一种提高微藻源岩藻黄素产量的方法
阅读说明：本技术 一种提高微藻源岩藻黄素产量的方法 (Method for increasing yield of fucoxanthin from microalgae ) 是由 张成武 张虎 高保燕 于 2021-09-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种提高微藻源岩藻黄素产量的方法,包括以下步骤：1)：由藻种室获得长耳齿状藻藻种,将长耳齿状藻转接于装有mL1液体培养基培养瓶中,静置培养；2)：将步骤1)培养的长耳齿状藻藻种转接至装有mL1液体培养基的1000mL的培养瓶中静置培养；3)：将步骤2)长耳齿状藻藻株接入封闭式光生物反应器中；4)：将步骤3)获得的藻种通过新鲜mL1液体培养基洗涤后,按照OD750＝0.60±0.02的初始接种密度转接至20L封闭式光生物反应器中；5)：调整红光和蓝光的功率使其比例分别为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2和9:1；6)培养过程中每天定时测定生物质浓度,为开发平价岩藻黄素产品、满足人们健康和高品质生活奠定基础。(The invention provides a method for improving the yield of fucoxanthin from microalgae, which comprises the following steps: 1): obtaining dentate auricularia longipes seeds from an algae seed chamber, transferring the dentate auricularia longipes seeds into a culture bottle filled with mL1 liquid culture medium, and standing for culture; 2): transferring the dentate ladysthum longipes strain cultured in the step 1) into a 1000mL culture bottle filled with mL1 liquid culture medium for standing culture; 3): inoculating the dentate algae strain of the step 2) into a closed photobioreactor; 4): washing the algae seeds obtained in the step 3) by using fresh mL1 liquid culture medium, and transferring the algae seeds into a 20L closed photobioreactor according to the initial inoculation density of 0.60 +/-0.02 of OD 750; 5): adjusting the power of the red light and the blue light to make the ratio of the red light to the blue light to 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 and 9:1 respectively; 6) the biomass concentration is measured every day in the culture process, and a foundation is laid for developing a flat fucoxanthin product and meeting the health and high-quality life of people.)
技术领域
本发明涉及微藻生物资源与生物技术领域，具体是指一种提高微藻源岩藻黄素产量的方法。
背景技术
岩藻黄素是一种对人体健康有多重有益作用的天然类胡萝卜素，分子式为C42H58O6，其特征是分子中含有5,6-单环氧化物和烯键。作为一种捕光色素，岩藻黄素广泛存在于大多数海洋微藻和大型海藻的细胞中。与大型海藻相比，海洋微藻不仅具有岩藻黄素含量高(可达大型海藻中含量的100倍以上)的优势，而且还具有生长速度快，光合效率高、固碳减排以及可利用光生物反应器全年生产等优点，是生产岩藻黄素的理想原材料。然而，到目前为止除了以色列Algatechnologies公司培养三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)商业化生产岩藻黄素之外，还没有其它成功案例。其主要原因是海洋微藻对温度、光照等培养条件要求苛刻，现有的培养系统(室外跑道池、管道式光生物反应器等)并不能有效控制培养条件，而且还容易污染细菌、真菌、原生动物或杂藻，导致获得的生物质浓度和岩藻黄素含量极低、甚至培养失败，进而加剧了岩藻黄素的高生产成本。为此，亟需研发一种利用海洋微藻高效生产岩藻黄素的新工艺，为开发平价岩藻黄素产品、满足人们健康和高品质生活奠定基础。
