一种提高发酵乳杆菌dali02粘附能力的方法
阅读说明：本技术 一种提高发酵乳杆菌dali02粘附能力的方法 (Method for improving adhesion capacity of lactobacillus fermentum DALI02 ) 是由 顾瑞霞 刘潇潇 陈大卫 瞿恒贤 张龙飞 刘洋 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种提高发酵乳杆菌DALI02粘附能力的方法,在发酵原料、MRS培养基中添加复合低聚糖参与发酵乳杆菌DALI02发酵剂的发酵,得到提高粘附能力的发酵乳杆菌DALI02发酵液；所述发酵原料包括原料乳、乳清蛋白水解液；原料乳制备时,将10%～14%的脱脂乳粉溶于50℃的水中,充分混匀过筛后,经95℃热处理5～10 min,冷却至37℃,得到原料乳；乳清蛋白水解液制备时：将8%～12%的乳清蛋白粉溶于50℃的水中,用0.1 mol/L的NaOH调节pH为6～8,添加木瓜蛋白酶,加酶量为2000～8000 U/g,水解温度为60～70℃,酶解时间为2～5 h,控制水解度为10%～30%,进行灭酶,离心后取上清液,得到乳清蛋白水解液；通过本发明,本发明可以提高发酵乳杆菌DALI02粘附能力,用于制备发酵乳等活菌产品。(The invention provides a method for improving the adhesion capacity of lactobacillus fermentum DALI02, which is characterized in that compound oligosaccharide is added into a fermentation raw material and an MRS culture medium to participate in the fermentation of a lactobacillus fermentum DALI02, so as to obtain lactobacillus fermentum DALI02 fermentation liquor with improved adhesion capacity; the fermentation raw materials comprise raw milk and whey protein hydrolysate; when the raw material milk is prepared, 10-14% of skim milk powder is dissolved in water at 50 ℃, fully mixed and sieved, then subjected to heat treatment at 95 ℃ for 5-10 min, and cooled to 37 ℃ to obtain the raw material milk; when the whey protein hydrolysate is prepared: dissolving 8-12% of whey protein powder in water at 50 ℃, adjusting the pH value to 6-8 by using 0.1 mol/L NaOH, adding papain, controlling the hydrolysis degree to be 10-30%, carrying out enzyme deactivation, centrifuging, and taking supernatant to obtain whey protein hydrolysate, wherein the enzyme addition amount is 2000-8000U/g, the hydrolysis temperature is 60-70 ℃, the enzymolysis time is 2-5 h, and the hydrolysis degree is 10-30%; according to the invention, the adhesion capability of the lactobacillus fermentum DALI02 can be improved, and the lactobacillus fermentum DALI02 can be used for preparing live bacteria products such as fermented milk.)
技术领域
本发明提供一种提高发酵乳杆菌DALI02粘附能力的方法，属于食品生物发酵与功能食品领域。
技术背景
发酵乳杆菌DALI02（Lactobacillus fermentum DALI02）属乳杆菌属，为革兰氏阳性菌杆菌，兼性厌氧。发酵乳杆菌是肠道固有乳酸杆菌之一，对宿主健康有着重要影响的益生菌。
益生菌被定义为“当以足够的量摄入时，能给宿主带来健康益处的活微生物”，而益生元是“被宿主微生物选择性利用并带来健康益处的底物”。随着新的研究证实，益生元具有减肥、免疫调节、维持儿童健康等各个方面的作用。
