一种用于检测多硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种用于检测多硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用 (Fluorescent probe for detecting hydrogen polysulfide and preparation method and application thereof ) 是由 陈令新 张良伟 张霞 杨阳 张丽 于 2021-10-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于检测多硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用,其中,该荧光探针是基于香豆素衍生物的有机小分子化合物,结构式如下所示：该荧光探针能够高选择性和高灵敏性的响应H-(2)S-(n),在H-(2)S-(n)存在下,荧光光谱出现明显新的发射峰,可用于溶液和细胞中H-(2)S-(n)的定性定量检测,并可大大降低外部检测条件的干扰,具有较快的检测速度和较高的检测精度。(The invention discloses a fluorescent probe for detecting hydrogen polysulfide and a preparation method and application thereof, wherein the fluorescent probe is an organic small molecular compound based on coumarin derivatives, and the structural formula is as follows: the fluorescent probe can respond to H with high selectivity and high sensitivity 2 S n In H 2 S n In the presence, the fluorescence spectrum shows obvious new emission peaks and can be used for H in solution and cells 2 S n The method can greatly reduce the interference of external detection conditions, and has higher detection speed and higher detection precision.)
技术领域
本发明涉及一种荧光探针及其制备方法和应用，具体涉及一种用于检测多硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用，属于化学技术领域。
背景技术
作为硫化氢（H2S）的直接氧化形式，多硫化氢（H2Sn，n>1）具有亲核性、抗氧化性、细胞保护性以及氧化还原性。多硫化氢能参与细胞内一系列的氧化还原调节，与细胞的生理病理学功能密切相关。除此之外，越来越多由硫化氢参与的生理性活动其实际上是由多硫化氢介导的。对内源性的多硫化氢来说，它能由内源性的活性氧物种（ROS）氧化硫化氢内源性产生。因此，合理的推断，硫化氢只是多硫化氢生理性活动中所释放的标志物，而多硫化氢可能是实际的信号分子。详尽的了解多硫化氢在正常和疾病状态下的产生、分布和生理功能，对阐明细胞信号转导机制有着重要的意义。
由于生物体内的环境具有多样性和复杂性，所以开发一种具有高选择性和灵敏性的分析方法来检测多硫化氢有很大研究价值与意义。荧光生物成像技术支撑的可视化研究，在生命分析领域中扮演着非常重要的角色。利用荧光探针的高灵敏度、可控开关操作、选择性好、高生物兼容性等优点，易实现实时原位检测和观察。
基于2,4-二硝基苯响应基团的用以检测硫化氢的一类荧光探针，检测硫化氢主要是利用硫化氢的亲核性打开2,4-二硝基苯基团与荧光团之间连接的醚键，从而实现荧光基团的释放，进而达到荧光改变的效果。而在中性环境下，多硫化氢具有比硫化氢更强的亲核性，也就意味着具有更强的进攻能力。但是这些荧光探针在选择性研究上并没有将多硫化氢考虑在内，更没有测试探针对多硫化氢有响应。因此，探究这一类响应基团对多硫化氢的选择性具有重要的意义。同时，由于目前可应用于检测多硫化氢的荧光探针的发展主要集中在荧光团的开发，而对多硫化氢的特异性响应基团的开发较少，因此，开发一种新的多硫化氢响应基团具有重要的研究价值和发展前景。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测多硫化氢的荧光探针及其制备方法和应用。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种用于检测多硫化氢的荧光探针，其特征在于，前述荧光探针是基于香豆素衍生物的有机小分子化合物，结构式如式I所示：
式I。
