一种多基因融合溶瘤腺病毒及其构建方法和应用
阅读说明：本技术 一种多基因融合溶瘤腺病毒及其构建方法和应用 (Multi-gene fusion oncolytic adenovirus and construction method and application thereof ) 是由 杨月峰 荣晔婧 蔡挺 张顺 张沛瑶 于 2021-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多基因融合溶瘤腺病毒,该溶瘤腺病毒以Adeasy载体系统为基础,插入DCN基因表达框、腺病毒复制调控基因序列及CD40L基因表达框。本发明以溶瘤腺病毒为载体,联合靶向TGFβ和靶向CD40-CD40L的治疗策略,协同发挥其抗肿瘤免疫激活效应,提升结直肠癌的治疗水平。肿瘤局部给药后,首先通过溶瘤作用杀灭肿瘤细胞；同时不断复制的病毒能够持续产生大量的目的蛋白decorin和CD40L。局部高浓度的decorin,可阻断肿瘤细胞内异常激活的TGFβ信号,抑制转移相关蛋白的表达与分泌。同时,CD40L能够激活机体抗肿瘤免疫反应、抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡。协同发挥其在改善肿瘤免疫微环境和激活机体抗肿瘤免疫反应中的作用,更加长效地发挥溶瘤病毒的作用。(The invention discloses a polygene fusion oncolytic adenovirus, which is inserted with a DCN gene expression frame, an adenovirus replication regulatory gene sequence and a CD40L gene expression frame on the basis of an Adeasy vector system. The invention takes oncolytic adenovirus as a vector, combines treatment strategies of targeting TGF beta and targeting CD40-CD40L, synergistically exerts the anti-tumor immune activation effect and improves the treatment level of colorectal cancer. After local administration of tumor, tumor cells are killed by the tumor-dissolving function; meanwhile, the continuously replicating virus can continuously produce a large amount of the target proteins decorin and CD40L. Local high-concentration decorin can block TGF beta signal abnormally activated in tumor cells and inhibit expression and secretion of metastasis related protein. Meanwhile, the CD40L can activate the anti-tumor immune response of the organism, inhibit the proliferation of tumor cells and promote the apoptosis of the tumor cells. The compound can synergistically play the roles of improving the tumor immune microenvironment and activating the anti-tumor immune response of the organism, and can play the role of oncolytic virus for a long time.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种多基因融合溶瘤腺病毒及其构建方法和应用。
背景技术
