一种卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液及其制备方法与应用 (Ovalbumin-ferulic acid-polysaccharide compound emulsion as well as preparation method and application thereof ) 是由 苏东晓 黄贞贞 杨欣禧 梁思月 陈乐祺 于 2021-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液及其制备方法与应用。该方法包括如下步骤：(1)将卵清蛋白加入到水中,使蛋白质充分水合,得到卵清蛋白分散液；(2)将阿魏酸加入到水中,得到阿魏酸溶液；(3)将阿魏酸溶液加入到卵清蛋白分散液中,得到卵清蛋白-阿魏酸溶液；(4)将多糖加入水中,得到多糖溶液；(5)将卵清蛋白-阿魏酸溶液加入到多糖溶液中,得到卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物溶液；(6)将中链甘油三酯逐滴加入到卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物溶液中,得到卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液。本发明中的复合物乳液具有良好的粘弹性和贮藏稳定性,还具有高包埋率的特点,可作为载体用于传送脂溶性物质。(The invention discloses an ovalbumin-ferulic acid-polysaccharide compound emulsion as well as a preparation method and application thereof. The method comprises the following steps: (1) adding ovalbumin into water to fully hydrate the protein to obtain an ovalbumin dispersion liquid; (2) adding ferulic acid into water to obtain ferulic acid solution; (3) adding ferulic acid solution into the ovalbumin dispersion liquid to obtain ovalbumin-ferulic acid solution; (4) adding polysaccharide into water to obtain polysaccharide solution; (5) adding the ovalbumin-ferulic acid solution into the polysaccharide solution to obtain an ovalbumin-ferulic acid-polysaccharide compound solution; (6) and dropwise adding the medium-chain triglyceride into the ovalbumin-ferulic acid-polysaccharide compound solution to obtain the ovalbumin-ferulic acid-polysaccharide compound emulsion. The compound emulsion has the characteristics of good viscoelasticity and storage stability and high embedding rate, and can be used as a carrier for conveying fat-soluble substances.)
技术领域
本发明涉及食品加工技领域，特别涉及一种卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液及其制备方法与应用。
背景技术
卵清蛋白(OVA，ovalbumin)是蛋清中含量最丰富的蛋白质，具有优良的乳化和凝胶性能，被广泛用于制备纳米颗粒或纳米乳液。一些研究表明阿魏酸(FA)是卵清蛋白的交联剂，并已有卵清白蛋白偶联阿魏酸试剂的生产，但是此试剂是利用两者化学交联而成，工艺较为复杂。此外，有报道利用天然多酚类化合物竞争吸附形成的多酚-蛋白质界面层来提高乳液的稳定性。但是，多酚与蛋白质络合，可能会影响某些氨基酸的利用率，也会改变蛋白质的结构，从而影响蛋白质的功能性，络合物稳定的乳状液对环境变化也有很大影响。因此，需要研发一种天然健康且具有良好稳定性的乳液，并可用于保健品、化妆品或功能性食品的有效制剂。
蛋白质和多糖(PS)通过静电、疏水和氢键相互作用形成聚合物，而聚集多糖可以通过附着在乳液液滴上稳定乳液，从而控制胶体相互作用，增加粘度以减少液滴聚集，或对静止粒子的运动产生屈服应力。研究人员发现，利用胶原蛋白-阿魏酸和海藻酸钠可以制备出具有阻隔性好、机械强度较高的抗菌膜(CN 103554532)，并且还有研究发现多糖的加入可以显著改变乳液的流变行为，对蛋白质从本体相到界面的吸附也起着关键作用。但是，在高剪切条件下，蛋白质-多糖复合物制备的乳液结构被破坏，导致乳液严重不稳定。
