具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，如利用该方法进行抗HCMV药物筛选等，都属于本发明保护的范围。

1、Luc-MCMVBAC质粒的转染

复苏NIH 3T3细胞，待细胞生长约80％汇合度左右，转染前一天晚上种细胞至24孔板，调整细胞密度为1×10⁴个/孔，细胞生长环境为含10％FBS DMEM、不含双抗的培养基和含5％CO₂的37℃恒温培养箱中进行培养。转染前，吸弃原培养基后用PBS洗一次，再每孔加入200μl Opti-MEM置于培养箱中孵育2h。准备转染溶液：溶液1(0.5μl Lipo 2000+55μlOpti-MEM)，溶液2(1μl Lipo 2000+55μl Opti-MEM)，溶液3(2μl Lipo 2000+55μl Opti-MEM)，溶液A(Xμl Opti-MEM+0.9μg/mL BAC质粒，含量分别为0.5μg/mL和1μg/mL)，均上下颠倒混匀。将溶液A分别缓慢加入到溶液1、2、3中，切勿吹打，继续上下颠倒混匀，室温静置20min后，吸弃孔板中的原培养基，以100μl/孔滴加至每孔细胞中，并补加含2％FBS-DMEM培养基400μl，置于培养箱中1-3天用生物发光成像鉴定转染结果。

2、空斑形成实验测Luc-MCMV滴度

对生长良好的NIH 3T3细胞进行0.25％胰酶消化后，用DMEM培养基调细胞数至3.6×10⁶个/mL左右，每孔1mL接种于24孔板，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养，待细胞贴壁生长成单层后，吸弃培养基，将Luc-MCMV按10倍梯度稀释成6个浓度，分别为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，每个浓度设4个复孔，每孔400μL，37℃，5％CO₂的细胞培养箱中孵育1个小时，其中每15min轻晃一次细胞培养板，吸弃病毒液，加入PBS洗一次后，再加覆盖物(含2％FBS的培养基与2％低熔点琼脂糖按1:1混合)，待其凝固后放入37℃，5％CO₂的细胞培养箱。每天镜下观察其细胞形态并计数，其滴度计算公式为：PFU/mL＝平均空斑个数×病毒稀释度×加入的病毒液的体积(mL)。

3、绘制Luc-MCMV与Wt-MCMV的生长曲线

按2的噬斑方法测病毒滴度，用Luc-MCMV和Wt-MCMV感染NIH3T3，随后每天镜下观察病毒形态，根据看到的空斑数来绘制生长曲线。

4、Luc-MCMV生物发光稳定性的鉴定

将-80℃中保存的Wt-MCMV与Luc-MCMV分别感染细胞，并设对照组，感染后第3天做生物发光成像实验，具体步骤如1所示；

5、Luc-MCMV如2被稀释成并感染细胞，不加低熔点琼脂糖而后放入培养箱中，感染后第5天拍生物发光图片，并用软件定量发光值。

6、DMSO对细胞的毒性研究

按1的方法复苏NIH 3T3细胞，2中的方法给NIH 3T3进行传代，将NIH 3T3细胞接种至96孔板，待细胞长成单层后，用细胞维持液将二甲基亚砜(DMSO)等倍稀释成10％、5％、2.5％、1％、0.5％这5个浓度梯度，设置对照组为正常细胞(未加入DMSO)，每个浓度梯度设6个复孔，DMSO与细胞相互作用24h后，避光加入10μl的MTT(5mg/mL)，4h后，吸弃上清，加入150μl锡箔纸包好放在水平摇床上震荡10min，然后在96微孔板酶标仪490nm处读取OD值，计算加入不同浓度DMSO后，NIH 3T3细胞的存活率，计算公式：细胞存活率＝(DMSO试验组OD值/对照组OD值)×100％，实验重复三次，取平均值作为实验结果。由此确定DMSO作为中药单体药物溶剂的最大无毒浓度。