近年来,我国结直肠癌的发病率呈逐年上升的趋势,仅次于肺癌,位居第二位。目前，结直肠癌的主要治疗手段是手术切除治疗，放射治疗和化学治疗的效果并不理想。因此，急需探索一种更加有效的治疗手段。
近年来，溶瘤病毒治疗发展迅速，已有多项溶瘤病毒治疗药物进入临床II-III期研究阶段。2015年10月，美国FDA批准了携带粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimutaing factor，GM-CSF)的单纯疱疹溶瘤病(T-VEC)进入市场，为溶瘤病毒治疗注入了一支强心针。目前，在临床试验中应用最为广泛的是溶瘤腺病毒，我国早在2006年，我国就批准了全球第一个溶瘤腺病毒药物上市。溶瘤腺病毒的主要构建策略之一，是用组织特异性启动子替换天然的病毒启动子来控制病毒复制启动基因的表达，得到转录调控型的溶瘤腺病毒。
在理论上，溶瘤腺病毒可以在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞，释放病毒，进一步感染周围的其他肿瘤细胞，进而发挥级联放大作用，最终达到消灭肿瘤的目的。然而，实际上，溶瘤腺病毒的疗效往往受到多种因素的制约，如，人体内普遍存在5型腺病毒抗体，可清除溶瘤溶瘤腺病毒；启动病毒复制的肿瘤特异性启动子效率达不到预想等。
近年来，通过多种方式对溶瘤腺病毒进行修饰，能够显著提高溶瘤腺病毒的疗效，如通过携带自杀基因，提高对肿瘤细胞的杀伤效率；通过携带免疫基因，调节机体及肿瘤局部的免疫状态；通过携带抗血管生成基因，阻断肿瘤细胞转移相关信号激活等。因此，将溶瘤腺病毒治疗与基因治疗联合应用，已经成为溶瘤病毒治疗的重要方向和热点。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供一种多基因融合溶瘤腺病毒；本发明的第二个目的是提供一种上述多基因融合溶瘤腺病毒的构建方法；本发明的第三个目的是提供一种上述多基因融合溶瘤腺病毒在制备用于治疗结直肠癌的药物中的应用。
本发明的第一个目的可通过下列技术方案来实现：一种多基因融合溶瘤腺病毒，包括该溶瘤腺病毒以Adeasy载体系统为基础，插入DCN基因表达框、腺病毒复制调控基因序列及CD40L基因表达框。
可选的，所述DCN基因表达框、腺病毒复制调控基因序列及CD40L基因表达框均插入在腺病毒基因组E1区中。
可选的，所述DCN基因表达框由cmv启动子和DCN基因组成。
可选的，所述CD40L基因表达框由天然E1B启动子和CD40L基因组成。
可选的，所述腺病毒复制调控基因序列包括端粒酶启动子TERTp、腺病毒E1区复制起始基因E1A及E1B55K，其中所述的腺病毒E1A基因由端粒酶启动子TERTp调控，所述E1B55K由天然E1B启动子调控。
优选的，所述CD40L基因插入至天然E1B启动子和E1B55K之间，即天然E1B启动子同时调控CD40L基因和E1B55K基因。
优选的，从序列的5’至3’方向为：cmv启动子-DCN基因-TERTp-腺病毒E1A基因-天然E1B启动子-CD40L基因-IRES-E1B55K。
本发明的第二个目的可通过下列技术方案来实现：一种如上述的多基因融合溶瘤腺病毒的构建方法，包括以下步骤：
S1：将DCN基因插入到pshuttle-cmv载体中，获得pSh.cmv.DCN；
S2：端粒酶启动子TERTp、腺病毒E1A基因、天然E1B启动子、CD40L基因、核糖体内部进入位点及E1B55K顺次相连，克隆到TE载体上获得TE-TP-E1A-CD40L，酶切TE-TP-E1A-CD40L后获取复制相关基因，将所述复制相关基因克隆到pSh.cmv.DCN的相应位点，获得穿梭质粒；
S3：酶切穿梭质粒,电转感受态细胞，与Adeasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒；酶切重组腺病毒质粒后转染HEK293细胞，获得溶瘤腺病毒。
本发明的第三个目的可通过下列技术方案来实现：一种如上述多基因融合溶瘤腺病毒在制备用于治疗结直肠癌的药物中的应用。该药物用于结直肠癌治疗，包括TGF-β不敏感的结直肠癌治疗。
本发明的第四个目的可通过下列技术方案来实现：一种如上述多基因融合溶瘤腺病毒在肿瘤治疗及药物研发中的应用。
综上所述，本发明的有益效果为：