目前，有研究表明多酚的羟基和多糖糖苷键的氧原子之间形成氢键，酚酸和多糖之间可以形成非共价键，不同的多糖可以通过保护或破坏电荷来影响这些相互作用，甚至可以作为添加剂来稳定胶体溶液。然而，尚未公开过利用多糖强化卵清蛋白-阿魏酸(OVA-FA)乳液的有关报道。本发明在一定程度上扩大了鸡蛋的用途，拓展了人们对于卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒功效的认知，解决了其乳液储藏稳定性差的问题，增大了社会和经济价值。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液。
本发明的再一目的在于提供所述卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液的制备方法，包括如下步骤：
(1)将卵清蛋白加入到水中，搅拌均匀，并调节pH值至7.0±0.1，然后静置使蛋白质充分水合，得到卵清蛋白分散液；
(2)将阿魏酸加入到水中，搅拌均匀，并调节pH值至7.0±0.1，得到阿魏酸溶液；
(3)将步骤(2)中得到的阿魏酸溶液加入到步骤(1)中得到的卵清蛋白分散液中，搅拌混合均匀，并调节pH值至6.0±0.1，得到卵清蛋白-阿魏酸溶液；
(4)将多糖(PS)加入水中，搅拌均匀，并调节pH值至6.0±0.1，得到多糖溶液；其中，所述的多糖为海藻酸钠(SA)，卡拉胶(KC)，透明质酸(HA)、琼胶(Agar)中的至少一种；
(5)将步骤(3)中得到的卵清蛋白-阿魏酸溶液加入到步骤(4)中得到的多糖溶液中，搅拌混合均匀，得到卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物溶液；
(6)将中链甘油三酯(MCT)逐滴加入到步骤(5)中得到的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物溶液中，搅拌混合均匀后均质，得到卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液。
步骤(1)中所述的静置使蛋白质充分水合的条件为：4℃低温静置12～24h；优选为：4℃低温静置24h。
步骤(1)、(2)和(4)中所述的水优选为去离子水。
步骤(1)、(2)和(4)中所述的搅拌的条件为：室温连续搅拌2h以上。
步骤(1)、(2)、(3)和(4)中所述的用于调节pH值的调节剂优选为0.1～1mol/L的HCl溶液和0.1～1mol/L的NaOH溶液。
步骤(1)中所述的卵清蛋白分散液的质量浓度为0.1％～20％；优选为1％。
步骤(2)中所述的阿魏酸溶液的质量浓度为0.01％～10％；优选为0.5％。
步骤(3)中所述的卵清蛋白分散液和阿魏酸溶液的体积比为4:1。
步骤(3)中所述的搅拌的条件为：500rpm～1400rpm搅拌30min～120min；优选为：800rpm～1400rpm搅拌60min～120min。
步骤(4)中所述的多糖优选为海藻酸钠(SA)和卡拉胶(KC)中的至少一种；更优选为卡拉胶(KC)。
步骤(4)中所述的多糖溶液的质量浓度为0.01％～10％；进一步优选为0.2％～10％；再进一步优选为0.5％～10％；更进一步优选为0.5％。
步骤(5)中所述的卵清蛋白-阿魏酸溶液和多糖溶液的体积比为1～12:1～8；优选为1～12:1；更优选为1:1。
步骤(5)中所述的搅拌的条件为：400rpm～1200rpm搅拌10min～120min；优选为：500rpm～1200rpm搅拌30min～120min。
步骤(6)中所述的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物溶液和中链甘油三酯(MCT)的体积比为5：1～15；优选为5：5～9；更优选为5：7～9。
步骤(6)中所述的搅拌的条件为：200rpm～1500rpm搅拌10min～100min；优选为600rpm～1200rpm搅拌30min～60min。
步骤(6)中所述的均质的条件为：2000rpm～20000rpm均质1～20min；优选为：6000rpm～16000rpm均质1～10min；更优选为：12000rpm均质2min。
一种卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液，通过上述任一项所述的方法制备得到。
所述的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液的粒径大小为1um～10um(经动态光散射(DLS)测定)。
所述的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液在食品、药品、保健品或化妆品领域中的应用。
所述的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液在制备药物传递系统中的应用。
