一种促进微藻积累β-葡聚糖的方法
阅读说明：本技术 一种促进微藻积累β-葡聚糖的方法 (Method for promoting microalgae to accumulate beta-glucan ) 是由 姚长洪 冉秀源 王琛琪 徐若瑄 谢通慧 张永奎 于 2021-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种促进微藻积累β-葡聚糖的方法,微藻在硫限制培养液中,以通入空气中的CO-(2)为唯一碳源,连续光照条件下进行培养,使微藻细胞生长并积累β-葡聚糖。与常规氮限制诱导方式相比,细胞β-葡聚糖含量提高了110～130％,β-葡聚糖产率提高了60～80％；与常规磷限制诱导方式相比,细胞β-葡聚糖含量提高了280～740％,β-葡聚糖产率提高了31～270％,最高含量可达到细胞干重的60.98～82.06％,β-葡聚糖最高产率可达到0.16～0.22g·L～(-1)·d～(-1)。(The invention discloses a method for promoting microalgae to accumulate beta-glucan, wherein the microalgae is in a sulfur-limited culture solution and is introduced with CO in the air 2 Is used as the only carbon source, and is cultured under the condition of continuous illumination, so that the microalgae cells grow and accumulate the beta-glucan. Compared with the conventional nitrogen limitation induction mode, the content of beta-glucan in the cells is increased by 110-130%, and the yield of beta-glucan is increased by 60-80%; compared with the conventional phosphorus-limited induction mode, the content of beta-glucan in the cells is improved by 280-740%, the yield of beta-glucan is improved by 31-270%, the highest content can reach 60.98-82.06% of the dry weight of the cells, and the highest yield of beta-glucan can reach 0.16-0.22 g.L ‑1 ·d ‑1 。)
技术领域
本发明属于微藻技术领域，具体涉及一种促进微藻积累β-葡聚糖的方法。
背景技术
β-葡聚糖具有提高机体免疫力、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等生物活性。β-葡聚糖丰富的生物活性，使其在医药、食品、化妆品等行业具有巨大的应用潜力。目前β-葡聚糖主要以植物(包括青稞、小麦等)、真菌(蘑菇、酵母菌等)的细胞壁和海带等为原料提取。这些原料中，β-葡聚糖含量较低(<干重的30％)，且含有几丁质等其它杂多糖，提取过程复杂，环境不友好，产量和品质受天气和季节的影响，产品质量难以控制。受生产技术的阻碍，β-葡聚糖的应用尚未获得实质性的增长。因此，提高原料中β-葡聚糖的含量、产量和产率及生物活性迫在眉睫。
海洋微藻是一种分布广泛的光合生物，它们能够通过光合作用将CO2和太阳光转化成生物质并释放氧气，具有生长迅速，光合效率高、适应性强、不与粮争地、易于人工控制、后续附加值高等优点，与传统的通过从植物或真菌产β-葡聚糖的方式相比，微藻被认为是β-葡聚糖的潜在来源，有如下几个原因：①与高等植物相比，微藻生长迅速，部分微藻(如金藻和硅藻)能够在特定条件(如高光、低营养等)下于液泡中快速积累大量β-葡聚糖；②与真菌相比，从微藻中提取β-葡聚糖不含几丁质等其它杂多糖，提取过程相对简单；③无论时间和天气如何变化，均一生物量都是以恒定的速度产生的，更适合于精确设计的工业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种促进微藻积累β-葡聚糖的方法，从而提高β-葡聚糖的产量。
