具体实施方式

除非另有说明，否则如本申请中于此使用的所有术语应以本领域已知的它们的普通含义来理解。对本申请中使用的某些术语的其它更具体的定义如下文所述，并且意欲在整个说明书和权利要求书中统一地应用，除非另有明确阐述的定义提供了更宽泛的定义。

如本文所用的不定冠词“a”和“an”与“至少一个”或“一个或多个”同义。除非另有说明，本文所用的定冠词如“the”也包括该名词的复数形式。

如上所述，本发明提供了一种栎草亭和没食子酸以65:1至1.2:1的重量比的组合，其中当没食子酸是以酸形式或以其盐或酯形式时。当没食子酸为其盐或酯形式时，所述重量比与相应的没食子酸量相关。

术语“重量比”是指所指示的分子或化合物的重量关系。例如，栎草亭和没食子酸之间的重量比(重量/重量)为65:1，是指65单位的栎草亭和1单位的没食子酸。如本文所用的组分的“重量％”或“％w/w”是指单一组分相对于组合物或(如果具体提及的话)其它组分总重量的量。在本发明中，提取物的重量是指干提取物的重量或质量。

栎草亭又称2-(3,4-二羟基苯基)-3,5,6,7-四羟基色烯-4-酮，CAS号为90-18-6。栎草亭具有式(I)：

没食子酸又称3,4,5-三羟基苯甲酸，CAS号为149-91-7。没食子酸具有式(II)：

已知数种被称为没食子酸盐(酯)的没食子酸盐和酯也具有抗氧化活性，因此可用于本发明的组合中。例如，没食子酸的烷基酯如没食子酸甲酯、没食子酸丙酯、没食子酸辛酯和没食子酸十二烷基(月桂基)酯，或没食子酸盐如没食子酸钠，可以与栎草亭组合而获得协同抗氧化组合。

栎草亭和没食子酸是可商购的，并且可以从几个化学品供应商处获得。

因此，在本发明的组合的一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，没食子酸酯是烷基酯，例如C₁-C₁₂烷基酯。在一个更特定的实施方式中，没食子酸酯选自没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯、没食子酸辛酯、没食子酸十二烷基酯及其混合物。

没食子酸盐的制备可以通过本领域已知的方法进行。例如，它们可以通过常规化学方法由含有酸性部分的母体化合物制备。通常，这样的盐是，例如，通过将游离酸形式的没食子酸与化学计酸量的适当的碱在水或有机溶剂或它们的混合物中反应而制备的。同样，没食子酸酯的制备可以通过本领域已知的方法进行。一般而言，没食子酸酯是，例如，通过将游离酸形式的没食子酸与化学计酸量的适当的醇在高温下反应来制备。

在本发明的组合的另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，没食子酸是酸形式的

在本发明的组合的另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，栎草亭和没食子酸或其盐或酯之间的重量比为65:1至1.2:1，64:1至1.2:1，63:1至1.2:1，62:1至1.2:1，61.2:1至1.2:1，60:1至1.2:1，59:1至1.2:1，58:1至1.2:1，57:1至1.2:1，56:1至1.2:1，55:1至1.2:1，54:1至1.2:1，53:1至1.2:1，52:1至1.2:1，51.2:1至1.2:1，50:1至1.2:1，49:1至1.2:1，48:1至1.2:1，47:1至1.2:1，46:1至1.2:1，45:1至1.2:1，44:1至1.2:1，43:1至1.2:1，42:1至1.2:1，41.2:1至1.2:1，40:1至1.2:1，39:1至1.2:1，38:1至1.2:1，37:1至1.2:1，36:1至1.2:1，35:1至1.2:1，34:1至1.2:1，33:1至1.2:1，32:1至1.2:1，31.2:1至1.2:1，30:1至1.2:1，29:1至1.2:1，28:1至1.2:1，27:1至1.2:1，26:1至1.2:1，25:1至1.2:1，24:1至1.2:1，23:1至1.2:1，22:1至1.2:1，21.2:1至1.2:1，20:1至1.2:1，19:1至1.2:1，18:1至1.2:1，17:1至1.2:1，16:1至1.2:1，15:1至1.2:1，14:1至1.2:1，13:1至1.2:1，12:1至1.2:1，11.2:1至1.2:1，10:1至1.2:1，9:1至1.2:1，8:1至1.2:1，7:1至1.2:1，6:1至1.2:1，5:1至1.2:1，4:1至1.2:1，3:1至1.2:1，2.9:1至1.2:1，2.8:1至1.2:1，2.7:1至1.2:1，2:1至1.2:1，1.9:1至1.2:1，1.8:1至1.2:1，1.7:1至1.2:1，1.6:1至1.2:1，1.5:1至1.2:1，1.4:1至1.2:1，或1.3:1至1.2:1。