所述的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液可以传送脂溶性多酚类化合物，脂溶性维生素类物质，脂溶性药物，与蛋白和/或多酚相互作用的药物。
一种负载药物的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液的制备方法，包括上述卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液的制备方法中的步骤(1)～(5)，以及如下步骤：
(6)将药物加入到中链甘油三酯(MCT)中，搅拌混合均匀，得到负载药物的中链甘油三酯；
(7)将步骤(6)中得到的负载药物的中链甘油三酯逐滴加入到步骤(5)中得到的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物溶液中，搅拌混合均匀后均质，得到负载药物的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物乳液。
步骤(6)中所述的药物为脂溶性多酚类化合物，脂溶性维生素类物质和脂溶性药物中的至少一种；优选为芦丁。
步骤(6)中所述的药物的用量为按每克药物配比85～90mL中链甘油三酯计算；优选为按每克药物配比87.5mL中链甘油三酯计算。
步骤(7)中所述的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物溶液和负载药物的中链甘油三酯(MCT)的体积比为5：5～9；进一步优选为5：7～9；更进一步优选为5：9。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明的卵清蛋白-阿魏酸则是利用两者之间的疏水键和氢键形成稳定的纳米颗粒，然后通过多糖强化卵清蛋白-阿魏酸乳液结构，通过变化混合比例对卵清蛋白-阿魏酸络合物与多糖之间的反应进行调控，通过调节卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物与中链甘油三酯的混合比例，从而获得粘弹性，稳定性好的卵清蛋白-阿魏酸-多糖乳液；此外，当OVA-FA-多糖与甘油三酯以5:9体积比混合制备乳液时，OVA-FA-多糖只需5ml(质量为0.035g)的物质即可包埋9mL(即9g)的甘油三酯，也就是说该卵清蛋白-阿魏酸-多糖乳液还具有高包埋率的特点。
(2)本发明过程所采用的原料均是天然生物大分子，可以降解，廉价易得，制备过程温和，无有毒有害试剂使用，反应过程易控制，生产周期短，设备投资和生产成本低，可用于食品、保健品、化妆品等多个领域。
(3)本发明所制备的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物稳定乳液具有良好的粘弹性和贮藏稳定性，与卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒稳定乳液相比，多糖的添加显著改善了卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒稳定乳液效果差的问题，避免了分层现象的发生。
(4)本发明所制备得到的卵清蛋白-阿魏酸-多糖乳液，不仅可以传送脂溶性多酚类化合物、脂溶性维生素类物质等，还可以传送脂溶性或与蛋白、多酚相互作用的药物，实现多种药物的共同传送。
附图说明
图1是卵清蛋白-阿魏酸质量浓度为1％，多糖质量浓度为0.5％，两者均在pH6.0±0.1，混合比例为12:1-1:8时，所得卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液的透光率图(图中，OVA：卵清蛋白；FA：阿魏酸；PS：多糖；SA：海藻酸钠；KC：卡拉胶；HA：透明质酸；Agar：琼胶)。
图2是卵清蛋白-阿魏酸质量浓度为1％，多糖质量浓度为0.5％，两者均在pH6.0±0.1，混合比例为(12:1)～(1:8)时，所得卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液的紫外光谱图；其中，A为海藻酸钠(SA)；B为卡拉胶(KC)；C为琼胶(Agar)；D为透明质酸(HA)。
图3是卵清蛋白-阿魏酸质量浓度为1％，多糖质量浓度为0.5％，两者均在pH6.0±0.1，混合比例为(12:1)～(1:8)时，所得卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液的红外光谱图。
图4是卵清蛋白-阿魏酸质量浓度为1％，多糖质量浓度为0.5％，两者均在pH6.0±0.1，混合比例为1:1时，所得卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液，其与中链甘油三脂以(5:1)～(5:15)体积比混合的外观图。
图5是卵清蛋白-阿魏酸质量浓度为1％，多糖质量浓度为0.5％，两者均在pH6.0±0.1，混合比例为1:1时，所得卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液，其与中链甘油三脂以(5:5)～(5:9)体积比混合的流变图。
