一种强化微藻固碳与甘油三酯积累的方法
阅读说明：本技术 一种强化微藻固碳与甘油三酯积累的方法 (Method for enhancing carbon sequestration and triglyceride accumulation of microalgae ) 是由 耿媛媛 沈倩 聂煜东 张贤明 于 2021-08-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种强化微藻固碳及甘油三酯积累的方法,涉及微藻培养、微藻固碳以及微藻生物柴油领域。本发明主要是将体积分数为5％CO-(2)气体作为唯一碳源,向微藻培养液中添加具有固碳效果与促进光合作用的聚乙二醇溶液以及具有固碳作用的单乙醇胺溶液,该方法显著提高了微藻培养液中溶解性无机碳的浓度,微藻固碳效率,以及提升微藻生物量产率和甘油三酯含量。本发明提供聚乙二醇的主要作用是提高CO-(2)从气相到液相传质速率,提供单乙醇胺主要作用是提高微藻培养液对CO-(2)气体固定效率,继而为微藻生长和甘油三酯积累提供充足碳源。(The invention discloses a method for strengthening microalgae carbon sequestration and triglyceride accumulation, and relates to the fields of microalgae culture, microalgae carbon sequestration and microalgae biodiesel. The invention mainly uses 5 percent of CO by volume fraction 2 Adding polyethylene glycol solution with carbon fixing effect and photosynthesis promoting effect and carbon fixing monomer into microalgae culture solution with gas as sole carbon sourceThe method obviously improves the concentration of soluble inorganic carbon in the microalgae culture solution, the carbon fixation efficiency of the microalgae, and the biomass yield and the triglyceride content of the microalgae. The main function of the polyethylene glycol provided by the invention is to improve CO 2 The main effect of providing monoethanolamine is to improve the CO content of microalgae culture solution by the mass transfer rate from gas phase to liquid phase 2 Gas fixation efficiency, in turn, provides an adequate carbon source for microalgae growth and triglyceride accumulation.)
技术领域
本发明属于微藻培养领域，具体涉及一种强化微藻固碳及甘油三酯积累的方法，尤其涉及通过物理-化学吸收与生物利用CO2的方法。
背景技术
微藻固碳技术是利用微藻细胞将大量二氧化碳转化为生物质的过程。微藻作为可以进行固碳的生物之一，具有光合速率高、繁殖快、适应环境能力强等优点，相当于森林固碳能力的10～50倍。每年由微藻光合作用固定的二氧化碳占全球二氧化碳固定量的40％。但是，CO2在微藻固碳仍然存在一些技术瓶颈，如低浓度CO2气体在水中溶解度低以及微藻光合效率有限。