1、本发明以溶瘤腺病毒为载体，联合靶向TGFβ和靶向CD40-CD40L的治疗策略，协同发挥其抗肿瘤免疫激活效应，提升结直肠癌的治疗水平。肿瘤局部给药后，首先通过溶瘤作用杀灭肿瘤细胞；同时不断复制的病毒能够持续产生大量的目的蛋白decorin和CD40L。局部高浓度的decorin，可阻断肿瘤细胞内异常激活的TGFβ信号，抑制转移相关蛋白的表达与分泌。同时，CD40L能够激活机体抗肿瘤免疫反应、抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡。协同发挥其在改善肿瘤免疫微环境和激活机体抗肿瘤免疫反应中的作用，更加长效地发挥溶瘤病毒的作用。
2、本发明将TGFβ天然抑制分子decorin和CD40L联合应用于肿瘤的免疫基因治疗，可有效结合溶瘤治疗、基因治疗和免疫治疗的优势，有望协同发挥其在改善肿瘤免疫微环境和激活机体抗肿瘤免疫反应中的作用，为结直肠癌的治疗提供一种更加有效的策略，具有十分重要的理论意义和现实价值。
附图说明
图1为溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L以及对照病毒rAd.Null、rAd.DCN、rAd.CD40L和Ad.Null的基因组结构示意图。
图2为溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L对结直肠癌细胞系RKO、HCT116和CT26的杀伤作用图。
图3为溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L介导目的基因DCN和CD40L表达的能力图。
图4为溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L治疗CT26移植瘤的治疗效果图。
图5为溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L治疗7天后外周血中Tregs细胞的检测结果图。
图6为溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L治疗14和25天后外周血中效应T淋巴细胞的检测结果图。
图7为溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L治疗14天后外周血中记忆性T淋巴细胞的检测结果图。
图8为溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L感染CT26细胞后decorin靶基因表达的检测结果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，并且下面对本发明涉及技术术语及现有研究成果做进一步的说明，若无特殊指明，按照本领域通用的一般所属进行理解和解释。
转化生长因子β(Transforming growth factorβ，TGFβ)
TGFβ作为多功能的细胞因子，在肿瘤骨转移的发生、发展过程中起着重要作用。TGF-β可以通过多种机制影响肿瘤的发生、发展和转移：如TGFβ通过PI3K/Akt/mTOR通路上调缺氧诱导因子(Hypoxia-Inducible Factors,HIFs)表达，促进肿瘤生长；通过Scr/Fak/Akt通路上调VEGF表达，促进血管生成；通过诱导溶骨相关因子的表达(IL-11，PTHrP、CTGF)，促进肿瘤骨转移的发生和发展；通过增强骨髓来源抑制细胞(myeloid-derivedsuppressor cells，MDSCs)聚集、诱导CD4+Foxp3+调节性T细胞(Regulatory T cells，Tregs)；下调NK细胞和CD8+T细胞表面NKG2D受体等来诱导免疫耐受微环境。目前，已有多种TGFβ靶向治疗策略应用于治疗晚期肿瘤的临床研究，如Fresolimumab(GC-1008)、PF-03446962、LY2157299(Galunisertib)等，其虽可改善肿瘤患者生活质量，并抑制肿瘤生长，但对提高长期存活率的作用有限。
核心蛋白多糖(Decorin)
Decorin作为TGFβ信号的天然抑制分子，可调控与肿瘤生长、转移密切相关的多条信号通路，如Wnt/β-catenin、Met、VEGFA等，进而抑制肿瘤的进展；进一步，decorin可降解肿瘤组织ECM，促进肿瘤局部溶瘤病毒的扩散和免疫细胞的浸润，更有效地发挥溶瘤病毒的溶瘤作用和免疫激活效应。多种免疫治疗手段联合应用已经成为免疫治疗的趋势和方向。近期研究显示，将靶向TGFβ策略与抑制免疫检查点策略联合应用，可在动物水平发挥协同效应。除抑制免疫检查点的策略外，另一类针对共刺激信号的激活性抗体药物发展迅速。