前述的用于检测多硫化氢的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将香豆素衍生物荧光团充分溶于乙腈中，然后加入2,4-二硝基氯苯，溶解后，向混合溶液中逐滴加入N,N-二异丙基乙胺，油浴80℃下加热冷凝回流2h；
（2）薄层色谱法监测反应完成后，将混合溶液冷却至室温，抽滤，得到白色固体，即前述的荧光探针。
前述的制备方法，其特征在于，前述香豆素衍生物荧光团、2,4-二硝基氯苯和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:2:1.5。
前述的用于检测多硫化氢的荧光探针的应用，其特征在于，用于检测溶液和细胞中的多硫化氢。
前述的应用，其特征在于，将荧光探针溶于二甲基亚砜中，配制成10mM储备液，保存于4℃药品阴凉柜中，检测时，将荧光探针储备液用二甲基亚砜稀释，并使其工作浓度为10μM。
前述的应用，其特征在于，检测在pH=7.4下进行，用HEPES缓冲溶液与DMF组成的混合溶液作为反应体系，HEPES缓冲溶液与DMF的体积比为9:1。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明提供的荧光探针，采用香豆素衍生物作为荧光母体，选择含有亲电位点的2,4-二硝基苯作为光诱导电子转移过程的调制基团，能够高选择性和高灵敏性的响应H2Sn，在H2Sn存在下，荧光光谱出现明显新的发射峰，可用于H2Sn的定性检测和定量检测，并可大大降低外部检测条件的干扰，具有较快的检测速度和较高的检测精度；
（2）本发明提供的荧光探针，对细胞具有较低的毒性，生物兼容性良好，不仅可以检测溶液中的H2Sn，还可以检测细胞中的H2Sn，可被用来深入研究H2Sn在环境和生物体内的产生、转运及累积等过程的动力学机理，还有助于阐明H2Sn在生理病理过程中的生物作用以及研究H2Sn动态平衡的新机制。
附图说明
图1是式I所示荧光探针的合成路线图；
图2是探针BCC检测H2Sn的原理图；
图3是探究探针BCC对H2Sn的选择性的实验结果图；
图4是探针BCC与H2Sn响应随时间变化的紫外吸收光谱图；
图5是探针BCC与H2Sn响应随时间变化的荧光强度图；
图6是探针BCC对HepG2细胞的细胞毒性研究结果图；
图7是探针BCC用于检测HepG2细胞内内源性和外源性添加H2Sn的共聚焦显微镜照片。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
第一部分、用于检测多硫化氢的荧光探针的结构及其制备方法
1、荧光探针的结构
本发明提供的用于检测多硫化氢的荧光探针是一种基于香豆素衍生物的有机小分子化合物，结构式如式I所示：
式I
2、荧光探针的制备方法
参照图1，式I所示荧光探针的制备方法具体包括以下步骤：
（1）将香豆素衍生物荧光团（28mg，0.1mmol）充分溶于乙腈中，然后加入2,4-二硝基氯苯（40mg，0.2mmol），溶解后，向混合溶液中逐滴加入N,N-二异丙基乙胺（20mg，0.15mmol），油浴80℃下加热冷凝回流2h；
（2）薄层色谱法监测反应完成后，将混合溶液冷却至室温，抽滤，得到白色固体（42mg，93.8%），即式I所示荧光探针（记为探针BCC）。
该白色固体的核磁共振波谱如下：
1H NMR（500MHz，CDCl3-d1）δ（ppm）：9.15（s，1H），8.95（d，J=2.7Hz，1H），8.40（dd，J=9.2，2.7Hz，1H），8.16（d，J=9.1Hz，1H），8.09–7.97（m，2H），7.54（d，J=9.0Hz，1H），7.40（dd，J=8.8，2.3Hz，1H），7.13（d，J=9.2Hz，1H），4.47（q，J=7.1Hz，2H），1.44（t，J=7.1Hz，3H）；
13C NMR（500MHz，CDCl3-d1）δ（ppm）：163.36，156.74，155.22，154.22，143.88，142.21，135.63，132.40，131.10，129.03，128.17，122.35，119.69，119.30，117.20，117.11，112.06，62.32，29.69，14.28。
第二部分、探针BCC检测多硫化氢的原理
如图2所示，用探针BCC检测多硫化氢时，探针BCC与被检测物多硫化氢作用，生成香豆素衍生物荧光团，从而导致荧光强度发生改变。
用HEPES缓冲溶液与N,N-二甲基甲酰胺（DMF）组成的混合溶液作为反应体系配制出100μM多硫化氢与10μM探针BCC的反应混合溶液。分别测定上述溶液在不同时间点（0～60min）的荧光强度，然后分别以波长和光强度值为横坐标和纵坐标作图。在多硫化氢存在下，探针BCC的荧光强度在440nm处逐渐减弱，同时在530nm处出现一个新的荧光发射峰并逐渐增强从而实现比率型荧光检测多硫化氢，并可大大降低外部检测条件的干扰，提高检测精度。
探针BCC可用于细胞内外多硫化氢水平的检测，这对深入研究多硫化氢在生物体内的产生、输送及累积等过程具有重要的生物学价值与意义。
第三部分、探针BCC对多硫化氢的选择性以及光谱响应
1、探针BCC对多硫化氢的选择性
