银耳多糖的提取方法及应用
阅读说明：本技术 银耳多糖的提取方法及应用 (Extraction method and application of tremella polysaccharide ) 是由 林枝东 于 2021-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及中医药技术领域,具体涉及一种银耳多糖的提取方法及应用。方法包括如下步骤：(1)将银耳用溶剂浸泡；然后加水打浆,离心,取上清液1；(2)将上清液1中加入无机盐,搅拌,离心,取上清液2；(3)将上清液2中加入乙醇-丙酮水溶液中,静置；过200-300目筛,得多糖沉淀；(4)将多糖沉淀复溶,加热除去有机溶剂,真空冷冻干燥,即得。本发明方法银耳多糖提取提取率高,纯度高,提取时间短,有利于工业化大生产。(The invention relates to the technical field of traditional Chinese medicines, and particularly relates to an extraction method and application of tremella polysaccharide. The method comprises the following steps: (1) soaking Tremella in solvent; adding water, pulping, centrifuging, and collecting supernatant 1; (2) adding inorganic salt into the supernatant 1, stirring, centrifuging, and taking a supernatant 2; (3) adding the supernatant 2 into an ethanol-acetone aqueous solution, and standing; sieving with 200-300 mesh sieve to obtain polysaccharide precipitate; (4) redissolving the polysaccharide precipitate, heating to remove the organic solvent, and freeze-drying in vacuum to obtain the polysaccharide. The method has the advantages of high extraction rate, high purity and short extraction time of the tremella polysaccharide, and is beneficial to industrial mass production.)
技术领域
本发明涉及中医药技术领域，具体涉及一种银耳多糖的提取方法及应用。
背景技术
银耳又名白木耳，为我国传统的滋补保健品，银耳具有滋阴、润肺、益气和血之功效。银耳多糖来源于银耳子实体和银耳细胞深层发酵孢子中分离、纯化得到的杂多糖，大量研究表明，银耳多数的药理活性都与银耳多糖有关，其具有增强免疫力、抗衰老、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辐射等多种生理功能。目前主要以化妆品、食品中应用较多，在保健品和药品中应用较少，未能充分发挥银耳的药用价值。究其原因是现在对银耳多糖的提取率不高，提取纯度仍比较有限，且提取耗时长，能源消耗大，难以在工业上推广。
中国发明专利CN107586349B公开了中性缓冲溶液提取银耳多糖的方法，包括以下步骤：在加热条件下，采用中性缓冲溶液对银耳粉进行浸提，得到浸提料液：将所述浸提料液进行固液分离，得到液体组分，所述液体组分中含有银耳多糖；将所述液体组分进行醇沉，得到的沉淀为银耳多糖。该方法银耳多糖的提取率为29.69％，制备的多糖中含有蛋白质等杂质，纯度不高。
中国发明专利CN112029006B公开了一种银耳多糖及其制备方法，包括(1)采用中性缓冲溶液对银耳粉进行浸提，得到浸提料液；(2)向浸提料液中加入果胶纤维素复合酶，进行酶解；(3)酶解后过滤，取滤液进行离心静置取上清液；(4)对上清液进行醇沉，离心，得到的沉淀为银耳多糖。该方法银耳多糖的提取率较高，但采用酶解法成本较高，纯度也有待进一步提高。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种银耳多糖的提取方法，该方法提取率高，银耳多糖的纯度高，提取时间短，而且能耗低，有利于工业化生产。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种银耳多糖的提取方法，包括如下步骤：