在本发明的组合的另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，栎草亭和没食子酸或其盐或酯之间的重量比为10:1至1.2:1，10:1至1.3:1，10:1至1.4:1，10:1至1.5:1，10:1至1.6:1，10:1至1.7:1，10:1至1.8:1，10:1至1.9:1，10:1至2:1，10:1至2.1:1，10:1至2.2:1，10:1至2.3:1，10:1至2.4:1，10:1至2.5:1，10:1至2.6:1，10:1至2.7:1，10:1至2.8:1，或10:1至2.9:1。

在本发明的组合的另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，所述组合由重量比为65:1至1.2:1的栎草亭和没食子酸组成。

在本发明的组合的另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，所述组合包含栎草亭和没食子酸，栎草亭和没食子酸的重量比为65:1至1.2:1，更特别为20:1至1.5:1，更特别为10:1至1.5:1，更特别为10:1至2:1，更特别为4:1至2:1，或更加特别为8.6:1至2.85:1。更特别地，所述组合包含重量比为49:1至1.5:1的栎草亭和没食子酸。更特别地，所述组合包含重量比为9:1至1.5:1的栎草亭和没食子酸。

在本发明的组合的另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，栎草亭以植物提取物的形式提供。

如本文所用的“植物提取物”或“提取物”是指通过适当的手段从植物中分离诸如抗氧化剂的活性成分而获得的植物各部分的浓缩制剂。取决于这些活性成分的理化特性，可以使用用于其分离的合适手段，例如水溶液、醇溶液、有机溶剂、微波或超临界流体提取。所述提取物含有一种或多种活性成分，并且可按多种形式，包括纯或半纯组分、固体或液体提取物、或固体植物物质，来掺入组合物中。

在本发明的组合的一个特定实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，植物提取物包含栎草亭，其量等于或高于干提取物质量的30％w/w，更特别地，等于或高于干提取物质量的40％w/w，更加特别地，等于或高于干提取物质量的50％w/w，更加特别地，为干提取物质量的35至60％w/w。

在本发明的组合的一个特定实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，所述植物提取物是万寿菊提取物。在一个更特定的实施方式中，万寿菊提取物是花渣提取物(flower bagasse extract)。在一个更加特定的实施方式中，万寿菊花渣提取物包含占干提取物质量的35至60％w/w的量的栎草亭。

“万寿菊提取物”应理解为从万寿菊植物中获得的化合物的浓缩制剂。在本发明中，优选使用万寿菊的花渣来制备所述提取物。花渣是从花中提取油树脂后剩余的残余物。万寿菊花渣提取物的主要抗氧化剂化合物是栎草亭，占其抗氧化剂的大于94％(见下文实施例)。

万寿菊(又名墨西哥万寿菊(Mexican marigold)、阿兹特克万寿菊(Aztecmarigold)、非洲万寿菊(African marigold)，或简称万寿菊)是属于菊科的一种草本植物。这种植物通常用于传统医学，是世界上常见的观赏植物。大多数关于万寿菊花的研究都集中在叶黄素油树脂的提取上。万寿菊油树脂工业上用作天然类胡萝卜素的来源，以生产例如添加到肉鸡或蛋鸡饲料中的色素。富含类胡萝卜素的油树脂是用己烷从万寿菊干花中获得的，产生大量的脱脂花残余物或渣。这些残余物目前用作动物的纤维来源、用作肥料或被简单地丢弃。

因此，本发明的组合的另一个优点是栎草亭可以从工业中通常丢弃的丰富且廉价的化合物中获得，例如从高度富含栎草亭的万寿菊渣提取物获得。

在本发明的组合的一个特定实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，所述植物提取物选自水提取物、醇提取物和有机提取物。在一个更特定的实施方式中，所述植物提取物是醇提取物。

如本文所用的术语“水提取物”是指使用水作为唯一溶剂进行提取的植物提取物。术语“有机提取物”是指使用非醇的有机溶剂进行提取的植物提取物。术语“醇提取物”是指使用水和醇如甲醇或乙醇的混合物进行提取的植物提取物。

