溶于溶剂中；联合使用链霉素、卡那霉素、庆大霉素、氨苄青霉素4种抗生素,pH调节为6.99-7.03,各抗生素浓度分别为600μg/ml,在光照箱中的摇床上培养3d,结合固态培养基纯化和检验获得纯种雨生红球藻。(The invention relates to a combined antibiotic application method for pure culture of haematococcus pluvialis. The experimental haematococcus pluvialis culture medium MCM comprises: the formula of the solution A comprises 500mg/L potassium nitrate, 20mg/L dipotassium phosphate and 100mg/L magnesium sulfate heptahydrate; the formula of the solution B is 80mg/L calcium chloride hexahydrate; the formula of the solution C is 372 mu g/L of ethylene diamine tetraacetic acid and 417 mu g/L of iron sulfate heptahydrate; the formula of the solution D comprises 7.189 mu g/L zinc sulfate, 1.237 mu g/L phosphoric acid, 0.476 mu g/L cobalt chloride dihydrate, 6.242 mu g/L copper sulfate pentahydrate, 8.451 mu g/L manganese sulfate monohydrate and 0.726 mu g/L sodium molybdate dihydrate; the formula solvent is tap water, and after autoclaving, the solution A, the solution B, the solution C and the solution D are dissolved in the solvent in sequence; using 4 antibiotics of streptomycin, kanamycin, gentamicin and ampicillin in combination, adjusting pH to 6.99-7.03, respectively controlling the concentration of each antibiotic to be 600 mug/ml, culturing for 3d on a shaking table in a light box, and purifying and checking by combining a solid culture medium to obtain pure haematococcus pluvialis.)
技术领域
本发明涉及一种适用于纯种微藻的获得方法，具体涉及一种适用于雨生红球藻纯种培养的联合抗生素施用方法，尤其涉及一种适用于雨生红球藻绿色细胞营养生长阶段的纯种获取及培养的方法。
背景技术
雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种适合在淡水中生长的单细胞藻类，隶属于绿藻门，绿藻纲，团藻目，红球藻科，红球藻属。雨生红球藻在环境不良时，产生厚壁孢子，积累大量的虾青素。雨生红球藻含有大量的虾青素（最高能达到细胞干重的7%），为重要的分子生物学试验对象和生产天然虾青素的原料，被公认为虾青素最安全的来源，市场非常广阔，在中国的湖北和云南拥有雨生红球藻培养的最大产业和全球稳定生产基地，具有非常大的产业规模，具有坚实的产业基础。