图6是卵清蛋白-阿魏酸质量浓度为1％，多糖质量浓度为0.5％，两者均在pH6.0±0.1，混合比例为1:1时，所得卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液，其与中链甘油三脂以(5:7)～(5:9)体积比混合的微观结构图。
图7是在37℃下储存14天期间OVA-FA-SA和OVA-FA-KC以体积比为5:7和5:9稳定乳液的变化图；其中，A为乳液外观图；B为乳液粒径大小图；C为乳液电位绝对值图。
图8是卵清蛋白-阿魏酸质量浓度为1％，多糖质量浓度为0.5％，两者均在pH6.0±0.1，混合比例为1:1时，所得卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液，其与负载芦丁的中链甘油三脂以5:9体积比混合的流变图；其中，A为储能模量(又称弹性模量；G′)；B为损耗模量(又称粘性模量；G″)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明中所述的用于调节pH值的酸碱液为本领域常规的pH值调节剂，如0.1mol/L～1mol/L盐酸及氢氧化钠等。
本发明实施例中涉及卵清蛋白(生物技术级)和阿魏酸购自上海麦克林生化科技有限公司(中国，上海)；海藻酸钠、卡拉胶、透明质酸、琼胶和中链甘油三酯购于上海源叶生物科技有限公司(中国，上海)。
实施例1
(1)准确称取2g卵清蛋白(OVA)粉末，将其分散于200g去离子水中，并于室温连续搅拌2h，用酸碱液将pH调为7.0±0.1，后置于4℃低温24h，使蛋白质充分水合，以获得质量浓度为1％的卵清蛋白贮存液。
(2)称取1g阿魏酸(FA)粉末加入到200g去离子水中，并于室温下连续搅拌2h，用碱液将pH调为7.0±0.1，使阿魏酸充分混匀，以获得质量浓度为0.5％的阿魏酸溶液。
(3)将步骤(1)的卵清蛋白溶液与步骤(2)的阿魏酸溶液按4:1体积比混合，即在磁力搅拌下，将阿魏酸溶液逐滴加入到卵清蛋白溶液中，磁力搅拌速度为800rpm～1400rpm，搅拌时间为60min～120min，将卵清蛋白-阿魏酸混合溶液pH调为6.0±0.1，获得卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液。
(4)分别称取1g海藻酸钠(SA)，卡拉胶(KC)，透明质酸(HA)、琼胶(Agar)粉末，然后分别加入到200g去离子水中，并于室温下连续搅拌2h，用碱液将pH调为6.0±0.1，使多糖充分混匀，获得质量浓度均为0.5％的多糖溶液。
(5)将步骤(3)获得的卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液(OVA-FA)与步骤(4)获得的多糖溶液(PS)分别按体积比12:1、8:1、4:1、1:1、1:4和1:8混合，即在磁力搅拌下，分别将多糖溶液逐滴加入到卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液中，磁力搅拌速度为400rpm～1200rpm，搅拌时间为30～120min，得到卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物溶液。
本实施例考察了卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液和多糖溶液按不同体积比混合的透光率变化情况。不同体积比的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液的透光率和紫外光谱分别如图1和图2所示：
海藻酸钠、卡拉胶和透明质酸与卵清蛋白-多酚(阿魏酸)复合液混合比例大于1:1时，形成溶液的透光率随着卵清蛋白-多酚复合液所占比例的增加而减小，与卵清蛋白-多酚复合液的趋势相似。但是，OVA-FA-多糖的复合溶液(OVA-FA-SA、OVA-FA-KC、OVA-FA-HA、OVA-FA-Agar)透光率始终低于卵清蛋白-多酚复合液，表明多糖与卵清蛋白-多酚复合液发生了相互作用形成了复合物。低透光率归因于蛋白质和多糖之间形成凝聚物，而当透光率达到最小时，说明OVA-FA与多糖复合达到饱和。因此，多糖与OVA-FA复合的最佳混合比例为1:1(图1)。
多糖与OVA-FA的不同混合体积比对OVA的紫外光谱存在不同的影响。随着多糖添加比例的增大，OVA-FA的吸收峰依次降低。这可能是由于蛋白质与多糖发生相互作用引起的结构改变有关，通过暴露色氨酸和酪氨酸残基中的芳香杂环疏水基团，进而改变蛋白质分子的构象，导致蛋白质吸收峰降低(图2)。
实施例2
(1)准确称取2g卵清蛋白(OVA)粉末，将其分散于200g去离子水中，并于室温连续搅拌2h，用酸碱液将pH调为7.0±0.1，后置于4℃低温24h，使蛋白质充分水合，以获得质量浓度为1％的卵清蛋白贮存液。
(2)称取1g阿魏酸(FA)粉末加入到200g去离子水中，并于室温下连续搅拌2h，用碱液将pH调为7.0±0.1，使阿魏酸充分混匀，以获得质量浓度为0.5％的阿魏酸溶液。