发明内容
以解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种提高微藻源岩藻黄素产量的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种提高微藻源岩藻黄素产量的方法，包括以下步骤：
1)：由藻种室获得长耳齿状藻(Odontella aurita)藻种，将长耳齿状藻(Odontella aurita)转接于装有250mLmL1液体培养基的500mL培养瓶中，静置培养4～5天，光照为30～40μmol photons m-2s-1；
2)：将步骤1)培养的长耳齿状藻(Odontella aurita)藻种转接至装有mL1液体培养基的1000mL的培养瓶中静置培养5～7天，待藻液的OD750达到2.0后，进行下一步扩种
3)：将步骤2)长耳齿状藻(Odontella aurita)藻株接入封闭式光生物反应器中，培养基为mL1液体培养基，光强70～100μmol photons m-2s-1，通入含有1％CO2的压缩空气，鼓气培养5～7天；
4)：将步骤3)获得的藻种通过新鲜mL1液体培养基洗涤后，按照OD750＝0.60±0.02的初始接种密度转接至20L封闭式光生物反应器中，培养基为mL1液体培养基，其中全光谱白光、单色红光、单色蓝光的功率均设定为100w，对应光强为306～337μmol photons m-2s-1；
5)：调整红光和蓝光的功率使其比例分别为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2和9:1，培养过程中按照0.2vvm通入含有1％CO2的压缩空气进行通气和混合；
6)培养过程中每天定时测定生物质浓度，每隔3天留样，通过离心(3500rpm，5min)收集藻细胞，然后真空冷冻干干燥获得冻干藻粉。
所述mL1培养基包括1.5g/L NaNO3，20.758g/L NaCl，3.477g/L Na2SO4，0.587g/LKCl，0.17g/L NaHCO4，9.395g/L MgCl2·6H2O，1.316g/L CaCl2·2H2O，0.0845g/L KBr，0.0225g/L H3BO3，0.0027g/L NaF，0.0214g/L SrCl2·6H2O，0.00436g/L EDTA-Na2，0.0315g/L FeCl3·6H2O，1.781×10-4g/L MnCl2·4H2O，2.3×10-5g/L ZnSO4·4H2O，1.19×10-5g/L CoCl2·6H2O，2.5×10-6g/L CuSO4·5H2O，1.84×10-6g/L Na3VO4，1.94×10-6g/LKCrO4，将上述成分加入1L去离子水，121℃、20min高温灭菌处理后，分别加入已除菌的0.6g/L NaSiO3·4H2O，0.03g/L NaH2PO4·H2O，2×10-4μg/L维生素B1，1×10-6生物素，1×10-6μg/L维生素B12)。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一株高产岩藻黄素的藻株及高产岩藻黄素的策略，其岩藻黄素产率最高可以达到9.41mg/L/d以上，是目前报道中岩藻黄素产率最高的结果。
(2)本发明利用长耳齿状藻(Odontella aurita)生产岩藻黄素具有绿色、安全的优势，而原料来源不受地理限制；同时也无季节限制，可在室内封闭式光生物反应器中全年培养、持续采收，可以满足生产岩藻黄素所需的巨大原料缺口。
(3)本发明提供一种高效生产岩藻黄素的方法，通过调整LED灯的功率，使其红光和蓝光的比例在合适范围就可以显著提高岩藻黄素产率。该方法简单、高效，同时该智能型光反应器也容易放大，易于工业化生产，可适合大规模生产。
附图说明
图1为一种提高微藻源岩藻黄素产量的方法长耳齿状藻(Odontella aurita)在20L封闭式光生物反应器培养时，LED白光、红光及蓝光对其细胞生长(A)的影响。
图2为一种提高微藻源岩藻黄素产量的方法长耳齿状藻(Odontella aurita)在20L封闭式光生物反应器培养时，LED白光、红光及蓝光对和岩藻黄素含量(B)的影响。
图3为一种提高微藻源岩藻黄素产量的方法长耳齿状藻(Odontella aurita)在20L封闭式光生物反应器培养时，不同LED红光和蓝光比例对细胞生长(A)的影响。
图4为一种提高微藻源岩藻黄素产量的方法长耳齿状藻(Odontella aurita)在20L封闭式光生物反应器培养时，不同LED红光和蓝光比例对岩藻黄素含量(B)的影响。
图5为一种提高微藻源岩藻黄素产量的方法长耳齿状藻(Odontella aurita)在20L封闭式光生物反应器培养时，不同LED红光和蓝光比例对岩藻黄素产率(C)的影响。
具体实施方式
下面用具体实施例说明本发明，并不是对本发明的限制。
一种提高微藻源岩藻黄素产量的方法，包括以下步骤：