天然虾青素是一种红色酮基类胡萝卜素，是一种脂溶性不饱和的大分子有机化合物，广泛存在于生物界，尤其存在于鱼、虾、贝、藻等水生生物体内，是全世界最强抗氧化物之一，曾获得美国ＦＤＡ、欧盟等１０多项国际认证。虾青素分子结构中含有长的共轭双键链，末端含不饱和的酮基和羟基，为该分子中提供重要的抗氧化能力。在雨生红球藻的光合作用过程中，虾青素既能作为辅助色素吸收光能，也能作为抗氧化剂以清除细胞内过多的活性氧，保护细胞免受氧化损伤。此外，虾青素还有抗衰老、抗炎、提高免疫力、修复紫外线损伤、抑制肿瘤生长等功能，不仅可作为水生动物、禽畜类养殖的饲料添加剂，也可以作为治疗药物应用于医药、护肤品等行业，具有较高的经济价值。
雨生红球藻生活周期中主要有两种不同的细胞类型，即进行营养生长的绿色游动细胞以及累积虾青素的红色不动细胞。在有利的生长条件下，细胞生长旺盛，以绿色的游动细胞存在，细胞内含极少量虾青素；而在不利的环境下，细胞受到胁迫，生长趋于缓慢，游动细胞尾部脱落，运动能力丧失由游动状态逐渐趋于静止状态，细胞体积增大，转化为厚壁孢子，同时大量累积虾青素，细胞由绿转红。雨生红球藻主要在红色细胞阶段开始累积虾青素。
传统方法获得的雨生红球藻藻种不是真正意义上的纯种，培养基中含有其他的藻际细菌，藻际细菌与雨生红球藻之间存在着复杂的相互关系，其对于提升或降低雨生红球藻的生产力有潜在作用。本发明能够为相关后续研究提供大量的雨生红球藻纯种作为实验材料。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，而提供一种适用于雨生红球藻纯种培养的联合抗生素施用方法，可以获得雨生红球藻纯种，为相关性研究提供大量的实验材料。该联合抗生素施用方法适用于雨生红球藻绿色细胞营养生长阶段。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种适用于雨生红球藻纯种培养的联合抗生素施用方法，施用方法为：使用MCM培养基培养雨生红球藻，在此基础上，联合使用浓度分别为600μg/ml链霉素、卡那霉素、庆大霉素、氨苄青霉素4种抗生素在光照培养箱中对雨生红球藻藻液进行3d摇床培养处理，结合固体培养基纯化获得纯种雨生红球藻。
进一步的，所述的MCM培养基的配制方法具体包括以下步骤：
（1）配制A溶液母液：称取50g硝酸钾溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取2g磷酸二氢钾溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取10g七水合硫酸镁溶于少量溶剂中使之完全溶解；将溶解的硝酸钾溶液、磷酸磷酸二氢钾溶液和七水合硫酸镁溶液混合在一起，用溶剂定容至1 L配成A液母液，使硝酸钾浓度为50g/L，磷酸二氢钾浓度为2g/L，七水合硫酸镁浓度为10g/L；
（2）配制B溶液母液：称取8g六水合氯化钙溶于少量溶剂中使之完全溶解，用溶剂定容至1L配成B液母液，使六水合氯化钙浓度为8g/L；
（3）配制C溶液母液：称取3.72g乙二胺四乙酸二钠溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取 4.17g七水合硫酸铁溶于少量溶剂中使之完全溶解；将溶解的乙二胺四乙酸二钠溶液和七水合硫酸铁溶液混合在一起，用溶剂定容至1 L配成C溶液母液，使乙二胺四乙酸二钠浓度为3.72g/L，七水合硫酸铁为4.17g/L；
（4）配制D溶液母液：称取 71.89 mg硫酸锌溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取12.37mg磷酸溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取4.76mg／L g二水合氯化钴溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取62.42 mg／L五水合硫酸铜溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取84.51mg一水合硫酸锰溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取7.26mg／L二水合钼酸钠溶于少量溶剂中使之完全溶解；将溶解的硫酸锌溶液、磷酸溶液、二水合氯化钴溶液、五水合硫酸铜溶液、一水合硫酸锰溶液和二水合钼酸钠溶液混合在一起，用溶剂定容至1 L配成D溶液母液，使硫酸锌浓度为71.89 mg／L，磷酸浓度为12.37mg／L，二水合氯化钴浓度为4.76mg／L，五水合硫酸铜浓度为62.42 mg／L，一水合硫酸锰浓度为84.51mg／L，二水合钼酸钠浓度为7.26mg／L；