(3)将步骤(1)的卵清蛋白溶液与步骤(2)的阿魏酸溶液按4:1体积比混合，即在磁力搅拌下，将阿魏酸溶液逐滴加入到卵清蛋白溶液中，磁力搅拌速度为800rpm～1400rpm，搅拌时间为60min～120min，将卵清蛋白-阿魏酸混合溶液pH调为6.0±0.1，获得卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液。
(4)分别称取1g海藻酸钠(SA)，卡拉胶(KC)，透明质酸(HA)、琼胶(Agar)粉末加入到200g去离子水中，并于室温下连续搅拌2h，用碱液将pH调为6.0±0.1，使多糖充分混匀，获得质量浓度均为0.5％的多糖溶液。
(5)将步骤(3)获得的卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液分别与步骤(4)获得的多糖溶液按1:1体积比混合，即在磁力搅拌下，分别将多糖溶液逐滴加入到卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液中，磁力搅拌速度为400rpm～1200rpm，搅拌时间为30～120min，得到卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合物溶液。
本实施例考察了卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液的红外光谱变化情况。卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液的红外光谱如图3所示。图3显示了OVA、OVA-FA、OVA-FA-SA、OVA-FA-KC、OVA-FA-Agar和OVA-FA-HA复合物的各自红外酰胺Ⅰ带高斯拟合。利用酰胺Ⅰ带的不同区域来计算蛋白质的二级结构。阿魏酸的添加导致OVA的α-螺旋(α-helix)和β-折叠(β-sheet)含量增加，β-翻转(β-turn)和无规则卷曲(random coil)含量降低。这可能主要是由于阿魏酸和OVA相互作用形成了有序氢键。但是，向OVA-FA络合物中添加多糖，结果发现α-螺旋含量显著降低，除琼胶外，其余多糖的加入均显著增加了β-折叠的含量。一方面，研究表明，β-折叠含量的增加导致界面张力的降低和乳液稳定性的提高，这主要是由于无序结构导致蛋白质在油-水界面的快速构象变化，从而暴露出内部结构中的疏水氨基酸，从而降低界面张力，并随着时间的推移产生较低的平衡界面张力。另一方面，β-折叠有利于氢键的形成，而氢键胶粒有利于油-水界面结构的形成，这证实了我们关于OVA-FA-多糖稳定乳液能力的发现。
实施例3
(1)准确称取2g卵清蛋白(OVA)粉末，将其分散于200g去离子水中，并于室温连续搅拌2h，用酸碱液将pH调为7.0±0.1，后置于4℃低温24h，使蛋白质充分水合，以获得质量浓度为1％的卵清蛋白贮存液。
(2)称取1g阿魏酸(FA)粉末加入到200g去离子水中，并于室温下连续搅拌2h，用碱液将pH调为7.0±0.1，使阿魏酸充分混匀，以获得质量浓度为0.5％的阿魏酸溶液。
(3)将步骤(1)的卵清蛋白溶液与步骤(2)的阿魏酸溶液按4:1体积比混合，即在磁力搅拌下，将阿魏酸溶液逐滴加入到卵清蛋白溶液中，磁力搅拌速度为800rpm～1400rpm，搅拌时间为60min～120min，将卵清蛋白-阿魏酸混合溶液pH调为6.0±0.1，获得卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液。
(4)分别称取1g海藻酸钠(SA)，卡拉胶(KC)，透明质酸(HA)、琼胶(Agar)粉末，然后分别加入到200g去离子水中，并于室温下连续搅拌2h，用碱液将pH调为6.0±0.1，使多糖充分混匀，获得质量浓度均为0.5％的多糖溶液。
(5)将步骤(3)获得的卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液(OVA-FA)分别与步骤(4)获得的多糖溶液按1:1体积比混合，即在磁力搅拌下，分别将多糖溶液逐滴加入到卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液中，磁力搅拌速度为400rpm～1200rpm，搅拌时间为30～120min，获得卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液。
(6)将步骤(5)获得的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液分别与中链甘油三酯按5:1、5:3、5:5、5:7、5:9、5:11、5:13、5:15体积比混合，即在磁力搅拌下，分别将中链甘油三酯(MCT)逐滴加入到卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液中，磁力搅拌速度为200rpm～1500rpm，搅拌时间为30min。
(7)将步骤(6)中所得的混合溶液在12000rpm条件下均质一定时间(约2min)，即可得到卵清蛋白-阿魏酸-多糖三元体系稳定的乳液。