(1)将银耳用溶剂浸泡；然后加水打浆，离心，取上清液1；
(2)将上清液1中加入无机盐，搅拌，离心，取上清液2；
(3)将上清液2中加入乙醇-丙酮水溶液中，静置；过200-300目筛，得多糖沉淀；
(4)将多糖沉淀复溶，加热除去有机溶剂，真空冷冻干燥，即得。
优选地，步骤(1)中所述银耳与溶剂的质量体积比为1：1-3g/mL，所述浸泡的时间为20-40min；所述溶剂为山梨醇、聚乙二醇、卵磷脂和水的混合物，所述山梨醇、聚乙二醇、卵磷脂和水的质量比为0.01-0.05：0.05-0.08：0.1-0.3：1。
优选地，步骤(1)中所述银耳与水的质量体积比为1:25-45g/mL，所述打浆为用匀浆机打浆5s停3s，累计打浆的时间为0.5-1min。
优选地，步骤(1)中所述离心的转速为7000-9000r/min，所述离心的时间为20-40min。
优选地，步骤(2)中所述无机盐为硫酸铵和氯化钠的混合物，所述上清液1中加入硫酸铵至其饱和度为55-60％，所述上清液1中加入氯化钠至其饱和度为40-45％。
优选地，步骤(2)中所述离心的转速为7000-9000r/min，所述离心的时间为5-15min。
优选地，步骤(3)中所述乙醇-丙酮水溶液中乙醇、丙酮与水的体积比为60-75：5-15：10-35；所述静置的时间为5-10h。
优选地，步骤(3)中所述过筛为过300目筛。
优选地，步骤(4)中所述复溶为将多糖沉淀中加入水，所述多糖沉淀与水的质量体积比为1：67-90g/mL；所述除去有机溶剂为旋转蒸发除去乙醇和丙酮，旋蒸条件水温55-65℃，转速150-170rpm。
本发明的再一目的是提供一种上述提取方法在提取银耳多糖中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)银耳在打浆中浆液粘度很大，需加入相当量的水，后期沉淀多糖需消耗大量的乙醇-丙酮溶剂，对实际造成浪费。本发明通过在银耳多糖打浆前用特定配比的山梨醇、聚乙二醇、卵磷脂和水的混合溶液进行浸泡，可以明显改善打浆时粘度大的问题，且对银耳结构产生破坏作用，使浆液流动性更充分，打浆更完全，提高了银耳多糖的提取率；
(2)本发明通过银耳上清液1中加入无机盐，无机盐与水的亲和性更强，使蛋白质失去水膜，采用特定的无机盐进行复配，协同去除蛋白质更高效完全，最终得到的银耳多糖纯度更高；
(3)本发明在醇沉步骤中采用特定的乙醇-丙酮水溶液对多糖进行高效分离沉淀，进一步提高了银耳多糖的纯度；
(4)本发明通过复溶再旋蒸，有效去除有机溶剂残留，通过一定的真空冷冻干燥工艺，可提高银耳多糖的品质。
(5)本发明制备的银耳多糖含量高，纯度高，对超氧阴离子自由基具有良好的清除作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。各原料均为普通市售产品。
实施例1
一种银耳多糖的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取鲜银耳的白色叶肉，称重，然后用3倍量的溶剂浸泡30min；加入35倍体积蒸馏水，然后用匀浆机打浆5s停3s，累积打浆1min；然后在转速8000r/min下离心30min，取上清液1；
其中溶剂为山梨醇、聚乙二醇、卵磷脂和水的混合分散溶液，山梨醇、聚乙二醇600、卵磷脂和水的质量比为0.03：0.06：0.2：1；卵磷脂购自西安晋湘药用辅料有限公司；
(2)将上清液1中加入加入硫酸铵至其饱和度为55％，所述上清液1中加入氯化钠至其饱和度为40％，搅拌10min，在转速为8000r/min下离心10min，取上清液2；
(3)将上清液2中加入乙醇-丙酮水溶液中，静置5h；过200目筛得筛上絮状物，即多糖沉淀；乙醇-丙酮水溶液中乙醇、丙酮与水的体积比为70：10：20；
(4)将多糖沉淀加水复溶(多糖与水的质量体积比为1g：80mL)，旋转蒸发除去乙醇和丙酮，旋蒸条件水温55℃，转速150rpm，真空冷冻干燥，即得。
实施例2
一种银耳多糖的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取鲜银耳的白色叶肉，称重，然后用1倍量的溶剂浸泡20min；加入25倍体积蒸馏水，然后用匀浆机打浆5s停3s，累积打浆1min；然后在转速7000r/min下离心20min，取上清液1；卵磷脂购自河北贞田食品添加剂有限公司；