本发明的技术方案为：一种促进微藻积累β-葡聚糖的方法，微藻在硫限制培养液中，以通入空气中的CO2为唯一碳源，连续光照条件下进行培养，使微藻细胞生长并积累β-葡聚糖。
进一步地，所述硫限制培养液组成为：控制在0～4mg/L；其它营养成分配方如下：Fe3+0.33～0.98mg/L，EDTA·2Na 2.18～6.54mg/L，Cu2+1.95～5.84μg/L，Zn2+4.42～13.28μg/L，Co2+1.24～3.72μg/L，Mn2+30.46～91.38μg/L，维生素B12 0.5～1.5μg/L，维生素B1 0.1～0.3mg/L，生物素0.5～1.5μg/L，Na+7.37～12.33g/L，Cl-13.29～24.31g/L， Mg2+0.53～1.59g/L，Ca2+0.19～0.57g/L，K+94.19～310.31mg/L，Br-28.91～92.10mg/L，
进一步地，所述光照强度为50～200μmol E·m-2·s-1。
进一步地，所述通入空气中CO2体积含量1％～3％。
进一步地，培养时间为2-6天，在细胞进入稳定期时收获微藻细胞。
进一步地，微藻细胞初始接种密度OD7500.6～1.2。
进一步地，所述微藻为金藻(Isochrysis)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、与现有的诱导方式(如氮限制和磷限制)相比，硫限制下微藻β-葡聚糖含量和产率更高。与常规氮限制诱导方式相比，细胞β-葡聚糖含量提高了110～130％，β-葡聚糖产率提高了60～80％；与常规磷限制诱导方式相比，细胞β-葡聚糖含量提高了280～740％，β-葡聚糖产率提高了31～270％，最高含量可达到细胞干重的60.98～82.06％，β-葡聚糖最高产率可达到0.16～0.22g·L-1·d-1。
2、本发明采用微藻光自养的培养方式，CO2做为唯一碳源，从而实现CO2减排，缓解温室效应，对环境友好。
3、本发明中培养微藻诱导β-葡聚糖积累的方法简便易操作，下游分离提取简单，有较好的应用性。
附图说明
图1为本发明在低光强下，湛江等鞭金藻实验组和三组对照组β-葡聚糖含量随时间变化比较。
图2为本发明在低光强下，湛江等鞭金藻实验组和三组对照组β-葡聚糖产量随时间变化比较。
图3为本发明在低光强下，湛江等鞭金藻实验组和三组对照组β-葡聚糖产率随时间变化比较。
图4为本发明在高光强下，湛江等鞭金藻实验组和三组对照组β-葡聚糖含量随时间变化比较。
图5为本发明在高光强下，湛江等鞭金藻实验组和三组对照组β-葡聚糖产量随时间变化比较。
图6为本发明在高光强下，湛江等鞭金藻实验组和三组对照组β-葡聚糖产率随时间变化比较。
图7为本发明在高光强下，湛江等鞭金藻在不同硫浓度培养液中β-葡聚糖含量随时间变化比较。
图8为本发明在高光强下，湛江等鞭金藻在不同硫浓度培养液中β-葡聚糖产量随时间变化比较。
图9为本发明在高光强下，湛江等鞭金藻在不同硫浓度培养液中β-葡聚糖产率随时间变化比较。
图10为本发明在高光强下，湛江等鞭金藻不同初始接种密度β-葡聚糖含量随时间变化比较。
图11为本发明在高光强下，湛江等鞭金藻不同初始接种密度β-葡聚糖产量随时间变化比较。
图12为本发明在高光强下，湛江等鞭金藻不同初始接种密度β-葡聚糖产率随时间变化比较。
其中：S-：代表硫限制；P-：代表磷限制；N-：代表氮限制；全：对照组，代表无限制。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
本发明以湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)为实验材料，在光生物反应装置中，利用气体中的CO2及添加营养盐的培养方式，连续照光，使微藻积累β-葡聚糖。气源为空气压缩机和CO2气瓶，其流量通过管路上设置的气体减压阀和气体流量计控制；由气压缩机产生的空气与来自于气瓶的CO2经过流量调节达到所需CO2浓度后导入反应器。
营养盐母液的配制：配制成分和浓度如表1所示。
表1营养盐母液配方
注：母液5维生素经过无菌0.22μm膜过滤除菌后备用，其余母液115℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后备用。
实施例1