本实施例考察油相体积分数对卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合液稳定乳液的外观情况(室温静置120min)(以OVA-FA制备的乳液为对照，即按上述方法，不加入多糖溶液直接制备OVA-FA乳液)。卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合液稳定乳液的外观如图4所示。由图4可以看出卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒稳定乳液效果较差，在所有油相体积分数下，乳液均出现了分层现象，与卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒稳定乳液相比，加入多糖后，发现在一定的油相体积分数，乳液能够较好的稳定，并且琼胶的添加并没有改善乳液稳定效果差的问题，依然出现了明显的分层现象，由图4还可以发现，OVA-FA-SA、OVA-FA-KC和OVA-FA-HA与MCT的混合体积比为5:5，5:7，5:9时能够较好的稳定乳液。
实施例4
(1)准确称取2g卵清蛋白(OVA)粉末，将其分散于200g去离子水中，并于室温连续搅拌2h，用酸碱液将pH调为7.0±0.1，后置于4℃低温24h，使蛋白质充分水合，以获得质量浓度为1％的卵清蛋白贮存液。
(2)称取1g阿魏酸(FA)粉末加入到200g去离子水中，并于室温下连续搅拌2h，用碱液将pH调为7.0±0.1，使阿魏酸充分混匀，以获得质量浓度为0.5％的阿魏酸溶液。
(3)将步骤(1)的卵清蛋白溶液与步骤(2)的阿魏酸溶液按4:1体积比混合，即在磁力搅拌下，将阿魏酸溶液逐滴加入到卵清蛋白溶液中，磁力搅拌速度为800rpm～1400rpm，搅拌时间为60min～120min，将卵清蛋白-阿魏酸混合溶液pH调为6.0±0.1，获得卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液。
(4)分别称取1g海藻酸钠(SA)，卡拉胶(KC)，透明质酸(HA)、琼胶(Agar)粉末，然后分别加入到200g去离子水中，并于室温下连续搅拌2h，用碱液将pH调为6.0±0.1，使多糖充分混匀，获得质量浓度均为0.5％的多糖溶液。
(5)将步骤(3)获得的卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液分别与步骤(4)获得的多糖溶液按1:1体积比混合，即在磁力搅拌下，分别将多糖溶液逐滴加入到卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液中，磁力搅拌速度为400rpm～1200rpm，搅拌时间为30～120min，获得卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液。
(6)将步骤(5)获得的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液分别与中链甘油三酯按5:5、5:7、5:9体积比混合，即在磁力搅拌下，分别将中链甘油三酯逐滴加入到卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液中，磁力搅拌速度为200rpm～1500rpm，搅拌时间为30min。
(7)将步骤(6)中所得的混合溶液在12000rpm条件下均质一定时间(约2min)，即可得到卵清蛋白-阿魏酸-多糖三元体系稳定的乳液。
本实施例研究了乳液的流变性能，探讨了不同油相体积比对乳液力学性能的影响。在4℃放置了12h后用动态剪切流变仪进行测定，具体测定步骤为：将样品放置在两个平行板之间，并将间隙高度设置为1mm；进行振幅扫描以确定线性粘弹性区域(LVR)；在1hz的恒定频率下，应变从0.1％对数增加到100％；频率扫描从0.1到100rad/s，固定应变为0.5％(LVR内)。
结果如图5所示：随着频率的提高，OVA-FA-HA乳液的G′和G″出现交点，说明该频率超出一定范围，样品结构产生了不可回复的变化，样品的结构受到一定程度的破坏。但是，OVA-FA-海藻酸钠或OVA-FA-卡拉胶的油相体积比为5:7和5:9时，在测试的频率范围内，样品的G′一直大于G″(G′为储能模量又称为弹性模量，G″为损耗模量又称为粘性模量，粘弹性是对G′和G″的总称)，表现出主要的弹性行为，具有很好的稳定性。同时，在高频率下，样品的G′和G″仍然没有出现交点，说明OVA-FA-SA或OVA-FA-KC在油相体积比为5:7和5:9下稳定的乳液在高速率变形下没有发生结构破坏。
实施例5
(1)准确称取2g卵清蛋白(OVA)粉末，将其分散于200g去离子水中，并于室温连续搅拌2h，用酸碱液将pH调为7.0±0.1，后置于4℃低温24h，使蛋白质充分水合，以获得质量浓度为1％的卵清蛋白贮存液。
(2)称取1g阿魏酸(FA)粉末加入到200g去离子水中，并于室温下连续搅拌2h，用碱液将pH调为7.0±0.1，使阿魏酸充分混匀，以获得质量浓度为0.5％的阿魏酸溶液。