目前，化学吸收法因其具有较高的CO2捕集效率而备受关注。其中，最常见的化学吸收剂包括醇胺溶液、氨水、热苛性钠、氨基酸盐等。近几年来，醇胺类化合物由于其具有优异的吸收活性以及高效的CO2脱除效率在强化微藻固碳领域逐渐兴起。文献(KIM G,C HOIW,LEE C,et al.Enhancement of dissolved inorganic carbon and carbon fixationby green alga Scenedesmus sp.in the presence of alkanolamine CO2 absorbents[J].Biochemica l Engineering Journal,2013,78:18-23.)在柱状光生物反应器中通入二氧化碳培养绿藻Sce nedesmus sp.时，通过向微藻培养液中添加单乙醇胺(MEA)，MEA与通入的CO2发生化学反应生成R-NHCOO-，提高了微藻培养液中的总无机碳浓度，随着微藻细胞对培养液中碳源的消耗，R-NHCOO-会逐渐解离出CO2，进一步提供微藻细胞所需碳源。虽然该方法可以提高培养液中总无机碳源浓度，但高浓度单乙醇胺会生成氨基甲酸酯中间体对微藻细胞有毒害作用，进而降低微藻生物产率。
聚乙二醇是一种CO2物理吸收剂，其具价格低廉、无毒性以及较高的CO2溶解度等优点颇受关注。文献(Lee Y.H.,Yeh Y.L.Using polyethylene glycol as nonionicosmoticum to promote growth and lipid production of marine microalgaeNannochloropsis oculata [J].Bioprocess Biosyst Eng,2014,37(8):1669-1677)将聚乙二醇作为非离子渗透剂添加于培养基中促进了微拟球藻生长和油脂积累，且对CO2的固定效果良好。文献(Li J.,Ye Y., Chen L.,et al.Solubilities of CO2 in Poly(ethylene glycols)from(303.15to 333.15)K [J].Journal of Chemical&EngineeringData,2012,57(2):610–616.)研究结果表明聚乙二醇作为助溶剂，其在CO2捕集和降低能耗方面具有很好的前景。为了进一步提高微藻的固碳效果和油脂积累，发明人利用聚乙二醇作为非离子渗透剂，降低培养基中氧气的溶解度，进而促进光合作用，利用单乙醇胺优异的吸收活性，以及利用微藻对CO2进行资源化利用的特性相结合，发现聚乙二醇和单乙醇胺混合液添加于微藻培养液中，微藻固碳效率和培养液中总无机碳源显著增加，且降低了高浓度单乙醇胺下微藻细胞的毒害作用，进而促进微藻生物量。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有化学吸收剂(醇胺溶液)在微藻培养过程中对CO2吸收和转化效率低，以及高浓度醇胺溶液对微藻细胞产生的毒害作用，提供一种强化微藻固碳及油脂积累的方法。
本发明提供的聚乙二醇为聚乙二醇200，主要作用是强化CO2从气相到液相的溶解传质过程。
本发明强化微藻固碳及甘油三酯积累的方法，包括向pH为6-8的微藻培养液添加聚乙二醇浓度为0-2mg/L，浓度为0-100mg/L单乙醇胺溶液。
根据本发明强化微藻固碳及甘油三酯积累的方法，所述聚乙二醇和单乙醇胺水溶液在微藻接入培养液后添加于培养液中。
具体地，根据需要，在接入微藻藻种前需对微藻培养基进行灭菌。所述的培养基灭菌具体步骤是将培养基置于锥形瓶中在121℃、0.1Mpa，进行高温蒸汽灭菌20min。
根据本发明强化微藻固碳和甘油三酯积累的办法，所述方法需向锥形瓶中通入0-3 0％体积分数CO2气体。
本发明强化微藻固碳和甘油三酯积累的方法，采用曝气石鼓泡通入含CO2的气体的时间0-24h。
具体地，使用曝气石鼓泡通入含CO2的气体，所述的含CO2的气体工业排放CO2气体，烟道气，或含有CO2气体的空气中的一个或多个组合。
本发明强化微藻固碳和甘油三酯积累的方法，适用于各种产油微藻品种，包括海洋微藻、淡水微藻、海洋/淡水微藻。优选微藻葡萄藻属、杜氏藻、小球藻属、栅藻属、莱茵衣藻、隐甲藻、筒柱藻、巴夫藻、微绿球藻、等鞭金藻、三角褐指藻、螺旋藻、布朗葡萄藻、微拟球藻中的一种或多种。