1)：由藻种室获得长耳齿状藻(Odontella aurita)藻种，将长耳齿状藻(Odontella aurita)转接于装有250mLmL1液体培养基的500mL培养瓶中，静置培养4～5天，光照为30～40μmol photons m-2s-1；
2)：将步骤1)培养的长耳齿状藻(Odontella aurita)藻种转接至装有mL1液体培养基的1000mL的培养瓶中静置培养5～7天，待藻液的OD750达到2.0后，进行下一步扩种
3)：将步骤2)长耳齿状藻(Odontella aurita)藻株接入封闭式光生物反应器中，培养基为mL1液体培养基，光强70～100μmol photons m-2s-1，通入含有1％CO2的压缩空气，鼓气培养5～7天；
4)：将步骤3)获得的藻种通过新鲜mL1液体培养基洗涤后，按照OD750＝0.60±0.02的初始接种密度转接至20L封闭式光生物反应器中，培养基为mL1液体培养基，其中全光谱白光、单色红光、单色蓝光的功率均设定为100w，对应光强为306～337μmol photons m-2s-1；
5)：对于不同红光和蓝光比例，分别在红光和蓝光电源功率控制面板上按照表1调整红光和蓝光的功率使其比例分别为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2和9:1，培养过程中按照0.2vvm通入含有1％CO2的压缩空气进行通气和混合。
表1.不同LED红光和蓝光的功率调整参数及对应的光照强度
6)培养过程中每天定时测定生物质浓度，每隔3天留样，通过离心(3500rpm，5min)收集藻细胞，然后真空冷冻干干燥获得冻干藻粉。
所述mL1培养基包括1.5g/L NaNO3，20.758g/L NaCl，3.477g/L Na2SO4，0.587g/LKCl，0.17g/L NaHCO4，9.395g/L MgCl2·6H2O，1.316g/L CaCl2·2H2O，0.0845g/L KBr，0.0225g/L H3BO3，0.0027g/L NaF，0.0214g/L SrCl2·6H2O，0.00436g/L EDTA-Na2，0.0315g/L FeCl3·6H2O，1.781×10-4g/L MnCl2·4H2O，2.3×10-5g/L ZnSO4·4H2O，1.19×10-5g/L CoCl2·6H2O，2.5×10-6g/L CuSO4·5H2O，1.84×10-6g/L Na3VO4，1.94×10-6g/LKCrO4，将上述成分加入1L去离子水，121℃、20min高温灭菌处理后，分别加入已除菌的0.6g/L NaSiO3·4H2O，0.03g/L NaH2PO4·H2O，2×10-4μg/L维生素B1，1×10-6生物素，1×10-6μg/L维生素B12)。
实施例1：长耳齿状藻(Odontella aurita)在LED红光、蓝光及全光谱白光培养时细胞生长及岩藻黄素积累的时相变化。
实验材料：长耳齿状藻(Odontella aurita)(已进行扩种培养)
培养基的配制：1.5g/L NaNO3，20.758g/L NaCl，3.477g/L Na2SO4，0.587g/L KCl，0.17g/L NaHCO4，9.395g/L MgCl2·6H2O，1.316g/L CaCl2·2H2O，0.0845g/L KBr，0.0225g/L H3BO3，0.0027g/L NaF，0.0214g/L SrCl2·6H2O，0.00436g/L EDTA-Na2，0.0315g/LFeCl3·6H2O，1.781×10-4g/L MnCl2·4H2O，2.3×10-5g/L ZnSO4·4H2O，1.19×10-5g/LCoCl2·6H2O，2.5×10-6g/L CuSO4·5H2O，1.84×10-6g/L Na3VO4，1.94×10-6g/L KCrO4，将上述成分加入1L去离子水，121℃、20min高温灭菌处理后，分别加入已除菌的0.6g/LNaSiO3·4H2O，0.03g/L NaH2PO4·H2O，2×10-4μg/L维生素B1，1×10-6生物素，1×10-6μg/L维生素B12。
试验方法：
在20L封闭式光生物反应器中，分别设置3种不同的光质，即全光谱白光、单色红光(λmax＝660nm)和单色蓝光(λmax＝460nm)。将已经扩种的长耳齿状藻(Odontella aurita)按照OD750＝0.60±0.02的初始接种密度转接入光生物反应器中(直径×高度＝16×120cm)，反应器中分别装有20L的mL1液体培养基。培养条件为昼夜持续光照，温度控制在25±0.5℃，以0.2vvm通入1％CO2的压缩空气培养9天，每一组实验设置三个重复。每天定时测定生物质浓度，每隔3天留样，通过离心(3500rpm，5min)收集藻细胞。藻体经真空冷冻干燥后，测定藻粉中岩藻黄素的含量。