(3)将步骤(1)的卵清蛋白溶液与步骤(2)的阿魏酸溶液按4:1体积比混合，即在磁力搅拌下，将阿魏酸溶液逐滴加入到卵清蛋白溶液中，磁力搅拌速度为800rpm～1400rpm，搅拌时间为60min～120min，将卵清蛋白-阿魏酸混合溶液pH调为6.0±0.1，获得卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液。
(4)分别称取1g海藻酸钠(SA)，卡拉胶(KC)，透明质酸(HA)、琼胶(Agar)粉末，然后分别加入到200g去离子水中，并于室温下连续搅拌2h，用碱液将pH调为6.0±0.1，使多糖充分混匀，获得质量浓度均为0.5％的多糖溶液。
(5)将步骤(3)获得的卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液(OVA-FA)与步骤(4)获得的多糖溶液按1:1体积比混合，即在磁力搅拌下，分别将多糖溶液逐滴加入到卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液中，磁力搅拌速度为400rpm～1200rpm，搅拌时间为30～120min，获得卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液。
(6)将步骤(5)获得的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液分别与中链甘油三酯(MCT)按5:7、5:9的体积比混合，即在磁力搅拌下，分别将中链甘油三酯逐滴加入到卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液中，磁力搅拌速度为200rpm～1500rpm，搅拌时间为30min。
(7)将步骤(6)中所得的混合溶液在12000rpm条件下均质一定时间(2min)，即可得到卵清蛋白-阿魏酸-多糖三元体系稳定的乳液。
本实施例利用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察OVA-FA-SA或OVA-FA-KC与MCT以5:7或5:9(即OVA-FA-PS：Oil＝5:7或5:9)稳定乳液的微观结构，即均质后，在4℃放置12h，再在激光共聚焦显微镜观察。结果如图6所示：结果表明，与OVA-SA或OVA-KC(在同等条件下，将多糖溶液用蒸馏水替代，作为对照)制备的乳浊液相比，OVA-FA-SA或OVA-FA-KC复合物稳定的乳浊液中球形油滴的周围吸附着一层红色薄膜，可有效阻止乳浊液的聚集从而提高乳浊液的稳定性，且球形油滴之间更加致密；随着油相体积比的增大，乳浊液液滴之间的空隙逐渐减小，液滴变得更加紧凑。但是，通过对比OVA-FA-SA和OVA-FA-KC与MCT以体积比5:9稳定的乳液，可以发现OVA-FA-KC稳定的乳液更加紧凑，液滴更小，分布更加均匀，且乳浊液的液滴周围均吸附着一层红色薄膜。因此，由微观来看OVA-FA-KC稳定乳液要比OVA-FA-SA稳定乳液的稳定性更好。
实施例6
(1)准确称取2g卵清蛋白(OVA)粉末，将其分散于200g去离子水中，并于室温连续搅拌2h，用酸碱液将pH调为7.0±0.1，后置于4℃低温24h，使蛋白质充分水合，以获得质量浓度为1％的卵清蛋白贮存液。
(2)称取1g阿魏酸(FA)粉末加入到200g去离子水中，并于室温下连续搅拌2h，用碱液将pH调为7.0±0.1，使阿魏酸充分混匀，以获得质量浓度为0.5％的阿魏酸溶液。
(3)将步骤(1)的卵清蛋白溶液与步骤(2)的阿魏酸溶液按4:1体积比混合，在磁力搅拌下，将阿魏酸溶液逐滴加入到卵清蛋白溶液中，磁力搅拌速度为800rpm～1400rpm，搅拌时间为60min～120min，将卵清蛋白-阿魏酸混合溶液pH调为6.0±0.1，获得卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液。
(4)分别称取1g海藻酸钠(SA)，卡拉胶(KC)，透明质酸(HA)、琼胶(Agar)粉末，然后分别加入到200g去离子水中，并于室温下连续搅拌2h，用碱液将pH调为6.0±0.1，使多糖充分混匀，获得质量浓度均为0.5％的多糖溶液。
(5)将步骤(3)获得的卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液分别与步骤(4)获得的多糖溶液按1:1体积比混合，即在磁力搅拌下，分别将多糖溶液逐滴加入到卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液中，磁力搅拌速度为400rpm～1200rpm，搅拌时间为30～120min，获得卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液。
(6)将步骤(5)获得的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液与中链甘油三酯按5:7、5:9体积比混合，即在磁力搅拌下，分别将中链甘油三酯逐滴加入到卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液中，磁力搅拌速度为200rpm～1500rpm，搅拌时间为30min。