根据本发明强化微藻固碳和甘油三酯积累的方法，所述的甘油三酯浓度测定的方法，具体地，取适量藻液与助溶剂混合，一定温度水浴处理一段时间后，加入一定浓度尼罗红后进行避光染色，一定时间后采用荧光分光光度计测量其在480nm处的荧光值。
进一步优选地，与藻液混合的助溶剂可以采用有机溶剂如二甲基亚砜、甲醇、乙醇、丙酮以改变微藻细胞膜通透性。
根据本发明强化微藻固碳和甘油三酯积累的方法，所涉及的微藻采收条件，是在微藻生物量趋于稳定时期。
根据本发明强化微藻固碳和甘油三酯积累的方法，所涉及的微藻采收方法，可以是常规的离心收集，也可以是采用絮凝剂收集。
根据本发明强化微藻固碳和甘油三酯积累的方法，所涉及的总无机碳浓度的测定方法，具体地，将微藻培养液收集后，采用0.45μm滤头过滤，收集适量滤液进行总无机碳浓度测定。
本发明的技术特点如下：
(1)在微藻培养过程中，碳源是影响微藻生物量产率的一个主要因素之一。本发明的方法是向微藻培养液中添加聚乙二醇和单乙醇胺水溶液，分别于与通入的CO2气体发生化学反应。聚乙二醇一方面是可以作为非离子渗透剂，降低培养基中氧气溶解度，减轻氧气对微藻生长的抑制，从而促进微藻光合作用。另外一个方面是聚乙二醇对通入培养基中的CO2气体也有吸附作用，进而强化CO2分子从气相到液相的溶解传质，提高了整个培养体系中无机碳含量。此外，聚乙二醇的添加可以降低单乙醇胺对微藻细胞生物量造成的不利影响。
(2)本发明的方法向微藻培养液中加入单乙醇胺水溶液，与通入CO2气体发生化学反应，生成R-NHOO-，显著提高了微藻培养液中总无机碳的浓度，随着微藻生长对碳源的消耗，R-NHOO-可以缓慢解离出游离CO2，以供微藻细胞生长。
本发明与现有技术相比的有益效果为：
本发明通过向使用含CO2气体作为碳源的微藻培养液中添加聚乙二醇和单乙醇胺水溶液，聚乙二醇和单乙醇胺水溶液均对CO2有吸附作用，可以最大化固定通入微藻培养液中的CO2气体，显著提高了微藻培养液中总无机碳的浓度，进而提高微藻生物量。与此同时，与专利CN104805016A、CN11195942A相比，聚乙二醇具有价格低廉、无害的特点，更有利于建立效果更优、成本更低的碳捕集和生物柴油生产技术。此外，聚乙二醇的添加能够缓解单乙醇胺对藻细胞生物量造成的负面影响。
附图说明
图1为BG11培养基中添加不同浓度聚乙二醇培养普通小球藻培养液生物量浓度。
图2为BG11培养基中添加不同浓度聚乙二醇培养普通小球藻培养液中总无机碳浓度。
图3为BG11培养基中添加不同浓度聚乙二醇培养普通小球藻甘油三酯浓度。
图4为BG11培养基中添加不同浓度单乙醇胺培养普通小球藻生物量浓度。
图5为BG11培养基中添加不同浓度单乙醇胺培养普通小球藻培养液中总无机碳浓度。
图6为BG11培养基中添加不同浓度单乙醇胺培养普通小球藻甘油三酯浓度。
图7为BG11培养基中添加0.6mg/L聚乙二醇与单乙醇胺培养普通小球藻生物量浓度。
图8为BG11培养基中添加0.6mg/L聚乙二醇与单乙醇胺培养普通小球藻培养液中总无机碳浓度。
图9为BG11培养基中添加0.6mg/L聚乙二醇与单乙醇胺培养普通小球藻甘油三酯浓度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步解释。
实施例1
本实施例强化微藻固碳及甘油三酯积累的方法具体步骤如下：
1.微藻培养：所培养的藻种为普通小球藻，来自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。将处于对数生长期的普通小球藻按照初始接种浓度约为100mg/L接种于富含营养的 BG-11培养基，由于研究其固碳特性，本发明对BG-11培养基中进行了改良，去除了原培养基中的碳源，培养基初始pH值为7.5。培养温度为30℃，光照强度为6000Lux，光照周期为14h:10h(光：暗)，整个培养周期为7天。
2.添加聚乙二醇溶液：分别向3个装有普通小球藻培养液的锥形瓶分别添加聚乙二醇溶液，聚乙二醇终浓度为0-0.6mg/L。
3.二氧化碳供给：本实施例采用本领域最为普遍的曝气石(孔径为30～60μm)进行曝气，本实施例采用体积比为5％CO2在光照培养阶段以流量为100mL/min进行通气，并持续14h。
4.培养过程中每天测定普通小球藻生长情况，并测定每天的无机碳含量和甘油三酯浓度。