藻粉中岩藻黄素含量是通过高效液相色谱(HPLC)测定的。具体步骤如下：准确称取藻粉10mg，加入95％的乙醇，在黑暗条件下磁力搅拌提取2小时。5000rpm离心5分钟，取上清于0.22μm的尼龙滤膜(Millipore)过滤后进高效液相色谱分析。色谱柱：Kromasil C18反相色谱柱，5μm粒度，250×4.6mm直径。流动相：A流动相为9:1的乙腈：水；B流动相为乙酸乙酯。梯度洗脱程序：0-20分钟100％的A洗脱液到100％B洗脱液，20-25分钟100％B洗脱液到100％A洗脱液，25-30分钟100％A洗脱液柱平衡。柱温20℃，进样体积20μL，流速1mL min-1，检测波长445nm。数据处理软件为Chromeleon Chemstation software。高效液相色谱分析所用有机溶剂均为色谱纯。通过计算样品峰面积进而计算藻粉中的岩藻黄素含量。
长耳齿状藻(Odontella aurita)在LED红光、蓝光及全光谱白光下培养时细胞生长及岩藻黄素积累的时相变化如图1～2所示。由图1～2可知，红光可以显著促进长耳齿状藻(Odontella aurita)生长，其生物量最高为3.87±0.10g/L；蓝光条件下，长耳齿状藻(Odontella aurita)获得的生物量稍低，为3.42±0.09g/L；白光条件下，长耳齿状藻(Odontella aurita)获得的生物量最低，为2.83±0.09g/L。长耳齿状藻(Odontellaaurita)的岩藻黄素含量和生长状况表现出一定的正相关，有利于生长的光质也有利于岩藻黄素积累，即红光条件下的岩藻黄素含量最高(干重的1.52％)，蓝光下的岩藻黄素次之(干重的1.47％)，白光下的岩藻黄素含量最低(干重的1.31％)。这些结果说明调整培养长耳齿状藻(Odontella aurita)的光质条件可以显著促进细胞生长和岩藻黄素积累。
实施例2：不同LED红光和蓝光比例对长耳齿状藻(Odontella aurita)生长、岩藻黄素积累量及产量的影响
实验材料：长耳齿状藻(Odontella aurita)(已进行扩种培养)
培养基的配制：1.5g/L NaNO3，20.758g/L NaCl，3.477g/L Na2SO4，0.587g/L KCl，0.17g/L NaHCO4，9.395g/L MgCl2·6H2O，1.316g/L CaCl2·2H2O，0.0845g/L KBr，0.0225g/L H3BO3，0.0027g/L NaF，0.0214g/L SrCl2·6H2O，0.00436g/L EDTA-Na2，0.0315g/LFeCl3·6H2O，1.781×10-4g/L MnCl2·4H2O，2.3×10-5g/L ZnSO4·4H2O，1.19×10-5g/LCoCl2·6H2O，2.5×10-6g/L CuSO4·5H2O，1.84×10-6g/L Na3VO4，1.94×10-6g/L KCrO4，将上述成分加入1L去离子水，121℃、20min高温灭菌处理后，分别加入已除菌的0.6g/LNaSiO3·4H2O，0.03g/L NaH2PO4·H2O，2×10-4μg/L维生素B1，1×10-6生物素，1×10-6μg/L维生素B12。。
试验方法：
在20L封闭式光生物反应器中，通过调整红光和蓝光的功率使其比例分别为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2和9:1。将已经扩种的长耳齿状藻(Odontella aurita)按照OD750＝0.60±0.02的初始接种密度转接入光生物反应器中(直径×高度＝16×120cm)，反应器中分别装有20L的mL1液体培养基。培养条件为昼夜持续光照，温度控制在25±0.5℃，以0.2vvm通入1％CO2的压缩空气培养9天，每一组实验设置三个重复。每天定时测定生物质浓度，每隔3天留样，通过离心(3500rpm，5min)收集藻细胞。藻体经真空冷冻干燥后，测定藻粉中岩藻黄素的含量。
长耳齿状藻(Odontella aurita)在不同LED红光和蓝光比例下细胞生长、岩藻黄素含量及岩藻黄素产率的时相变化如图3～5所示。由图3～5可知，红光和蓝光混合后可以显著促进长耳齿状藻(Odontella aurita)的生长，且在红光比例从1:9增加到8:2的范围内生物质浓度逐步提高，至8:2时生物质浓度最高为5.65±0.16g/L；但是红光比例进一步增加至9:1时，生物质浓度降低为4.90±0.12g/L。不同红光和蓝光比例下，长耳齿状藻(Odontella aurita)的岩藻黄素含量和生长状况也表现出一定的正相关，有利于生长的红蓝光比例也有利于岩藻黄素积累，即红光和蓝光8:2条件下的岩藻黄素含量最高(可达干重的1.62％)。岩藻黄素产率也和生物质浓度及岩藻黄素含量的结果一致，即红光和蓝光8:2条件下岩藻黄素产率最高，可达9.41mg/L/d以上，是目前报道中岩藻黄素产率最高的结果。这些结果说明调整培养长耳齿状藻(Odontella aurita)的红光和蓝光比例可以显著提高岩藻黄素产量，是一种提高微藻源岩藻黄素产量的有效方法，极具工业化应用前景。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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