在本发明的组合的另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，所述提取物是干提取物。

对于本领域技术人员来说显而易见的是，如果栎草亭以植物提取物的形式提供，则所述提取物与没食子酸的重量比应根据提取物中所含的栎草亭的量进行调整，以获得本发明的比率。例如，如下文实施例所示，当使用含有57％w/w栎草亭的万寿菊提取物时，为了获得栎草亭和没食子酸的2.85:1重量比，必须制作所述提取物和没食子酸以5:1的重量比的组合。

因此，在本发明的组合的另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，所述组合包含万寿菊提取物和没食子酸，二者的重量比为65:1至1.8:1，更特别为18:1至3:1，更加特别为16:1至4:1，更加特别为15:1至5:1。

因此，在本发明的组合的另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，所述组合包含万寿菊提取物和添加的没食子酸，二者的重量比为90:1至1.8:1，更特别为40:1至3:1，更加特别为20:1至4:1，更加特别为15:1至5:1。

在本发明的组合的另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，所述组合包含万寿菊醇提取物和添加的没食子酸，二者的重量比为90:1至1.8:1，更特别为40:1至3:1，更加特别为20:1至4:1，更加特别为15:1至5:1。

因此，在本发明的组合的另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，所述组合包含万寿菊花渣醇提取物和添加的没食子酸，二者的重量比为90:1至1.8:1，更特别为40:1至3:1，更加特别为20:1至4:1，更加特别为15:1至5:1。

如上所述，本发明在第二实施方式中提供了包含如上定义的组合的食品、动物饲料、药用、兽医用或美容组合物。本发明的组合物可以另外掺入增强本发明组合的有益效果的其它活性成分。

如本文所用的“食品组合物”是指适合人类消费的任何固体、半固体或液体组合物，还有可饮用的液体。术语“动物饲料组合物”是指适合非人类动物消费的任何固体、半固体或液体组合物，还有可饮用的液体；因此，它也包括宠物食品。食品和饲料组合物均意味着还包括用于制作它们的原材料和原料，以及膳食补充剂。术语“膳食补充剂”是指旨在补充膳食并提供在对象膳食中可能缺乏或可能摄入量不足的营养素例如维生素、矿物质、纤维、脂肪酸或氨基酸的制剂。

如本文所用的“美容组合物”是指用于改善对象的外观或卫生的组合物，包含美容可接受的赋形剂或载体。术语“美容可接受的”是指适合用于接触人体皮肤而没有过度毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等的赋形剂或载体。

术语“药用组合物”或“兽医用组合物”分别是指用于改善或维持对象或动物的健康的组合物，并包含药学上可接受的赋形剂或载体。

包含本发明组合的组合物可以呈现任何形式，例如固体或液体。

本发明的组合对于防止包含脂质的组合物氧化特别有用。因此，在另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，所述食品、动物饲料、药用、兽医用或美容组合物包含脂质。更具体地，所述组合物包含等于或高于1％w/w、更加特别等于或高于10％w/w的脂质量。

如本文所用的“脂质”是指不溶于水而溶于非极性溶剂的有机分子，例如脂肪酸、类固醇或甘油三酯(脂肪)。本发明的组合对于防止脂肪氧化尤其有用。

在另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，所述食品、动物饲料、药用、兽医用或美容组合物包含维生素或类胡萝卜素。

在另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，所述食品、动物饲料、药用、兽医用或美容组合物包含本发明的组合，所述组合的量为0.001％w/w至1％w/w，更特别为0.005％w/w至0.5％w/w，更加特别为0.01％w/w至0.1％w/w。

在另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，所述食品、动物饲料、药用、兽医用或美容组合物包含栎草亭，其量为20ppm至5000ppm。更特别地，25ppm至500ppm，更加特别地，50ppm至200ppm。

在另一个实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，所述食品、动物饲料、药用、兽医用或美容组合物包含没食子酸，其量为20ppm至5000ppm。更特别地，25ppm至500ppm，更加特别地，50ppm至200ppm。

如前所述，本发明在第三方面中提供了如上定义的组合作为食品、动物饲料、药用、兽医用或美容组合物中的抗氧化剂的用途。本发明的组合可用于增加包含氧化敏感分子如脂质的任何组合物的氧化稳定性。因此，在一个特定实施方式中，如上定义的组合用作食品、动物饲料、药用、兽医用或美容组合物中的抗氧化剂，其中所述组合物包含脂质，更特别地，它包含的脂质量等于或高于1％w/w，更加特别地等于或高于10％w/w。