CD40及其配体CD40L
CD40-CD40L共刺激信号是研究的热点，其能刺激T淋巴细胞扩增并产生IL-12，进一步激活CTLs并发挥抗肿瘤免疫反应。目前，已有多种靶向CD40-CD40L信号的药物获批进行临床试验：如，重组可溶性CD40L蛋白(rsCD40L)、表达CD40L的溶瘤病毒、CD40激活性抗体等。临床研究结果显示，其具有激活机体抗肿瘤免疫反应、抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡等作用，但其单独使用疗效无法达到预期，可能与肿瘤微环境的免疫抑制状态相关。而联合靶向免疫抑制信号的治疗策略，有望为CD40靶向治疗带来新的突破。研究表明，抑制TGFβ信号可促进CD40L介导的DCs激活，增强DCs的抗肿瘤活性。
在本发明的一个具体实施方式中，采用stratagene公司的Adeasy系统，将“端粒酶启动子TERTp调控E1A的表达框，E1B启动子调控CD40L和E1B-55KDa的表达框，及cmv启动子调控decorin的表达框”构建到穿梭质粒。使用限制性内切酶PmeI将其线性化，并于BJ5183菌株中与Adeasy-1同源重组。得到的重组腺病毒质粒，经限制性内切酶PacI线性化后，转染HEK293细胞，包装得到溶瘤腺病毒。并在人结直肠癌细胞、小鼠结直肠癌细胞中鉴定目的基因decorin和CD40L的表达；在体外证实了溶瘤腺病毒的溶瘤作用；在小鼠CT26移植瘤模型中明确其治疗效果和机制。
在进一步优选的实施方式中，本发明采用的方法具体为：
1、溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L的构建及制备
构建由端粒酶启动子TERTp启动腺病毒复制必需基因E1A表达，由E1B启动子启动CD40L和E1B55K表达的中间载体TE-TP-E1A-CD40L；并通过酶切、连接的方法获得功能序列，并克隆到携带DCN基因的穿梭质粒上；最后，采用Adeasy系统制备重组腺病毒载体pAd.DCN.CD40L。于HEK293细胞中包装获得重组腺病毒。
此外在更优选的具体实施方式中，为了进行功能和机制研究，还制备了四种对照病毒：(1)rAd.Null，具有溶瘤功能，不携带目的基因的对照病毒；(2)rAd.DCN，携带DCN基因的溶瘤腺病毒；(3)rAd.CD40L，携带CD40L基因的溶瘤腺病毒(4)Ad.Null，不携带目的基因的复制缺陷性溶瘤腺病毒。
2、溶瘤腺病毒介导的目的基因表达和溶瘤功能评价
目的基因的有效表达是免疫功能得以发挥的保障。将重组腺病毒感染结直肠癌细胞后32h，荧光定量分别检测DCN和CD40L的表达水平。
而溶瘤功能是溶瘤腺病毒的基本特征。在更优选的具体实施方式中，我们采用SRB染色法检测了溶瘤腺病毒对多种结直肠癌细胞的溶瘤作用。
3、溶瘤腺病毒体内抗肿瘤效应评价
为评价小鼠体内抗肿瘤效应，建立了CT26细胞的小鼠移植瘤模型，通过瘤内给药方式进行治疗后，观察溶瘤腺病毒对移植瘤生长的抑制作用，明确其治疗效果。
4、溶瘤腺病毒体内外抗肿瘤机制研究
为明确溶瘤病毒的体内外抗肿瘤机制，检测了小鼠外周血免疫细胞表型，体外在CT26细胞感染rAd.DCN.CD40L后检测decorin靶基因的表达，初步阐明了其作用机制。
本发明的创新点在于以溶瘤腺病毒为载体，联合靶向TGFβ和靶向CD40-CD40L的治疗策略，协同发挥其抗肿瘤免疫激活效应，提升结直肠癌的治疗水平。
肿瘤局部给药后，首先通过溶瘤作用杀灭肿瘤细胞；同时不断复制的病毒能够持续产生大量的目的蛋白decorin和CD40L。局部高浓度的decorin，可阻断肿瘤细胞内异常激活的TGFβ信号，抑制转移相关蛋白的表达与分泌。同时，CD40L能够激活机体抗肿瘤免疫反应、抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡。协同发挥其在改善肿瘤免疫微环境和激活机体抗肿瘤免疫反应中的作用，更加长效地发挥溶瘤病毒的作用。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1重组腺病毒rAd.DCN.CD40L的构建与制备