7、中药单体对细胞的毒性研究

取处于对数期的细胞接种到96孔板，贴壁生长至孔底为单层细胞后，将DMSO溶解的各个药物的母液，用细胞培养基稀释成其不同浓度，使其DMSO终浓度为1％，并加入至96孔板，每个浓度梯度设置6个复孔，每孔100μl药液，并设置阴性对照孔(不含药液)、阳性对照孔(仅含1％DMSO)以及空白对照孔(PBS)，MTT实验部分及计算公式参考1的方法。根据细胞存活率，用SPSS 23.0统计软件计算药物

8、药物抗Luc-MCMV实验

细胞接至48孔板，长成单层细胞后，将病毒按MOI＝1感染细胞，感染方法同前所述，在病毒感染24h后，吸弃培养基，以每种药物的TC0作为工作浓度的含药培养基加入细胞孔中，3个复孔为一组，对照组不加药物，仅含2％FBS培养基，将其放入细胞培养箱中继续培养。生物发光成像参考1的方法，发光值,经定量后导出分析整理数据后用GraphPadPrism8.0作图。

9、唾液腺Luc-MCMV的制备

小鼠经动物房适应性饲养3天后开始实验，连续3天腹腔注射10mg/mL环磷酰胺溶液，第4天经尾静脉注射Luc-MCMV，第7天予以1％戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉检测萤光；

小鼠感染病毒14天后，200μl 1％戊巴比妥钠腹腔过量注射安乐死小鼠，无菌手术器械取唾液腺(如图4-1所示)；

将唾液腺放至2ml EP管内，并置于冰上(内含1ml的冰PBS，净重8g，加入唾液腺后两管重19g，即两个唾液腺重3g)；

生物安全柜内用200目网筛和注射器研磨唾液腺，每只小鼠唾液腺用3ml冰PBS收集匀浆液，共6ml；

离心，800g，4℃/5min，去除组织碎片；

收集步骤4)上清至新的EP管中，并重复步骤4)；

等分上清，保存于-80℃备用；

同上所述，连续在小鼠体内传毒3代。

10、Luc-MCMV动物筛选模型的初步建立

1)复苏Luc-MCMV使其分别感染正常细胞，一孔做为阴性对照孔(NIH 3T3细胞+培养基)，一孔做为实验孔(NIH 3T3细胞+SG-Luc-MCMV+GCV)，另外两孔做为阳性对照孔(NIH3T3细胞+SG-Luc-MCMV)，3天后检测发光强度，方法同1，实验重复3次；

2)小鼠前3天连续腹腔注射10mg/mL环磷酰胺溶液，用1)中的病毒感染小鼠分别感染小鼠，每组3只小鼠，设阴性对照组(正常小鼠+0.9％NaCl)，阳性对照组(正常小鼠+SG-Luc-MCMV)，实验组(正常小鼠+SG-Luc-MCMV+GCV)，3天后检测发光强度。

3)动物活体发光强度检测：20g左右小鼠每只腹腔注射200μl底物(浓度为30mg/mL)，5min后腹腔注射120μl 1％戊巴比妥钠溶液，5min左右小鼠完全进入麻醉状态后放入仪器中检测，方法同2.2.2.2。

实施例一：一种带萤光素酶标签的抗MCMV药物的高效筛选方法，包括以下步骤：

1)10mg/mL环磷酰胺溶液:取0.01g环磷酰胺粉末用10mL的无菌水振荡混匀,4℃冰箱备用；

2)小鼠经动物房适应性饲养3天后开始实验，连续3天腹腔注射10mg/mL环磷酰胺溶液，第4天用具有感染性的Luc-MCMV病毒转染小鼠成纤维细胞，即NIH 3T3，收集细胞培养上清以及细胞裂解液上清，合并上清，即为具有感染活性的Luc-MCMV病毒；