如上所述，本发明在第四方面提供了一种制备如上定义的组合的方法，所述方法包括以下步骤：

-提供栎草亭；

-添加没食子酸或其盐或酯；

-任选地，添加合适的液体载体；以及

-混合和均质化。

在所述方法的一个特定实施方式中，任选地与上文或下文提供的任何实施方式组合，所述合适的液体载体选自可食用载体和药学上可接受的载体。在一个更特定的实施方式中，合适的液体载体选自醇(例如乙醇或异丙醇)、有机酸、酯(例如柠檬酸盐、甘油单酯和甘油二酯)、卵磷脂、脂质(例如脂肪或油)、其它液体提取物和水。

如本文所用的“药学上可接受的载体”，是指适合用于与人和非人动物的组织或器官接触而无过度毒性、刺激性、过敏反应、免疫原性或与合理的利益/风险比相称的其它问题或并发症的载体。“可食用载体”是指可以被包括人类在内的动物摄入而没有明显有害的健康后果的载体。

在整个说明书和权利要求书中，单词“包含”和该单词的变体并不意欲排除其它技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，单词“包含”涵盖了“由……组成”的情况。本发明的其它目的、优点和特征在审查说明书后对于本领域技术人员将变得显而易见，或者可以通过本发明的实践而获悉。提供以下实施例和附图作为说明，它们无意于限制本发明。与附图相关并在权利要求中位于括号内的参考符号仅用于试图增加权利要求的可理解性，并且不应解释为对权利要求范围的限制。此外，本发明涵盖本文描述的特定和优选实施方式的所有可能的组合。

实施例

提取物制备

万寿菊渣是通过对花进行油树脂提取而获得的(H.B.Sowbhagya等人，“来自万寿菊化学与技术的天然着色剂(Natural Colorant from Marigold-Chemistry andTechnology)”，Food Reviews International，2004，20卷，33-50页)。

然后，根据标准程序对花渣进行醇溶剂提取。简而言之，所述提取可以使用体积比为1:3至3:1的含甲醇和/或乙醇的水作为溶剂，在30至50℃的温度范围内在0.5至2小时的时间段期间进行，并且取决于原材料的特性，固液比为1:30至1:50(w/v)。

然后将固液中间产物过滤并将提取物喷雾干燥，得到浓缩的黄色至棕色粉末。所述提取物的浓缩-过滤和喷雾干燥的操作条件设置取决于每批提取物的具体特性，这受所获得的原始作物的质量的影响。添加到要喷雾干燥的制剂中的成分同样也决定了操作条件。将提取批次之间的固体残余物和粘度标准化。使用帽孔直径为0.5mm的双流体喷嘴。将水分散体混合约30分钟，然后在该操作条件参考范围内喷雾干燥：干燥空气入口温度，100-170℃；雾化空气体积流量：300-800l/h；进料体积流量：3-15ml/min；进料浓度，3-10％(w/w)；干燥空气体积流量：25-50m³/h。

用具有阵列光电二极管的液相色谱法和具有用MRM的三重四极杆检测器的质谱检测器(UPLC-PDA-XevoTQS)，通过外部模式对所生成的提取物进行定量(Antoni Delpino-Rius等人，“来自果汁工业的加工纤维中酚类化合物的表征(Characterisation ofphenolic compounds in processed fibres from the juice industry)”，Food Chem.，2015，172卷，575-584页)并表明其富含黄酮类化合物(50-70％)，栎草亭含量为30％至65％。

两个提取物样品中最丰富的抗氧化物质的分布如下：

-栎草亭：样品-A：573.68mg/g，样品-B：567.29mg/g。

-栎精：样品-A：26.12mg/g，样品-B2：27.15mg/g。

-没食子酸甲酯：样品-A：7.02mg/g，样品-B：7.17mg/g。

-没食子酸：样品-A：1.18mg/g，样品-B：1.20mg/g。

因此，栎草亭几乎占了提取物的所有抗氧化物质(这些样品中评估的活性物质的94.24％)。栎精占评估的酚类和黄酮类化合物的4.39％，而包括没食子酸甲酯和没食子酸在内的没食子酸类占1.37％(分别为1.17％和0.20％)。