其方法是基因合成DCN基因(核心蛋白多糖基因)和CD40L基因，将DCN插入到pshuttle-cmv载体中，获得pShuttle-cmv-DCN(pSh.cmv.DCN)；将端粒酶启动子TERTp、腺病毒E1A基因、天然E1B启动子、CD40L基因、核糖体内部进入位点(IRES)及E1B55K顺次相连，克隆到TE载体上获得TE-TP-E1A-CD40L，使用限制性内切酶MfeI酶切TE-TP-E1A-CD40L，获取复制相关基因，将其克隆到pSh.cmv.DCN的相应位点，获得穿梭质粒pSh.cmv.DCN.CD40L.RE；参照Adeasy系统，获得重组腺病毒质粒pAd.DCN.CD40L.RE；并于HEK293细胞制备获得溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L。具体为：
(1)pSh.cmv.DCN的构建
通过基因合成技术，合成DCN基因的全序列(如表1所示)，并在上下游分别加入SalI和XhoI的酶切位点，使用上述两种限制性内切酶将其酶切后，连接到pShuttle-cmv的相应位点，获得pSh.cmv.DCN载体。
(2)TE-TP-E1A-CD40L的构建
通过基因合成技术，合成CD40L基因的全序列(如表1所示)，并将端粒酶启动子TERTp、腺病毒E1A基因、天然E1B启动子、CD40L基因、核糖体内部进入位点(IRES)及E1B55K顺次相连，克隆到TE载体上获得TE-TP-E1A-CD40L。
表1 DCN和CD40L基因序列信息
(3)pSh.cmv.DCN.CD40L.RE的构建
质粒TE-TP-E1A含有TERTp启动子启动E1A表达和E1B启动子调控CD40L和E1B55K表达的两个表达框，通过MfeI酶切，获得此部分序列，然后将其正向克隆到pSh.cmv.DCN的相应位点，获得穿梭质粒pSh.cmv.DCN.CD40L.RE。
(4)溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L的制备
参照Adeasy系统制备重组腺病毒质粒：PmeI酶切穿梭质粒pSh.cmv.DCN.CD40L.RE,电转BJ5183感受态细胞，与Adeasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒pAd.DCN.CD40L.RE。PacI酶切重组腺病毒质粒，并将其转染HEK293细胞，制备获得溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L(如图1所示)。通过测序鉴定正确后，进行扩增、纯化和滴度测定；结果显示，病毒滴度和纯度均符合要求(如表2所示)。
(5)对照病毒的构建和制备
按照溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L构建、制备流程，采用pShuttle-cmv替换pSh.cmv.DCN，用TE-TP-E1A替换TE-TP-E1A-CD40L，构建和制备不携带目的基因的溶瘤腺病毒rAd.Null、rAd.DCN、rAd.CD40L。同时，采用Adeasy系统，制备复制缺陷型对照病毒Ad.Null。四种对照病毒经测序鉴定正确后，进行扩增、纯化和滴度测定；结果显示，病毒滴度和纯度均符合要求(如表2所示)。
表2病毒滴度、纯度检测结果
实施例2溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L体外功能验证
其方法是，在结直肠癌细胞中，采用磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色法，检测溶瘤病毒的杀伤效应；通过荧光定量检测目的基因DCN和CD40L在结直肠癌细胞中的表达。具体为：
(1)溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L的杀伤能力检测
将人结直肠癌癌细胞系RKO、HCT116和小鼠结直肠癌细胞系CT26分别以1×103细胞/孔接种96孔板。第二天，溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L和对照病毒rAd.Null、rAd.DCN、rAd.CD40L和Ad.Null分别以5倍梯度稀释的方式感染细胞(1.25×106Vps/细胞-80Vps/细胞)。第七天(感染后第六天)，采用SRB染色检测每孔中细胞的存活率，明确溶瘤腺病毒的细胞杀伤作用。计算方法为：细胞存活率＝相应感染滴度下的OD值/对照孔的OD值。结果显示，溶瘤病毒rAd.DCN.CD40L和rAd.Null、rAd.DCN、rAd.CD40L不但能够有效地杀伤人结直肠癌细胞RKO和HCT116，还能杀伤小鼠结直肠癌细胞CT26(如图2所示)。