考察低光强(80μmol E·m-2·s-1)条件下不同营养元素限制对湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)β-葡聚糖积累的影响。
(1)藻细胞种子液的获得
人工海水的配制：NaCl 21.22g/L，NaHCO3 0.174g/L，MgCl2·6H2O 9.034g/L，CaCl2 1.033g/L，Na2SO4 3.407g/L，KCl 0.357g/L，KBr 0.0862g/L，H3BO3 0.023g/L，115℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后备用。
向配制的人工海水中加入营养盐母液，得到藻细胞种子培养液，该藻细胞种子培养液组成为：NaNO3 600mg/L，NaH2PO4 20mg/L，FeCl3.6H2O 3.15mg/L，EDTA·2Na 4.36mg/L，CuSO4 0.0098mg/L，Na2MoO4 0.0063mg/L，ZnSO4 0.022mg/L，CoCl2·6H2O 0.01mg/L，MnCl2·4H2O 0.18mg/L，维生素B12 0.001mg/L，维生素B1 0.2mg/L，生物素0.001mg/L，Na2SiO3 30mg/L，NaCl 21.22g/L，NaHCO3 0.174g/L，MgCl2·6H2O 9.034g/L，CaCl2 1.033g/L，Na2SO4 3.407g/L，KCl 0.357g/L，KBr 0.0862g/L，H3BO3 0.023g/L。
藻细胞种子液的培养：挑取平板分离纯化的湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)单藻落，接入藻细胞种子培养液中，在摇瓶中逐级放大培养，培养条件为：温度25℃，持续光照强度为40μmol E·m-2·s-1，静置培养，每天手工摇动3次以上。
(2)光生物反应装置培养
设置硫限制、磷限制、氮限制、全营养四个培养条件，每个条件设置3个平行。为实现不同培养条件，以不同方式向硫限制人工海水中添加母液及盐类，母液及盐类的添加方式如表2所示：
表2母液及盐类的添加方式
注：+代表添加，-代表不添加。NaCl添加量为2.8g/L，Na2SO4添加量为3.4g/L。母液1添加量为8mL/L，母液2添加量为4mL/L，母液3、4、5添加量均为1mL/L。
硫限制人工海水的配制：NaCl 21.22g/L，NaHCO3 0.174g/L，MgCl2·6H2O 9.034g/L，CaCl2 1.033g/L，KCl 0.357g/L，KBr 0.0862g/L，H3BO3 0.023g/L，115℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后备用。
配置完成的四种培养液组成如下：
硫限制培养液组成为：Fe3+0.64mg/L，EDTA·2Na 4.36mg/L，Cu2+3.88μg/L，Zn2+8.85μg/L，Co2+2.47μg/L，Mn2+60.92μg/L，维生素B12 1μg/L，维生素B1 0.2mg/L，生物素1μg/L，Na+9.67g/L，Cl-20.27g/L，Mg2+1.06g/L，Ca2+0.37g/L，K+215.13mg/L，Br-57.94mg/L，
磷限制培养液组成为：Fe3+0.64mg/L，EDTA·2Na 4.36mg/L，Cu2+3.88μg/L，Zn2+8.85μg/L，Co2+2.47μg/L，Mn2+60.92μg/L，维生素B12 1μg/L，维生素B1 0.2mg/L，生物素1μg/L，Na+9.67g/L，Cl-20.27g/L，Mg2+1.06g/L，Ca2+0.37g/L，K+215.13mg/L，Br-57.94mg/L，
氮限制培养液组成为：Fe3+0.64mg/L，EDTA·2Na 4.36mg/L，Cu2+3.88μg/L，Zn2+8.85μg/L，Co2+2.47μg/L，Mn2+60.92μg/L，维生素B12 1μg/L，维生素B1 0.2mg/L，生物素1μg/L，Na+9.67g/L，Cl-20.27g/L，Mg2+1.06g/L，Ca2+0.37g/L，K+215.13mg/L，Br-57.94mg/L，