尽管益生菌对宿主的粘附能力并不一定能确保健康，但是益生菌对肠粘膜的附着可以通过竞争宿主细胞结合位点对肠道病原体具有潜在的保护作用。此外，益生菌的粘附能力可以增加与宿主相互作用的机会，导致暂时定居，增加它们在肠道中的转运时间，以发挥其预期的有益效果。例如，这种暂时定居有利于益生菌产生短链脂肪酸等代谢物，以及细菌表面分子的免疫调节作用，细菌表面分子作为肠道上皮中宿主受体的配体，诱导信号通路。另一方面，作为益生元的寡糖也可以增强益生菌菌株的粘附能力，这表明开发新的共生产品可能是增加益生菌在肠道中停留时间的潜在工具。此外，益生元还可以充当诱饵受体，抑制一些病原菌粘附到肠道上。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术存在的缺陷，提供一种提高发酵乳杆菌DALI02粘附能力的方法。
本发明是这样实现的：一种提高发酵乳杆菌DALI02粘附能力的方法，其特征在于，在发酵原料、MRS培养基中添加复合低聚糖参与发酵乳杆菌DALI02发酵剂的发酵，得到高粘附能力的发酵乳杆菌DALI02发酵液；
所述发酵原料包括原料乳、乳清蛋白水解液；
原料乳制备时，将10%~14%的脱脂乳粉溶于50℃的水中，充分混匀过筛后，经95℃热处理5~10 min，冷却至37℃，得到原料乳；
乳清蛋白水解液制备时：将8%~12%的乳清蛋白粉溶于50℃的水中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH为6~8，添加木瓜蛋白酶，加酶量为2000~8000 U/g，水解温度为60~70℃，酶解时间为2~5 h，控制水解度为10%~30%，进行灭酶，离心后取上清液，得到乳清蛋白水解液；
所述复合低聚糖添加量为：0.03%~0.09%w/w低聚果糖、0.10%~0.20%w/w低聚半乳糖、0.20%~0.40%w/w菊粉、0.10%~0.30%w/w水苏糖、0.30%~0.90%w/w低聚木糖；
发酵乳杆菌DALI02发酵剂制备时，将1代菌株按3%接种量接种于MRS液体培养基，置于37℃培养箱培养18 h，得到发酵乳杆菌DALI02发酵剂；
其中，MRS液体培养基制备时，将大豆蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、葡萄糖20 g、Tweeen 80 1 mL、磷酸二氢钠2 g、无水乙酸钠5 g、柠檬酸三胺2 g、硫酸锰0.02 g、硫酸镁 0.1 g加入蒸馏水1 L，调节pH至6.2左右，121℃、15 min灭菌。
复合低聚糖添加到原料乳、乳清蛋白水解液以及MRS培养基基质中，经105℃热处理5~10 min后，接种2%~5%的发酵乳杆菌DALI02发酵剂，经37℃培养18~28 h发酵制备而成，得到提高粘附能力的发酵乳杆菌DALI02发酵液。
所述发酵乳杆菌DALI02可用于制备具有较优粘附能力的活菌制剂产品。
发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum在2018年7月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物探究所，保藏号为CGMCC 16064。
本发明方法先进科学，通过本发明，本发明的目的是在于提供一种提高发酵乳杆菌DALI02粘附能力的方法。本发明所用的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum在2018年7月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物探究所，保藏号为CGMCC 16064。
本发明涉及以下培养基：
1、MEM完全培养基：77%MEM、20%优质胎牛血清、1%MEM非必需氨基酸溶液、1%丙酮酸钠溶液、1%GlutaMAX谷氨酰胺添加剂，4℃贮藏备用。用于Caco-2细胞的培养。
2、PBS溶液：800 mL蒸馏水中加入NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4•12H2O 1.44 g，K2HPO4 0.24g，定容至1000 mL，调节pH为7.4左右，121℃、15 min灭菌，4℃贮藏备用。用于Caco-2细胞的洗涤。
3、MRS液体培养基：大豆蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、葡萄糖20 g、Tweeen80 1 mL、磷酸二氢钠2 g、无水乙酸钠5 g、柠檬酸三胺2 g、硫酸锰0.02 g、硫酸镁 0.1 g，蒸馏水1 L，调节pH至6.2左右，121℃、15 min灭菌。用于乳酸菌的培养。
4、MRS固体培养基：大豆蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母膏5 g、葡萄糖20 g、Tweeen80 1 mL、磷酸二氢钠2 g、无水乙酸钠5 g、柠檬酸三胺2 g、硫酸锰0.02 g、硫酸镁 0.1 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L，调节pH至6.2左右，121℃、15 min灭菌。用于乳酸菌的计数。
一、菌株的活化传代；
1、发酵乳杆菌DALI02：将1代菌株按3%接种量接种于MRS液体培养基，置于37℃培养箱培养18 h，备用。
二、Caco-2细胞的培养与传代；
1、培养条件：Caco-2细胞使用MEM完全培养基，接种至细胞培养瓶，于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。当细胞聚合度达到80%~90%时，用胰酶消化液将其消化，用细胞培养液调整至合适浓度，备用。