3)将收获的具有感染活性的Luc-MCMV病毒和野生型病毒Wt-MCMV分别感染NIH3T3细胞，噬斑法测定病毒滴度，分别测定它们的病毒滴度并绘制病毒生长曲线；

4)用NIH 3T3细胞扩大病毒培养，收集细胞培养上清与细胞裂解液上清，合并两种上清，然后进行分级离心与超速离心，用Spectrum CT成像系统测定Luc-MCMV在细胞中的萤光强度，并绘制病毒生长曲线；该曲线也反映病毒在细胞中的复制与繁殖状况；同时比较3)和4)所获得的病毒生长曲线，判断病毒的生长曲线是否一致，即插入Luciferase基因后是否影响病毒在细胞内的生长与复制。

5)以更昔洛韦为对照药物，鉴于目前没有筛选抗MCMV药物筛选的具体报道，选择以往文献中具有潜在抗HCMV活性的中药单体，所述中药单体为黄芩素、黄芪甲苷、穿心莲内酯、绿原酸、槲皮素以及苦参碱，通过MTT实验确定各中药单体的最大无毒浓度，在安全药物浓度下进行后续抗病毒活性研究；

6)按MOI＝1加入Luc-MCMV，Spectrum CT成像系统检测其发光强度，并用Living软件定量发光值，分析各中药单体是否具有抗MCMV活性；

7)取小鼠唾液腺制备SG-Luc-MCMV，分别感染细胞和小鼠，评估GCV在体内外的抗MCMV的药物活性。

实验得出：采用体外筛选出了和更昔洛韦具有相似抗MCMV活性的中药单体黄芩素和黄芪甲苷，实验的小鼠的抗体达到97％。

实施例二：一种带萤光素酶标签的抗MCMV药物的高效筛选方法，包括以下步骤：

1)取0.01g环磷酰胺粉末用5mL的无菌水震荡混匀，2℃冰箱备用；

2)小鼠经动物房适应性饲养3天后开始实验，连续3天腹腔注射5mg/mL环磷酰胺溶液，第4天用具有感染性的Luc-MCMV病毒转染小鼠成纤维细胞，即NIH 3T3，收集细胞培养上清以及细胞裂解液上清，合并上清，即为具有感染活性的Luc-MCMV病毒；

3)将收获的具有感染活性的Luc-MCMV和Wt-MCMV病毒分别感染NIH 3T3细胞，噬斑法测定病毒滴度，分别测定它们的病毒滴度并绘制病毒生长曲线，比较其生长曲线的差别，以此来判别Luc-MCMV和Wt-MCMV病毒感染情况；

4)收集细胞培养上清与细胞裂解液上清，合并上清，然后进行分级离心与超速离心，用Spectrum CT成像系统测定Luc-MCMV在细胞中的萤光强度，萤光强度的强弱与否能够反映病毒在细胞中的复制与繁殖状况，当萤光强度高，说明病毒在细胞中的复制与繁殖较好，当萤光强度低，说明病毒在细胞中的复制与繁殖较弱；

5)选择以往文献中具有潜在抗HCMV活性的中药单体，所述中药单体为黄芩素、黄芪甲苷、穿心莲内酯、绿原酸、槲皮素以及苦参碱，通过MTT实验确定各中药单体的最大无毒浓度，在安全药物浓度下进行后续抗病毒活性研究；