全营养培养液组成为：Fe3+0.64mg/L，EDTA·2Na 4.36mg/L，Cu2+3.88μg/L，Zn2+8.85μg/L，Co2+2.47μg/L，Mn2+60.92μg/L，维生素B12 1μg/L，维生素B1 0.2mg/L，生物素1μg/L，Na+9.67g/L，Cl-20.27g/L，Mg2+1.06g/L，Ca2+0.37g/L，K+215.13mg/L，Br-57.94mg/L，
藻细胞的培养：藻细胞种子液通过离心收获藻泥，并用硫限制人工海水洗涤三次。分别用上述硫限制、磷限制、氮限制、全营养四种培养条件的培养液重悬藻泥，随后接入115℃高压蒸汽灭菌30min后的反应器内。采用光生物反应装置进行培养，细胞接种时初始OD750为0.6，温度25℃，低光强(80μmol E·m-2·s-1)连续光照，通入空气流量0.25VVM，CO2含量2％。
(3)β-葡聚糖的提取及测定
根据Granum and Myklestad的方法提取藻细胞中的β-葡聚糖，简要步骤为：取1mL藻液，10000rpm离心3min，弃上清。用5mL0.05 mol/L H2SO4重悬藻泥，60℃水浴10min，10000rpm离心5min，上清液即为待测液。采用硫酸蒽酮法测定多糖含量，其原理为糖类在硫酸作用下，脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，然后蒽酮与糠醛或羟甲基糠醛经脱水缩合，产生蓝绿色的糠醛衍生物，颜色的深浅即可作为定量的依据。
从图1可知，低光强下，不同培养条件等鞭金藻细胞的β-葡聚糖含量呈现较大差异，与对照组(全营养)相比，磷限制实验组对等鞭金藻细胞β-葡聚糖的含量无显著提升效果，而硫限制和氮限制实验组效果明显。由图1、图2可知，硫限制实验组β-葡聚糖含量高达60.98％，产量0.44g/L；对照组(全营养)仅为2.88％，产量0.055g/L；氮限制26.52％，产量0.28g/L；磷限制7.24％，产量0.13g/L，与氮、磷限制实验组和对照组相比，硫限制条件下细胞β-葡聚糖含量分别提高了130％、740％和2017％。由图3可以看出，硫限制实验组β-葡聚糖产率高于其它实验组(除了第一天略低于氮限制实验组)，且在培养两天后达到最高0.16g·L-1·d-1，与氮、磷限制实验组和对照组相比，硫限制实验组细胞β-葡聚糖产率分别提高了80％、270％和900％。由此可以看出，与氮限制和磷限制相比，硫限制条件下，微藻β-葡聚糖含量和产率大幅度提高。
实施例2
考察高光强(150μmol E·m-2·s-1)条件下不同营养元素对湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)β-葡聚糖积累的影响。将实施例1中的低光强(80μmol E·m-2·s-1)连续光照条件改为高光强(150μmol E·m-2·s-1)连续光照，其余与实施例1完全相同。
从图4可知，高光强下，不同培养条件等鞭金藻细胞的β-葡聚糖含量呈现较大差异，与对照组(全营养)相比，各个实验组对等鞭金藻细胞β-葡聚糖的含量均有显著提升效果。由图4、图5可知，硫限制实验组β-葡聚糖含量高达82.06％，产量0.63g/L；对照组(全营养)β-葡聚糖含量仅为8.95％，产量为0.16g/L；氮限制实验组β-葡聚糖含量为39.06％，产量围为0.40g/L；磷限制实验组β-葡聚糖含量为21.58％，产量为0.54g/L；与氮、磷限制实验组和对照组相比，硫限制条件下细胞β-葡聚糖含量分别提高了110％、280％和816％。由图6可以看出，硫限制实验组β-葡聚糖产率最高可达到0.22g·L-1·d-1，与氮、磷限制实验组和对照组相比，硫限制实验组细胞β-葡聚糖产率分别提高了60％、31％和100％。由此可知，经过2～4天的培养，与氮限制和磷限制相比，硫限制条件下，微藻β-葡聚糖含量和产率大幅度提高。对比图1和图4可知，高光各个培养条件的藻细胞β-葡聚糖含量均高于低光相应培养条件的β-葡聚糖含量，由此可以看出高光和硫限制均能显著促进β-葡聚糖的积累。
实施例3
考察高光强(150μmol E·m-2·s-1)条件下，不同硫浓度培养液对湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)β-葡聚糖积累的影响。
(1)藻细胞种子液的获得
同实施例1。
(2)光生物反应装置培养
设置培养液中的硫浓度为0、1、3、5、10、20、40、60、80、100μmol/L十个浓度梯度。向硫限制人工海水中添加母液，母液1添加量为8mL/L，母液2添加量为4mL/L，母液3、4、5添加量均为1mL/L，通过添加固体Na2SO4调节培养液的硫浓度。