2、Caco-2细胞的传代：传代前需在倒置显微镜下观察细胞培养瓶内细胞的生长情况。若细胞未铺满整个培养板的底部，则继续培养，直到细胞聚合度达到80%~90%，方可进行传代。具体操作如下：
（1）弃去细胞培养瓶内细胞培养液，用2 mL无菌PBS溶液洗涤1次。
（2）倒出PBS溶液，加入1 mL胰酶消化液，于37℃培养箱孵育3 min，倒置显微镜下观察消化效果，以大部分细胞形态为圆形且均匀分散于细胞培养瓶底部为消化结束。
（3）向培养瓶中加入3 mL细胞培养液进行终止消化。
（4）将消化完成的所有液体吸至15 mL无菌离心管，进行1000 r/min离心2~3 min。
（5）弃上清液，加入2 mL细胞培养液，轻轻吹打均匀后，均分至新的培养瓶中，分别向新的培养瓶内补充5 mL细胞培养液，按上述培养条件进行培养。
三、发酵原料的制备；
1、原料乳的制备：
将10%~14%的脱脂乳粉溶于50℃的水中，充分混匀过筛后，经95℃热处理5~10min，冷却至37℃，备用。
2、乳清蛋白水解液的制备；
将8%~12%的乳清蛋白粉溶于50℃的水中，用0.1 mol/L的NaOH调节pH为6~8，添加木瓜蛋白酶，加酶量为2000~8000 U/g，水解温度为60~70℃，酶解时间为2~5 h，控制水解度为10%~30%，进行灭酶，离心后取上清液备用。
四、发酵原料的制备；
向原料乳、乳清蛋白水解液以及MRS培养基中添加复合低聚糖，复合低聚糖添加量为0.03%~0.09%低聚果糖、0.10%~0.20%低聚半乳糖、0.20%~0.40%菊粉、0.10%~0.30%水苏糖、0.30%~0.90%低聚木糖，充分混匀后，备用。
五、原料热处理与发酵；
原料经105℃热处理5~10 min后，接种2%~5%的发酵乳杆菌DALI02发酵剂，在37℃培养18~28 h，即为发酵乳杆菌DALI02发酵液。
六、粘附能力的测定；
1、将上述离心后的Caco-2细胞用MEM完全培养基调整浓度为2×105 cell/mL，接种于24孔细胞培养板，于37℃、5%CO2培养箱中进行培养至形成单层细胞。向孔内轻轻加入500 μL已稀释100倍的发酵液（1×107 CFU/mL），于37℃、5%CO2培养箱中进行培养2 h。弃去孔内液体，然后用无菌PBS溶液轻轻洗涤两次，以此除去未粘附的菌体。然后加入500 μLPBS溶液，用移液枪的枪头轻轻刮下粘附的细胞，制成细胞悬浮液，利用稀释平皿倾注法测定菌株粘附前后的活菌数。粘附率公式如下：
2、发酵乳杆菌DALI02的粘附能力；
添加复合低聚糖的发酵乳杆菌DALI02发酵液粘附能力得到显著增强（p<0.05），发酵乳杆菌DALI02的粘附能力分别在原料乳、乳清蛋白水解液以及MRS培养基中提高了3.43倍、2.14倍以及1.85倍。具体见图1。
本发明涉及一种提高发酵乳杆菌DALI02粘附能力的方法，该方法是通过添加复合低聚糖，从而提高了发酵乳杆菌DALI02的粘附能力。本发明基于益生元与益生菌的交互作用，测定发酵乳杆菌DALI02发酵液对Caco-2细胞的粘附能力，发现发酵乳杆菌DALI02粘附能力显著提升了。本发明可以提高发酵乳杆菌DALI02粘附能力，用于制备发酵乳等活菌产品。
附图说明
图1为发酵乳杆菌DALI02在原料乳、乳清蛋白水解液以及MRS培养基中粘附率的对比（MILK：原料乳；WPH：乳清蛋白水解液；MRS：MRS培养基；COMP：复合低聚糖）。
具体实施方式
实施例1：高黏附发酵乳杆菌DALI02发酵乳；
将活化二代后的发酵乳杆菌DALI02按3%接种于经常规热处理的脱脂乳（质量浓度为12%）中，置于37℃培养40 h，于4℃备用。
在全脂乳（质量浓度为12%）中添加0.05低聚果糖、0.10%低聚半乳糖、0.40%菊粉、0.10%水苏糖、0.30%低聚木糖，充分溶解后经20 MPa压力下的均质。将均质后的复原全脂乳经95℃热处理5 min，冷却至37℃，按3%接种量接入发酵乳杆菌DALI02发酵剂，置于37℃下发酵至凝乳，冷却后于4℃贮藏，此为具有较强粘附能力的发酵乳。
实施例2：利用发酵乳杆菌DALI02制备发酵乳饮料；
制备10%的乳清蛋白粉溶液，用0.1 mol/L的NaOH调节pH为7，添加木瓜蛋白酶，加酶量为3000 U/g，水解温度为60℃，酶解时间为4 h，进行灭酶，离心后取上清液备用。在酶解乳清蛋白水解液中，添加0.03%低聚果糖、0.10%低聚半乳糖、0.40%菊粉、0.30%水苏糖、0.70%低聚木糖，混匀后，95℃热处理10 min，冷却至37℃，按2%接种量接入发酵乳杆菌DALI02发酵剂，在37℃下发酵20 h，冷却，采用无菌灌装，得到具有较强抑菌能力的发酵乳饮料。
实施例3：利用发酵乳杆菌DALI02制备活菌制剂；
制备10%的乳清蛋白粉溶液，用0.1 mol/L的NaOH调节pH为7，添加木瓜蛋白酶，加酶量为3000 U/g，水解温度为60℃，酶解时间为4 h，进行灭酶，离心后取上清液备用。在酶解乳清蛋白水解液中，添加0.03%低聚果糖、0.10%低聚半乳糖、0.40%菊粉、0.30%水苏糖、0.70%低聚木糖，混匀后，95℃热处理10 min，冷却至37℃，按2%接种量接入发酵乳杆菌DALI02发酵剂，在37℃下发酵24 h，冷却，离心，收集菌泥，加入保护剂，真空冻干至含水量小于3%，压碎成粉末状，然后再与奶粉、风味剂等制成粉状或片状等产品形式。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的保护范围。
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