具体实施方式

在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。

I.定义

在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文使用的和除非另作说明，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的加或减10％之内。在需要整数的情况下，该术语是指在给定值或范围的加或减10％之内、向上或向下舍入到最接近的整数。

如本文所用的，术语“溶瘤病毒”是这样一种病毒，相比非癌细胞它们在癌细胞中表现出增强的复制和裂解。某些实施方式中，溶瘤病毒在癌细胞中表现出选择性复制，在非癌细胞中表现出较少或基本上没有复制。某些实施方式中，较少复制的意思是癌细胞中的复制相比对应的非癌细胞至少高出约30％、或至少高出约50％、或至少高出约80％。

如本文所用的，术语“溶瘤作用”是指至少10％的增殖细胞被溶解(例如，至少约20％、30％、40％、50％或75％的细胞被溶解)。例如，可通过在哺乳动物中测量新生物大小或增殖细胞数量的减少或通过在体外(例如，来自增殖细胞的活组织检查)测量细胞溶解的量而确定细胞溶解的百分比。病毒的有效量将基于个体而确定，并且可基于(至少部分地)使用的特定病毒；个体的大小、年龄、性别；和异常增殖细胞的尺寸和其他特征。例如，对于治疗人类，取决于存在的增殖细胞或者新生物的类型、尺寸和数量，使用约10³至10¹²蚀斑形成单位(PFU)的病毒。有效量可以是，例如，从约1.0PFU/kg体重至约10¹⁵PFU/kg体重(例如，从约10²PFU/kg体重至约10¹³PFU/kg体重)。任选地，有效量为约1×10⁸至约1×10¹²TCID₅₀。任选地，有效量为约1×10¹⁰TCID₅₀。

如本文所用的，黄病毒属病毒可以包括但不限于日本脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus，JEV)、西尼罗河病毒(West Nile virus，WNV)、蜱传脑炎病毒(tick-bome encephalitis，TBEV)、黄热病病毒(yellow fever virus，YFV)、登革热病毒(denguevirus，DENV)、寨卡病毒(zika virus，ZIKV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitisvirus，SLEV)、墨累山谷脑炎病毒(Murray Valley encephalitis virus，MVEV)、鄂木斯克出血热病毒(Omsk hemorrhagic fever virus)和卡萨诺尔森林病病毒(Kyasanur ForestDisease Virus)或其任何相关的黄病毒。

如本文中所用的，黄病毒3’非翻译区的5’端茎环区(SL)、哑铃区(DB)、重复环化序列区3(RCS3)、环化序列区3(CS3)、重复环化序列区2(RCS2)、环化序列区2(CS2)、环化序列区1(CS1)以及环化序列区1后的短发夹-3’端茎环区(sHP-3’SL)均是相应领域内术语。在另一些研究中茎环区(SL)也被称为可变区(variable region，VR)。

如本文所用的，术语“活减毒病毒”或“减毒病毒”是指以其感染宿主、在宿主内复制、包装、再次感染宿主或其组合的能力被减弱的方式，从原始亲代病毒或野生型病毒改变的病毒。一般而言，这样的减弱可以在病毒的若干或所有宿主中，或仅在病毒的一种或若干宿主中。因此，活减毒病毒的减弱(即是说，其感染宿主、在宿主内复制、包装、再次感染宿主或其组合的能力被减弱)通常与病毒的一种或多种宿主有关，其中在病毒的一种或多种其它宿主中活减毒病毒不显著或可测量地减弱。本文公开的活减毒病毒通常经遗传改变，或可被称为突变的、突变体、经基因工程改造、重组体或组合。

如本文所用的，术语“活减毒疫苗”或“减毒疫苗”是指包含活减毒病原体、例如病毒的药物组合物。药物组合物包含至少一种免疫活性组分，其在受试者中针对病毒诱导免疫反应，保护受试者免于由于病毒导致的死亡或可能的死亡，或二者，和任选地可包括一种或多种增强活性组分的免疫活性的另外的组分。疫苗可另外包括对药物组合物典型的其它组分。至少一种免疫活性组分是一种或多种本文所述的活减毒病毒。

如本文所用的，术语“病毒拯救”是将包含病毒序列的体外构建物导入合适细胞，产生具有侵染性或感染性的病毒的过程。“重组病毒”是指通过重组DNA技术产生的遗传工程化病毒，可人为地对病毒序列进行任意缺失、插入、颠倒、置换等遗传操作，以区别于天然存在的病毒。

如本文所用的，术语“重组RNA病毒”是指包含异源RNA的本文所述病毒。

如本文所用的，术语“野生型”在病毒的情况下，是指流行的、自然传播并发生典型疾病爆发的病毒的类型。在其它实施方案中，在病毒的情况下，术语“野生型”是指亲代病毒。

如本文所用的，术语“自杀基因”是指编码能够将药物前体转变为细胞毒性药物的蛋白质的基因。合适的自杀基因的代表性示例包括但不限于胸苷激酶(TK)、胸苷酸激酶、胞嘧啶脱氨酶(CDase)和尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRTase)。

如本文所用的，术语“感染复数”或“MOI”是每个被感染细胞的感染性病毒颗粒的平均数。通过将所加入的感染性病毒颗粒数(ml所加x PFU/ml)除以所加入的细胞数(ml所加x细胞/ml)来计算MOI。