(7)将步骤(6)中所得的混合溶液在12000rpm条件下均质一定时间(2min)，即可得到卵清蛋白-阿魏酸-多糖三元体系稳定的乳液。
(8)将步骤(7)中的乳液在37℃下放置两周，观察并测定乳液的粒径电位(经动态光散射(DLS)测定)。
本实施例考察了卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合液稳定乳液的储藏稳定性。图7显示了在37℃下储存14天期间OVA-FA-SA和OVA-FA-KC以体积比为5:7和5:9稳定乳液的变化。对于OVA-FA-SA稳定的乳液和OVA-FA-KC稳定的乳液，平均粒径随着储存时间的增加而略微增加，并且乳液保持稳定，储存7d未观察到明显分离(图7A)，说明乳液在该贮藏时间内表现出良好的稳定性，主要是由于增加了液滴之间的静电排斥和空间位阻作用。贮存7d后，由于静电排斥作用，乳液平均粒径略有增大。但是，由图7B可知OVA-FA-KC稳定乳液粒径明显增大，图7A则显示贮藏14天后未发现明显的分层现象，这可能是由于随着油滴体积的增大，油滴的比表面积逐渐减小，油滴又被OVA-FA-KC复合物覆盖，因此油滴的比表面积保持稳定，没有出现分层现象。由图7C可以发现随着贮藏时间的增加，乳液的电位绝对值逐渐减小。因此，可以发现OVA-FA-KC乳液的储藏稳定性要比OVA-FA-SA好。
实施例7
(1)准确称取2g卵清蛋白(OVA)粉末，将其分散于200g去离子水中，并于室温连续搅拌2h，用酸碱液将pH调为7.0±0.1，后置于4℃低温24h，使蛋白质充分水合，以获得质量浓度为1％的卵清蛋白贮存液。
(2)称取1g阿魏酸(FA)粉末加入到200g去离子水中，并于室温下连续搅拌2h，用碱液将pH调为7.0±0.1，使阿魏酸充分混匀，以获得质量浓度为0.5％的阿魏酸溶液。
(3)将步骤(1)的卵清蛋白溶液与步骤(2)的阿魏酸溶液按4:1体积比混合，在磁力搅拌下，将阿魏酸溶液逐滴加入到卵清蛋白溶液中，磁力搅拌速度为800rpm～1400rpm，搅拌时间为60min～120min，将卵清蛋白-阿魏酸混合溶液pH调为6.0±0.1，获得卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液。
(4)分别称取1g海藻酸钠(SA)，卡拉胶(KC)，透明质酸(HA)，然后分别加入到200g去离子水中，并于室温下连续搅拌2h，用碱液将pH调为6.0±0.1，使多糖充分混匀，获得质量浓度均为0.5％的多糖溶液。
(5)将步骤(3)获得的卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液分别与步骤(4)获得的多糖溶液按1:1体积比混合，即在磁力搅拌下，分别将多糖溶液逐滴加入到卵清蛋白-阿魏酸纳米颗粒溶液中，磁力搅拌速度为400rpm～1200rpm，搅拌时间为30～120min，获得卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液。
(6)称取4g芦丁(Ru)粉末加入到350mL中链甘油三酯(MCT)中，并于室温下连续搅拌30min～90min，然后将其在5000rpm转速下离心2～10min，上清液即为负载芦丁的中链甘油三酯(MCT)。
(7)将步骤(5)获得的卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液与步骤(6)中获得的负载芦丁的中链甘油三酯按5:9体积比混合，即在磁力搅拌下，分别将负载芦丁的中链甘油三酯逐滴加入到卵清蛋白-阿魏酸-多糖复合溶液中，磁力搅拌速度为200rpm～1500rpm，搅拌时间为30min。
(8)将步骤(6)中所得的混合溶液在12000rpm条件下均质2min，即可得到负载芦丁的卵清蛋白-阿魏酸-多糖三元体系稳定的乳液(OVA-FA-SA-Ru、OVA-FA-KC-Ru、OVA-FA-HA-Ru)。
本实施例考察了脂溶性多酚的荷载对于乳液的流变学性质的影响(以同等条件下制备的未负载芦丁的三元体系稳定的乳液OVA-FA-SA、OVA-FA-KC、OVA-FA-HA为对照)。结果如图8所示：从图中可以看出，OVA-FA-SA-Ru、OVA-FA-KC-Ru的储能模量和损耗模量显著高于OVA-FA-SA和OVA-FA-KC。结果表明，脂溶性多酚的荷载能够增加三元乳液的储能模量和损耗模量。OVA-FA-HA荷载脂溶性多酚，其乳液的储能模量和损耗模量虽然相对于单独的OVA-FA-HA乳液有所增加，但显著低于OVA-FA-SA和OVA-FA-KC荷载脂溶性多酚乳液的储能模量和损耗模量。OVA-FA-SA和OVA-FA-KC经脂溶性多酚荷载以后，其储能模量和损耗模量相对于单独的OVA-FA-SA和OVA-FA-KC显著增高的同时，二者未表现较大的差异性，而二者与OVA-FA-HA表现出较大的差异性。此外，在测试频率增加的过程中，各乳液的G’都显著高于G”，表现为凝胶的固体性质。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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