（5）使用时，取10ml A溶液母液、10ml B溶液母液、100µl C溶液母液、100µl D溶液母液，依次溶于900mL溶剂，使A液硝酸钾浓度为500mg/L、磷酸氢二钾浓度为20mg/L、七水合硫酸镁浓度为100mg/L，B液六水合氯化钙浓度为80mg/L，C液乙二胺四乙酸二钠浓度为372μg/L、七水合硫酸铁浓度为417μg/L，D液硫酸锌浓度为7.189μg/L、磷酸浓度为1.237μg/L、二水合氯化钴浓度为0.476μg/L、五水合硫酸铜浓度为6.242μg/L、一水合硫酸锰浓度为8.451μg/L、二水合钼酸钠浓度为0.726μg/L；用pH计调节pH为6.9-7.1，然后用于接种所需培养的雨生红球藻藻种。
进一步的，所述的浓度分别为600μg/ml链霉素、卡那霉素、庆大霉素、氨苄青霉素4种抗生素的配制方法具体包括以下步骤：
（1）配制60g/L抗生素母液：称取6g链霉素溶于100mL超纯水中使之完全溶解；称取6g卡那霉素溶于100mL超纯水中使之完全溶解；称取6g庆大霉素溶于100mL超纯水中使之完全溶解；称取6g氨苄青霉素溶于100mL超纯水中使之完全溶解；使链霉素浓度为60g/L、卡那霉素浓度为60g/L、庆大霉素浓度为60g/L、氨苄青霉素浓度为60g/L；采用抽滤方式除菌；
（2）使用时，取1mL链霉素抗生素母液、1mL卡那霉素抗生素母液、1mL庆大霉素抗生素母液、1mL氨苄青霉素抗生素母液，依次溶于96mL MCM培养基中，使链霉素浓度为600μg/ml、卡那霉素浓度为600μg/ml、庆大霉素浓度为600μg/ml、氨苄青霉素浓度为600μg/ml。
进一步的，所述的所述的固体培养基的配制方法具体包括以下步骤：
称取5g蛋白胨、1g酵母膏、9g氯化钠，依次溶于1000mL蒸馏水中，使蛋白胨浓度为5g/L，酵母膏浓度为浓度为1g/L，氯化钠浓度为9g/L，使用pH计调节pH为7.2，然后称取20g琼脂溶于次溶液中，使琼脂的浓度为20g/L。
进一步的，所述的联合使用抗生素对雨生红球藻纯化处理，在光照培养箱中，温度为20℃，光照强度为60µmol·m-2·s-1，光暗周期为14h：10h，处理时间为72h。
进一步的，所述的摇床转速为180r/min，时间为72h。
进一步的，所述的联合抗生素施用方法用于雨生红球藻藻种纯化。
本发明所述的联合抗生素施用方法，操作简单，效果显著；在MCM培养基中施用联合抗生素，培养藻种生长率和生物量积累高，特别有利于获得雨生红球藻纯种，为相关科学研究提供大量实验材料。
具体实施方式
下面结合实例来对本发明联合抗生素的施用方法及获得雨生红球藻纯种进行具体的描述：
实施例1：
一种适用于施用联合抗生素和培养雨生红球藻纯种的MCM培养基配制，包括以下步骤：
（1）配制A溶液母液：称取50g硝酸钾溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取2g磷酸二氢钾溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取10g七水合硫酸镁溶于少量溶剂中使之完全溶解；将溶解的硝酸钾溶液、磷酸磷酸二氢钾溶液和七水合硫酸镁溶液混合在一起，用溶剂定容至1 L配成A液母液，使硝酸钾浓度为50g/L，磷酸二氢钾浓度为2g/L，七水合硫酸镁浓度为10g/L；
（2）配制B溶液母液：称取8g六水合氯化钙溶于少量溶剂中使之完全溶解，用溶剂定容至1L配成B液母液，使六水合氯化钙浓度为8g/L；
（3）配制C溶液母液：称取3.72g乙二胺四乙酸二钠溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取 4.17g七水合硫酸铁溶于少量溶剂中使之完全溶解；将溶解的乙二胺四乙酸二钠溶液和七水合硫酸铁溶液混合在一起，用溶剂定容至1 L配成C溶液母液，使乙二胺四乙酸二钠浓度为3.72g/L，七水合硫酸铁为4.17g/L；