硫限制人工海水的配制：NaCl 21.22g/L，NaHCO3 0.174g/L，MgCl2·6H2O 9.034g/L，CaCl2 1.033g/L，KCl 0.357g/L，KBr 0.0862g/L，H3BO3 0.023g/L，115℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后备用。
藻细胞的培养：藻细胞种子液通过离心收获藻泥，并用硫限制人工海水洗涤三次。分别用不同硫浓度培养液重悬藻泥，初始接种密度OD750均为0.7，随后接入115℃高压蒸汽灭菌30min后的反应器内。采用光生物反应装置进行培养，温度25℃，高光强(150μmol E·m-2·s-1)连续光照，通入空气流量0.25VVM，CO2含量2％。
(3)β-葡聚糖的提取及测定
同实施例1。
从图7、图8和图9可知，在初始接种密度、光照、温度等基础培养条件均相同的情况下，等鞭金藻细胞的β-葡聚糖含量、产量和产率在硫浓度为0～40μmol/L时维持较高水平，培养液中的硫浓度高于40μmol/L时，等鞭金藻细胞的β-葡聚糖含量、产量和产率呈下降趋势。由此可以看出，硫浓度在0～40μmol/L范围内，β-葡聚糖含量达到40％以上，产率达到0.15g·L-1·d-1，有利于β-葡聚糖的积累。
实施例4
考察高光强(150μmol E·m-2·s-1)、硫限制条件下不同接种密度对湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)β-葡聚糖积累的影响。
(1)藻细胞种子液的获得
同实施例1。
(2)光生物反应装置培养
设置OD750为0.6、1.2、2.0、5.0四个接种密度，每个接种密度设置3个平行。向硫限制人工海水中添加母液，母液1添加量为8mL/L，母液2添加量为4mL/L，母液3、4、5添加量均为1mL/L。
硫限制人工海水的配制：NaCl 21.22g/L，NaHCO3 0.174g/L，MgCl2·6H2O 9.034g/L，CaCl2 1.033g/L，KCl 0.357g/L，KBr 0.0862g/L，H3BO3 0.023g/L，115℃高压蒸汽灭菌30min，冷却后备用。
配置好的硫限制培养液组成为：Fe3+0.64mg/L，EDTA·2Na 4.36mg/L，Cu2+3.88μg/L，Zn2+8.85μg/L，Co2+2.47μg/L，Mn2+60.92μg/L，维生素B12 1μg/L，维生素B1 0.2mg/L，生物素1μg/L，Na+9.67g/L，Cl-20.27g/L，Mg2+1.06g/L，Ca2+0.37g/L，mg/L，K+215.13mg/L，Br-57.94mg/L，
藻细胞的培养：藻细胞种子液通过离心收获藻泥，并用硫限制人工海水洗涤三次。用硫限制培养液重悬藻泥，使初始接种OD750分别为0.6、1.2、2.0、5.0，随后接入115℃高压蒸汽灭菌30min后的反应器内。采用光生物反应装置进行培养，温度25℃，高光强(150μmolE·m-2·s-1)连续光照，通入空气流量0.25VVM，CO2含量2％。
(3)β-葡聚糖的提取及测定
同实施例1。
从图10可知，不同初始接种密度条件下，等鞭金藻细胞的β-葡聚糖含量呈现较大差异，与接种密度OD750为5.0相比，接种密度OD750为0.6、1.2、2.0实验组对等鞭金藻细胞β-葡聚糖的含量提升效果明显。由图10、图11可知，接种密度OD750为0.6，实验组β-葡聚糖含量在第三天高达77.76％，产量达到0.51g/L；接种密度OD750为5.0，实验组β-葡聚糖含量仅为4.39％，产量为0.21g/L；接种密度OD750为1.2，实验组β-葡聚糖含量为45.95％，产量为0.54g/L；接种密度OD750为2.0，实验组β-葡聚糖含量为22.6％，产量为0.41g/L。从图12可以看出，接种密度OD750为0.6和1.2能达到的最大产率值极其相近，分别为0.187g·L-1·d-1和0.179g·L-1·d-1，高于接种密度OD750为2.0能达到的最大产率0.138g·L-1·d-1，远高于接种密度OD750为5.0能达到的最大产率0.042g·L-1·d-1。说明接种密度OD750在0.6～1.2之间，β-葡聚糖含量能达到40％以上，产率达到0.17g·L-1·d-1以上，有利于β-葡聚糖的积累。
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