将探针BCC溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成浓度为10mM的探针BCC储备液，保存于4℃药品阴凉柜中。测试时，将探针BCC储备液用DMSO稀释至浓度为1mM作为光谱测试的储备液来探究探针BCC对多硫化氢紫外和荧光光谱性质。以去离子水为溶剂，配制浓度为10mM的各种离子溶液（Mg2+、Na+、Zn2+、Cl-）、氨基酸溶液（Hcy、Cys、GSH、Tyr、Ala、Gly、Thr）以及H2Sn 溶液、Na2S溶液和Na2S2O3溶液。为模拟生理实验，实验均在pH=7.4（DMF-HEPES，pH=7.4，v/v=9/1）下进行。将上述各溶液分别与探针BCC混合，探针BCC的终浓度为10.0μM，待测物浓度为100μM，摇匀溶液，平衡60min，将溶液倒进荧光皿中测定荧光光谱。
探针BCC对多硫化氢的选择性如图3所示。其中：1，对照；2，Na2S；3，Na2S2O3；4，Mg2+；5，Zn2+；6，Na+；7，Cl-；8，Cys；9，Hcy；10，GSH；11，Tyr；12，Thr；13，Gly；14，Ala；15，H2Sn。
由图3的实验结果可以看出，探针BCC对H2Sn具有理想的选择性响应，能不受其他硫化物、生物硫醇、活性生物分子和离子等干扰。也就是说，探针BCC在生理pH条件下对多硫化氢有很好的选择性。
2、探针BCC对多硫化氢的光谱响应
将探针BCC溶于二甲基亚砜（DMSO）中配制成浓度为10mM的探针BCC储备液，保存于4℃药品阴凉柜中，测试时，将探针BCC储备液用DMSO稀释至浓度为1mM。用HEPES缓冲溶液与DMF组成的混合溶液（DMF-HEPES，pH=7.4，v/v=9/1）作为反应体系配制出10μM探针BCC与100μM多硫化氢的反应混合溶液，将配好的反应混合溶液倒进荧光皿中在不同时间点（0～60min）测定荧光光谱、倒进紫外吸收皿中在不同时间点（0～60min）测定紫外吸收光谱。
（1）探针BCC对多硫化氢随时间变化的UV-Vis
探针BCC在加入H2Sn后的紫外吸收光谱如图4所示。从图4中可以看出：
（i）探针BCC在338nm处有最大吸收，当探针BCC与H2Sn（100μM）反应之后逐渐在388nm处出现一个新的吸收峰，同时338nm处的探针吸收峰逐渐减弱，随着反应时间的进行（0～60min）紫外吸收有明显的变化；
（ii）探针BCC对H2Sn的反应在60min时基本完成，并且对H2Sn有很好的紫外吸收选择性和规律性。
（2）探针BCC对多硫化氢随时间变化的荧光光谱图
探针BCC荧光强度随H2Sn时间变化的荧光光谱图如图5所示。从图5中可以看出：
（i）探针BCC与H2Sn反应之后，探针BCC对应的440nm处的荧光强度逐渐减弱，同时530nm处新出现的荧光发射峰随反应时间的推移逐渐增强；
（ii）在接近60min反应时间时，探针BCC在440nm处的发射峰和530nm处的发射峰均趋于稳定。
图4和图5的实验结果表明：探针BCC对H2Sn具有很好的选择性，并且能在60min内完成，探针BCC适合用于细胞以及生物体的进一步研究。
第四部分、探针BCC对细胞生物兼容性的实验验证
采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂检测探针BCC的生物安全性。选用人肝癌细胞（HepG2）作为实验细胞系，在96孔板上培养HepG2细胞，每孔100μL（3000细胞/μL）。细胞在96孔板上培养贴壁24h后，将不同浓度的探针BCC（0μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM和50μM）分别添加到多组细胞中孵育12h。随后向每孔加10μL CCK-8（Cell CountingKit-8）溶液在培养箱中孵育4h。用酶标仪测量样品在450nm波长处的吸光度，通过吸光度的不同反映细胞的存活率。
探针BCC对HepG2细胞的细胞毒性的研究结果如图6所示。由图6可知：探针BCC对HepG2细胞具有较低的毒性，在探针BCC的浓度达到20μM时HepG2细胞的存活率仍能达到95%以上，在细胞实验中使用探针BCC工作浓度为10μM且短时间处理时探针BCC对细胞存活率的影响是可忽略的。
也就是说，探针BCC对细胞具有较低的毒性，生物兼容性良好，可以进行下一步探索。
第五部分、探针BCC用于细胞内多硫化氢的检测
HepG2细胞预先培养于共聚焦皿中24h使细胞贴壁，用10μM 探针BCC孵育HepG2细胞60min作为对照组，在激光共聚焦显微镜下进行激光共聚焦成像（405nm激发波长，500nm～600nm收集荧光），成像结果如图7中的a所示；向另一组HepG2细胞中加入100μM的H2Sn以提供外源性多硫化氢，在培养箱中孵育30min后用10μM探针BCC孵育60min在激光共聚焦显微镜下进行激光共聚焦成像，成像结果如图7中的b所示。
对比图7中的a和b可知：前者的细胞内荧光较弱，后者的细胞内荧光显著增强。
可见，探针BCC能用于检测细胞内源性和外源性的多硫化氢。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
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