6)按MOI＝1加入Luc-MCMV，Spectrum CT成像系统检测其发光强度，并用Living软件定量发光值，分析各中药单体是否具有抗MCMV活性；

7)取小鼠唾液腺制备SG-Luc-MCMV，分别感染细胞和小鼠，评估GCV在体内外的抗MCMV的药物活性。

实验得出：在未设置更昔洛韦为为对照药物的情况下，不能确定药单体的最大无毒浓度，实验小鼠的抗病毒性弱，不确定性高，实验的小鼠的抗体达到显著下降，只有26％。

实施例三：一种带萤光素酶标签的抗MCMV药物的高效筛选方法，包括以下步骤：

1)10mg/mL环磷酰胺溶液:取0.01g环磷酰胺粉末用10mL的无菌水震荡混匀,4℃冰箱备用；

2)小鼠经动物房适应性饲养3天后开始实验，连续3天腹腔注射10mg/mL环磷酰胺溶液，第4天用带有萤光酶的重组基因的MCMV突变体(命名为Luc-MCMV)BA转染小鼠成纤维细胞，即NIH 3T3，收集细胞培养上清以及细胞裂解液，即为具有感染活性的Luc-MCMV病毒；

3)将收获的具有感染活性的Luc-MCMV病毒和野生型小鼠巨细胞病毒(命名为Wt-MCMV)同时感染NIH 3T3细胞，噬斑法测定病毒滴度，分别测定它们的滴度并绘制病毒生长曲线；

4)用NIH 3T3细胞扩大病毒培养，收集细胞培养上清与细胞裂解液，然后进行分级离心与超速离心，用生物发光成像技术测定Luc-MCMV在细胞中的萤光强度，即反映病毒在细胞中的复制与繁殖状况；

5)以更昔洛韦为对照药物，选择以往文献中具有潜在抗HCMV活性的中药单体，通过MTT实验确定各中药单体的最大无毒浓度，在安全药物浓度下进行后续抗病毒活性研究；

6)按MOI＝1加入Luc-MCMV，BLI检测其发光强度，并用软件定量发光值，分析各中药单体是否具有抗MCMV活性；

7)取小鼠唾液腺制备SG-Luc-MCMV，分别感染细胞和小鼠。

实验得出：在未对细胞培养上清与细胞裂解液上清进行Spectrum CT成像系统测定Luc-MCMV在细胞中的萤光强度检测情况下，不能准确得出实验小鼠的抗体情况。

判断标准：

1、用0.5μl和1μlLipo2000转染3d后均可检测到强萤光信号，镜下细胞状态佳，转染成功，噬斑法示NIH 3T3细胞感染8d内，Luc-MCMV与Wt-MCMV生长大致相同，Luc-MCMV滴度为6.2×106PFU/mL，将Luc-MCMV梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，结果示病毒被稀释10-7后仍然能检测到萤光强度。

2、MTT实验结果显示各药物的TC0分别为更昔洛韦625μg/ml，黄芪甲苷和黄芩素1.6μg/ml，苦参碱和绿原酸40μg/ml，槲皮素和穿心莲内酯8μg/ml，按MOI＝1加入Luc-MCMV，感染后第3、5、7、9d的生物萤光检测结果表明，槲皮素、苦参碱、穿心莲内酯、绿原酸与对照组相比，发光强度没有显著差异，与更昔洛韦组相比差异显著，黄芩素与黄芪甲苷与对照组相比，发光强度具有显著差异。

本发明的有益效果是：该带萤光素酶标签的抗MCMV药物的高效筛选方法，通过利用带有萤光素酶基因的重组病毒，通过检测重组病毒中萤光素酶的萤光强度来反映病毒复制变化的情况，在通过添加不同的药物的情况下，在体内外通过检测病毒在体内外萤光变化的病毒复制情况，从而快速筛选出筛选抗MCMV活性的中药单体，进而减少了筛选药物的周期，解决了筛选药物周期长的问题.

并且，通过利用生物萤光这这种方法能够快速筛选抗病毒药物的从而建立起细胞模型，通过在体外筛选出了和更昔洛韦具有相似抗MCMV活性的中药单体黄芩素和黄芪甲苷，提高了筛选中药单体黄芩素和黄芪甲苷的准确性，通过在GCV在动物中也能显著抑制Luc-MCMV的复制与繁殖，表现出良好的抑制病毒的活性，解决了筛选药物准确性低的问题。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。