如图1所示，普通小球藻在整个培养周期内，未添加聚乙二醇溶液对照组在培养7天后生物量最高可达422mg/L，添加聚乙二醇浓度分别为0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、 1mg/L培养7天后生物量分别达652mg/L、715mg/L、512mg/L，与对照组相比分别提高了54.5％、69.4％、21.3％。
如图2所示，普通小球藻在整个培养周期内，未添加聚乙二醇溶液对照组在培养7天总无机碳浓度为25.885mg/L，添加聚乙二醇浓度分别为0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L 培养7天后普通小球藻培养液中总无机碳浓度持续增加，分别是63.99mg/L、89.92mg/L、96.51mg/L。其中，添加聚乙二醇浓度分别为0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L，小球藻培养液中积累的无机碳浓度分别为30.68mg/L、50.19mg/L、53.81mg/L，分别是对照组的2.5 8倍、4.23倍、4.53倍。此外，添加聚乙二醇浓度分别为0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L最高固碳速率为266.075mg/L/d、286.26mg/L/d、170.655mg/L/d，和对照组相比，分别提高了57.56％、69.57％、11.95％。
如图3所示，普通小球藻在整个培养周期内，未添加聚乙二醇溶液对照组在培养7天后甘油三酯浓度为18.69mg/L。添加聚乙二醇浓度分别为0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/ L，普通小球藻甘油三酯浓度分别为20.21mg/L、21.88mg/L、24.35mg/L，分别是对照组的 1.08倍、1.17倍、1.30倍。
实施例2
1.微藻培养：所培养的藻种为普通小球藻，来自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。将处于对数生长期的普通小球藻按照初始接种浓度约为100mg/L接种于富含营养的 BG-11培养基，由于研究其固碳特性，本发明对BG-11培养基中进行了改良，去除了原培养基中的碳源。培养基初始pH值为7.5，培养温度为30℃，光照强度为6000Lux，光照周期为14h:10h(光：暗)，整个培养周期为7天。
2.添加聚乙二醇试剂：分别向4个装有普通小球藻培养液的锥形瓶分别添加单乙醇胺溶液，单乙醇胺溶液终浓度为0-100mg/L。
3.二氧化碳供给：本实施例采用本领域最为普遍的曝气石(孔径为30～60μm)进行曝气，本实施例采用体积比为5％CO2在光照培养开始以流量为120mL/min进行通气，并持续14h。
4.培养过程中每天测定普通小球藻生长情况，并测定每天的无机碳含量和甘油三酯浓度。
如图4所示，
普通小球藻在整个培养周期内，未添加单乙醇胺溶液对照组在培养7天后生物量最高可达422mg/L，添加单乙醇胺浓度分别为25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L、培养7天后生物量分别达443.28mg/L、571.49mg/L，491.83mg/L、387.11mg/L。50mg/L、 75mg/L、100mg/L单乙醇胺与对照组相比分别提高了5.04％、35.42％、16.55％，而高浓度 100mg/L的单乙醇胺溶液对普通小球藻生物量产生抑制作用。
如图5所示，普通小球藻在整个培养周期内，未添加单乙醇胺溶液对照组在培养7天后总无机碳浓度为25.885mg/L，添加单乙醇胺浓度分别为25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L培养7天后普通小球藻培养液中总无机碳浓度持续增加，分别是29.875mg/L、34.37mg/L、34.96mg/L、39.805mg/L。其中，添加单乙醇胺浓度分别为25mg/L、50mg/ L、75mg/L、100mg/L，小球藻培养液中积累的无机碳浓度分别为14.065mg/L、14.875m g/L、8.9mg/L、7.87mg/L，其中，低浓度25mg/L、50mg/L单乙醇胺的添加分别是对照组的1.06倍、1.12倍。此外，添加单乙醇胺浓度分别为25mg/L、50mg/L、75mg/L时，最高固碳速率为179.92mg/L/d、254.24mg/L/d、198mg/L/d，和对照组相比，分别提高了 6.58％、50.6％、17.28％。