（4）配制D溶液母液：称取 71.89 mg硫酸锌溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取12.37mg磷酸溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取4.76mg／L g二水合氯化钴溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取62.42 mg／L五水合硫酸铜溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取84.51mg一水合硫酸锰溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取7.26mg／L二水合钼酸钠溶于少量溶剂中使之完全溶解；将溶解的硫酸锌溶液、磷酸溶液、二水合氯化钴溶液、五水合硫酸铜溶液、一水合硫酸锰溶液和二水合钼酸钠溶液混合在一起，用溶剂定容至1 L配成D溶液母液，使硫酸锌浓度为71.89 mg／L，磷酸浓度为12.37mg／L，二水合氯化钴浓度为4.76mg／L，五水合硫酸铜浓度为62.42 mg／L，一水合硫酸锰浓度为84.51mg／L，二水合钼酸钠浓度为7.26mg／L；
（5）使用时，取10ml A溶液母液、10ml B溶液母液、100µl C溶液母液、100µl D溶液母液，依次溶于900mL溶剂，使A液硝酸钾浓度为500mg/L、磷酸氢二钾浓度为20mg/L、七水合硫酸镁浓度为100mg/L，B液六水合氯化钙浓度为80mg/L，C液乙二胺四乙酸二钠浓度为372μg/L、七水合硫酸铁浓度为417μg/L，D液硫酸锌浓度为7.189μg/L、磷酸浓度为1.237μg/L、二水合氯化钴浓度为0.476μg/L、五水合硫酸铜浓度为6.242μg/L、一水合硫酸锰浓度为8.451μg/L、二水合钼酸钠浓度为0.726μg/L；用pH计调节pH为6.9-7.1，然后用于接种所需培养的雨生红球藻藻种。
表1：本发明MCM培养基配方含中文名与化学式对照表:
MCM培养基配方
MCM medium composition
实施例2：本发明联合抗生素母液的配制和施用方法：
（1）配制60g/L抗生素母液：称取6g链霉素溶于100mL超纯水中使之完全溶解；称取6g卡那霉素溶于100mL超纯水中使之完全溶解；称取6g庆大霉素溶于100mL超纯水中使之完全溶解；称取6g氨苄青霉素溶于100mL超纯水中使之完全溶解；使链霉素浓度为60g/L、卡那霉素浓度为60g/L、庆大霉素浓度为60g/L、氨苄青霉素浓度为60g/L；采用抽滤方式除菌；
（2）使用时，取1mL链霉素抗生素母液、1mL卡那霉素抗生素母液、1mL庆大霉素抗生素母液、1mL氨苄青霉素抗生素母液，依次溶于96mL MCM培养基中，使链霉素浓度为600μg/ml、卡那霉素浓度为600μg/ml、庆大霉素浓度为600μg/ml、氨苄青霉素浓度为600μg/ml。
实施例3：本发明雨生红球藻纯种的获得方法：
（1）准备：6个100ml已高压灭菌透明玻璃锥形瓶，透明玻璃锥形瓶内加入95ml上述MCM培养基，并依次加入上述1mL链霉素抗生素母液、1mL卡那霉素抗生素母液、1mL庆大霉素抗生素母液、1mL氨苄青霉素抗生素母液，使之混合均匀；
（2）接种：第1天每锥形瓶分别接种1ml雨生红球藻藻液，藻液含雨生红球藻绿色营养生长阶段藻种；
（3）培养：将6个锥形瓶放在摇床上，摇床转速180r/min；摇床放置在光照培养箱中培养，采用日灯光作为光源，光暗周期14:10，温度20℃，光强60μmol·m-2·s-1；
（4）制备固体培养基：称取5g蛋白胨、1g酵母膏、9g氯化钠，依次溶于1000mL蒸馏水中，使蛋白胨浓度为5g/L，酵母膏浓度为浓度为1g/L，氯化钠浓度为9g/L，使用pH计调节pH为7.2，然后称取20g琼脂溶于次溶液中，使琼脂的浓度为20g/L；
（5）细菌检验: 培养3天后，采用平板划线法在固体培养基上检测除菌效果，最终获得纯种雨生红球藻藻落。