其中溶剂为山梨醇、聚乙二醇、卵磷脂和水的混合分散溶液，山梨醇、聚乙二醇400、卵磷脂和水的质量比为0.01：0.05：0.1：1。
(2)将上清液1中加入加入硫酸铵至其饱和度为60％，所述上清液1中加入氯化钠至其饱和度为40％，搅拌10min，在转速为9000r/min下离心5min，取上清液2；
(3)将上清液2中加入乙醇-丙酮水溶液中，静置5h；过300目筛筛得絮状物，得多糖沉淀；乙醇-丙酮水溶液中乙醇、丙酮与水的体积比为60：5：35；
(4)将多糖沉淀加水复溶(多糖与水的质量体积比为1g：67mL)，旋转蒸发除去乙醇和丙酮，旋蒸条件水温65℃，转速150rpm，真空冷冻干燥，即得。
实施例3
一种银耳多糖的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取鲜银耳的白色叶肉，称重，然后用3倍量的溶剂浸泡40min；加入45倍体积蒸馏水，然后用匀浆机打浆5s停3s，累积打浆0.5min；然后在转速7000r/min下离心40min，取上清液1；
其中溶剂为山梨醇、聚乙二醇、卵磷脂和水的混合分散溶液，山梨醇、聚乙二醇600、卵磷脂和水的质量比为0.05：0.08：0.3：1；卵磷脂购自西安晋湘药用辅料有限公司；
(2)将上清液1中加入加入硫酸铵至其饱和度为55％，所述上清液1中加入氯化钠至其饱和度为45％，搅拌10min，在转速为7000r/min下离心15min，取上清液2；
(3)将上清液2中加入乙醇-丙酮水溶液中，静置5h；过200目筛筛得絮状物，得多糖沉淀；乙醇-丙酮水溶液中乙醇、丙酮与水的体积比为75：15：10；
(4)将多糖沉淀加水复溶(多糖与水的质量体积比为1g：90mL)，旋转蒸发除去乙醇和丙酮，旋蒸条件水温60℃，转速150rpm，真空冷冻干燥，即得。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，步骤(1)中浸泡溶剂为卵磷脂与水以0.29:1的混合物。其余与实施例1保持一致。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于，仅将上清液1中加入硫酸铵至饱和溶液，不加入氯化钠，其余与实施例1保持一致。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于，步骤(3)中仅采用80％乙醇进行沉淀，其余与实施例1保持一致。
对比例4
本对比例与实施例1的区别在于，步骤(1)中溶剂仅为水，其余与实施例1保持一致。
试验例1银耳多糖的测定
采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。提取率为提取方法制备冷冻干燥得到的银耳多糖与银耳生药量的质量百分比，提取纯度为采用苯酚-硫酸法测得多糖的含量与提取方法制备冷冻干燥得到的银耳多糖质量的百分比，结果见表1。
表1各组银耳多糖的提取率和纯度
试验例2银耳多糖清除超氧阴离子自由基的作用
2.1试验材料
Tris-HCL缓冲液，邻苯三酚，HCL；将各实施例和对比例制备成1mg/mL的银耳多糖溶液；
2.2实验方法
取8只10mL棕色容量瓶，编号为邻苯三酚组、实施例1组、实施例2组、实施例3组、对比例1组、对比例2组、对比例3组、对比例4组，分别加入4.5mL、pH9.0、50mmol/L Tris-HCL缓冲液，然后除空白组外，其余各组分别加入0.80mL3mmol/L的邻苯三酚盐酸溶液，然后除空白组和邻苯三酚组外，向其余各组中加入相应组制备的银耳多糖溶液3mL，加蒸馏水定容至10mL，充分摇匀，然后室温下反应9min后，在325nm下分别测定吸光度值，超氧自由基清除率R的计算如下式：
R＝(A各实施例组或对比例组-A邻苯三酚组)/A邻苯三酚组×100％；
实施例1-3组和对比例1-4组对超氧阴离子自由基的清除率结果如下表2。
表2各组银耳多糖溶液对超氧阴离子自由基的清除率
各组
清除率％
实施例1
92.5
实施例2
92.4
实施例3
92.2
对比例1
85.6
对比例2
87.2
对比例3
84.9
对比例4
79.3
结果分析：实施例1-3组提取得到的银耳多糖提取物对超氧阴离子自由基的清除率高，在浓度为0.3mg/mL时，清除率可达92％以上。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
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