如图6所示，普通小球藻在整个培养周期内，未添加单乙醇胺溶液对照组在培养7天后甘油三酯浓度为18.69mg/L。添加单乙醇胺浓度分别为25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L时，普通小球藻甘油三酯浓度分别为25.07mg/L、28.61mg/L、21.94mg/L、23. 09mg/L，分别是对照组的1.34倍、1.53倍、1.17倍、1.23倍。
实施例3
1.微藻培养：所培养的藻种为普通小球藻，来自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。将处于对数生长期的普通小球藻按照初始接种浓度约为100mg/L接种于富含营养的BG-11培养基，由于研究其固碳特性，本发明对BG-11培养基中进行了改良，去除了原培养基中的碳源，培养基初始pH值为7.5，培养温度为30℃，光照强度为6000Lux，光照周期为14h:10h(光：暗)，整个培养周期为7天。
2.添加聚乙二醇溶液：分别向4个装有普通小球藻培养液的锥形瓶分别添加0.6mg/L的聚乙二醇溶液和25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L单乙醇胺溶液。
3.二氧化碳供给：本实施例采用本领域最为普遍的曝气石(孔径为30～60μm)进行曝气，本实施例采用体积比为5％CO2在光照培养开始以流量为120mL/min进行通气，并持续14h。
4.培养过程中每天测定普通小球藻生长情况，并测定每天的无机碳含量和甘油三酯浓度。
如图7所示，普通小球藻在整个培养周期内，未添加聚乙二醇和单乙醇胺溶液对照组在培养7天后生物量最高可达422mg/L，添加0.6mg/L的聚乙二醇溶液和25mg/L、50 mg/L、75mg/L、100mg/L单乙醇胺溶液培养7天后生物量分别达1098.25mg/L、1289.6 4mg/L、1008.33mg/L、791.51mg/L，与对照组相比分别提高了160.25％、205.6％、138.9 4％、87.56％。
如图8所示，普通小球藻在整个培养周期内，未添加聚乙二醇和单乙醇胺溶液对照组在培养7天后总无机碳浓度为25.885mg/L，添加0.6mg/L的聚乙二醇溶液和25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L单乙醇胺溶液培养7天后普通小球藻培养液中总无机碳浓度持续增加，分别98.41mg/L、131.45mg/L、149.46mg/L、174.49mg/L。其中，小球藻培养液中积累的无机碳浓度分别为49.15mg/L、73.84mg/L、79.68mg/L、90.2mg/L，分别是对照组的3.69倍、5.55倍、5.99倍、6.78倍。此外，添加0.6mg/L的聚乙二醇溶液和2 5mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L单乙醇胺溶液培养7天后最高固碳速率为559.675 mg/L/d、651.425mg/L/d、529.287mg/L/d、393.772mg/L/d，和对照组相比，分别提255.2 2％、285.87％、213.52％、133.25％。
如图9所示，普通小球藻在整个培养周期内，未添加聚乙二醇和单乙醇胺溶液对照组在培养7天后甘油三酯浓度为18.69mg/L。添加0.6mg/L的聚乙二醇溶液和25mg/L、 50mg/L、75mg/L、100mg/L单乙醇胺溶液培养7天后普通小球藻甘油三酯浓度分别为4 0.92mg/L、52.63mg/L、58.02mg/L、63.00mg/L，分别是对照组的2.18倍、2.82倍、3.37 倍。
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