Rancimat法

用892Professional Rancimat根据制造商的说明(Metrohm，瑞士)进行Rancimat测定，以评估栎草亭(以上述万寿菊渣提取物的形式提供)与各种抗氧化剂组合的抗氧化功效。

将加热块的温度固定在120℃。当该装置达到期望温度时，向每个池添加60mL去离子水并测定其电导率直至稳定(1.5–2h)。

将没有抗氧化剂的商业猪油在加热器中于50℃融化。制备有1％抗氧化剂的均质猪油储备溶液，并用猪油稀释以达到期望的待测浓度。抗氧化剂的评估浓度为25、75和150ppm。所用的万寿菊提取物中的抗氧化剂浓度为60％。

为了鉴定抗氧化剂之间的协同关系，测试了不同比例的万寿菊提取物与没食子酸、BHT、BHA和生育酚的组合。使用的重量比是15:1(90％来自提取物的活性物质–10％来自另一种抗氧化剂的活性物质)；5:1(75％来自提取物的活性物质–25％来自另一种抗氧化剂的活性物质)；1.67:1(50％来自TE提取物的活性物质–50％来自另一种抗氧化剂的活性物质)；和1:1.8(25％来自TE提取物的活性物质–75％来自另一种抗氧化剂的活性物质)

一旦制备了有抗氧化剂的猪油样品后，就每个反应容器添加3g样品。将样品暴露于120℃的空气流。挥发性氧化产物(主要是甲酸)被空气流转移到测量容器中并在那里吸收在蒸馏水中，在其中确定水电导率。主要由甲酸增加引起的水电导率，通过安装在计算机中的软件按时间连续记录，从而得到一条拐点为诱导期的氧化曲线。该诱导期是氧化过程的性质从非常缓慢的氧化状态转变为耗氧快得多的状态、导致过氧化值迅速增加所需的时间。所有试验始终包括没有任何抗氧化剂的阴性对照。

抗氧化保护系数由有抗氧化剂时的诱导期与相应的阴性对照(无抗氧化剂)诱导期的比率确定。抗氧化保护系数越高，评估的抗氧化剂的功效越好。使用9.1.3版SAS软件本(SAS institute)执行所有统计分析。

TE提取物与没食子酸组合的结果

Rancimant测定的结果表明，TE提取物单独提供的保护系数高于没食子酸、BHA或BHB，但低于生育酚(表1和图1)。

表1

n＝2(每个浓度重复次数)

TE提取物与其它抗氧化剂的组合显示，当所述提取物与生育酚、BHA或BHB混合时，在氧化保护方面没有改善。然而，当TE提取物与没食子酸组合时，观察到了出人意料的协同抗氧化效果(图1，黑色三角形和黑色圆形)，将它们的抗氧化能力增加了48％(N＝4-8次重复/被测抗氧化剂浓度。双因素方差分析(Tukey检验)，^*对比TE P<0.05，^#对比没食子酸P<0.01)。当没食子酸的量增加到超过1.67:1(提取物/没食子酸)的重量比时，这种协同作用消失(图1，三角形和实心正方形)。

因此，这些结果证明包含栎草亭和没食子酸的组合提供了强大的协同抗氧化效果。

分离的栎草亭与没食子酸组合的结果

如上所述，还通过Rancimat法评估了纯栎草亭(>95％纯度)与没食子酸(>99％纯度)组合的抗氧化功效。

如图2所示，以9:1的重量比向栎草亭添加没食子酸提供了协同效应(黑色圆形)，超越了栎草亭单独(空心正方形)、没食子酸单独(空心圆形)和TE提取物单独(空心三角形)的抗氧化能力。

因此，这些结果证明仅含栎草亭和没食子酸的组合提供了强效的协同抗氧化效果。

此外，栎草亭和没食子酸组合的抗氧化能力与TE提取物和没食子酸组合(黑色三角形)提供的抗氧化能力相当，这证明了通过TE提取物和没食子酸组合观察到的协同抗氧化效果确实是由存在于TE提取物中的栎草亭和添加的没食子酸的组合所提供的。

引用文献

H.B.Sowbhagya等人，“来自万寿菊化学与技术的天然着色剂(Natural Colorantfrom Marigold-Chemistry and Technology)”，Food Reviews International，2004，20卷，33-50页。

Antoni Delpino-Rius等人，“来自果汁工业的加工纤维中酚类化合物的表征(Characterisation of phenolic compounds in processed fibres from the juiceindustry)”，Food Chem.，2015，172卷，575-584页。