(2)溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L介导目的基因DCN和CD40L表达的检测
采用10000VPs/细胞的溶瘤病毒rAd.DCN.CD40L和对照病毒感染结直肠癌细胞RKO、HCT116和CT26以后6h，将细胞培养基替换为无血清培养基。继续培养至32h，收集细胞，采用荧光定量分别检测目的基因DCN和CD40L的表达。结果显示，溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L和rAd.DCN均能在结直肠癌细胞中高效地表达目的基因DCN，溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L和rAd.CD40L均能在结直肠癌细胞中高效地表达目的基因CD40L(如图3所示)。
实施例3溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L治疗小鼠结直肠癌移植瘤的疗效评价
其方法是，采用小鼠结直肠癌细胞CT26建立移植瘤模型，通过瘤内给予溶瘤病毒的方式进行治疗，通过对其生长情况的监测，评价溶瘤病毒对小鼠结直肠癌移植瘤的治疗作用。具体为：
小鼠结直肠癌细胞单细胞悬液以2×106细胞/小鼠，皮下荷瘤6-8周的Babl/c小鼠，观察肿瘤的生长情况，于荷瘤后7d，检测肿瘤的体积，并按照体积分层随机分组划分为Buffer组、rAd.Null组、rAd.DCN、rAd.CD40L和rAd.DCN.CD40L组。按照2.5×1010VPs/100μl的剂量，瘤内注射重组腺病毒进行治疗。治疗后，观察小鼠的健康状况、肿瘤的生长体积。待Buffer组肿瘤出现破溃(或者体积大于2000mm3)时，终止实验。处死小鼠后，取肿瘤组织进行HE染色。结果显示，rAd.DCN.CD40L和rAd.DCN、rAd.CD40L均可以有效地抑制CT26细胞移植瘤的生长(如图4所示)。
实施例4溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L治疗小鼠结直肠癌移植瘤的机制研究
其方法是通过血液中T淋巴细胞亚型的分析，明确rAd.DCN.CD40L对于免疫的调节作用。具体为：
免疫调节是TGF-β介导肿瘤免疫逃逸的重要途径，因此，rAd.DCN.CD40L能否通过打破TGF-β介导的免疫抑制，是rAd.DCN.CD40L治疗取得成功的关键。治疗后7d、14d和25天，我们分别通过检测血液中Tregs的比例、效应T淋巴细胞和记忆性T淋巴细胞、骨髓来源抑制细胞(Bone marrow derived suppressor cells，MDSCs)的比例等，来明确rAd.DCN.CD40L对小鼠免疫的调节作用。我们的结果显示，与rAd.Null治疗相比，rAd.DCN.CD40L显著下调小鼠外周血中Tregs细胞的比例，可以提升效应T淋巴细胞和记忆性T淋巴细胞的比例。另外，rAd.DCN.CD40L可介导CT26细胞中转移相关的decorin靶基因c-met和β-catenin的表达下调。与rAd.DCN和rAd.CD40L相比，rAd.DCN.CD40L对免疫细胞和靶基因的调控能力显著增强(如图5-8所示)。
综上所述，本发明成功构建了由端粒酶启动子调控溶瘤(TERTp启动E1A表达，E1B启动CD40L表达)、表达DCN蛋白的溶瘤腺病毒rAd.DCN.CD40L。研究结果证实，该溶瘤腺病毒能够在体外结直肠癌细胞系中杀伤结直肠癌细胞，能够介导DCN和CD40L在结直肠癌细胞中的高效表达。在小鼠结直肠癌细胞CT26的移植瘤模型中，rAd.DCN.CD40L能够有效地抑制肿瘤的生长和进展；同时，明确了rAd.DCN.CD40L可在肿瘤局部通过调节骨转移相关的TGF-β靶基因、免疫细胞的比例等来抑制肿瘤转移的发生和发展。此外，明确了DCN和CD40L在机体抗肿瘤免疫激活中具有一定的协同效应。
因此，该溶瘤腺病毒不但可以通过溶瘤作用实现局部肿瘤的抑制和清除作用，还能够通过抑制转移相关基因以及调节免疫等方式，抑制肿瘤的转移。
以上所述的实施方式，并不构成对该技术方案保护范围的限定。任何在上述实施方式的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在该技术方案的保护范围之内。
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