II.具体实施方式详述

在一方面，本公开提供了一种溶瘤病毒，所述溶瘤病毒包含减毒黄病属病毒，所述减毒黄病属病毒包含多聚腺苷酸(poly(A))序列，其中，所述多聚腺苷酸(poly(A))序列用于替换所述黄病属病毒的3’非翻译区(3’UTR)的部分核苷酸序列，使得所述黄病属病毒被替换部分核苷酸序列后所获得的所述减毒黄病属病毒的3’非翻译区(3’UTR)至少保留3’端茎环区(3’SL)。

根据前一方面的减毒黄病属病毒，所述的部分核苷酸序列包括所述的部分核苷酸序列包括3’非编码区(3’UTR)中的5’端茎环区(5’SL)的全部或部分、环化序列区(CS)的全部或部分、和/或哑铃区(DB)的全部或部分核苷酸序列。

在本公开的一些优选实施方案中，所述的部分核苷酸序列被多聚腺苷酸(poly(A))序列替换后，所述的减毒黄病属病毒的3’非翻译区(3’UTR)至少保留3’非翻译区的环化序列区1(CS1)以及环化序列区1后的短发夹-3’端茎环区(sHP-3’SL)。

在本公开的一些优选实施方案中，所述3’非编码区(3’UTR)中的5’端茎环区(5’SL)选自茎环区I(SLI)、茎环区II(SLII)、茎环区III(SLIII)和茎环区Ⅳ(SLIV)。

在本公开的一些优选实施方案中，所述环化序列区(CS)选自环化序列区1(CS1)、环化序列区2(CS2)、环化序列区3(CS3)、重复环化序列区2(RCS2)和重复环化序列区3(RCS3)。

在本公开的一些优选实施方案中，所述哑铃区(DB)选自哑铃区1(DB1)和哑铃区2(DB2)。

根据前述任一方面的减毒黄病属病毒，其中，所述多聚腺苷酸(poly(A))序列包含10-200个腺苷酸。

在本公开的一些优选实施方案中，所述多聚腺苷酸(poly(A))序列包含50-180、100-160个腺苷酸；更优选130-150个腺苷酸，优选130或150个腺苷酸。

在本公开的一些优选实施方案中，所述黄病毒属病毒选自日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、西尼罗河病毒(West Nile virus，WNV)、蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis，TBEV)、黄热病病毒(yellow fever virus，YFV)、登革热病毒(dengue virus，DENV)、寨卡病毒(zika virus，ZIKV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louisencephalitis virus，SLEV)、墨累山谷脑炎病毒(Murray Valley encephalitis virus，MVEV)、鄂木斯克出血热病毒(Omsk hemorrhagic fever virus)和卡萨诺尔森林病病毒(Kyasanur Forest Disease Virus)。

在本公开的一些优选实施方案中，所述减毒黄病属病毒噬斑效价为1×10⁵-1×10⁹PFU/ml；更优选为5×10⁴-5×10⁶PFU/ml。

在本公开的一些优选实施方案中，所述减毒黄病属病毒与亲本野生型病毒相比毒力降低10-100倍。

在本公开的一些优选实施方案中，所述减毒黄病属病毒在幼仓鼠肾细胞BHK-21上拯救和/或所述在非洲绿猴肾细胞Vero细胞上扩增而得到。

在本公开的一些优选实施方案中，所述登革热病毒选自登革热病毒1型、2型、3型和4型。

在本公开的一些优选实施方案中，所述减毒黄病属病毒为减毒西尼罗病毒。在本公开的一些优选实施方案中，所述减毒西尼罗病毒包含与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列。在本公开的一个具体实施方案中，所述减毒西尼罗病毒的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

在本公开的一些优选实施方案中，所述减毒黄病属病毒为减毒日本脑炎病毒。在本公开的一些优选实施方案中，所述减毒日本脑炎病毒包含与SEQ ID NO.2所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列。在本公开的一个具体实施方案中，所述减毒日本脑炎病毒的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

在本公开的一些优选实施方案中，所述减毒黄病属病毒为减毒登革热病毒。在本公开的一些优选实施方案中，所述减毒登革热病毒包含与SEQ ID NO.3所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列。在本公开的一个具体实施方案中，所述减毒登革热病毒的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

在本公开的一些优选实施方案中，所述减毒黄病属病毒为减毒黄热病病毒。在本公开的一些优选实施方案中，所述减毒黄热病病毒包含与SEQ ID NO.4所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列。在本公开的一个具体实施方案中，所述减毒黄热病病毒的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。

在本公开的一些优选实施方案中，所述减毒黄病属病毒为减毒寨卡病毒。在本公开的一些优选实施方案中，所述减毒寨卡病毒包含与SEQ ID NO.5所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列。在本公开的一个具体实施方案中，所述减毒寨卡病毒的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。

在本公开的一些优选实施方案中，所述减毒黄病属病毒为减毒蜱传脑炎病毒。在本公开的一些优选实施方案中，所述减毒蜱传脑炎病毒包含与SEQ ID NO.6所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列。在本公开的一个具体实施方案中，所述减毒蜱传脑炎病毒的核苷酸序列为SEQ ID NO.6。

在本公开的一个优选实施方案中，所述的部分核苷酸序列包括5’端茎环区I(SLI)、茎环区II(SLII)、重复环化序列区3(RCS3)、茎环区III(SLIII)、茎环区IV(SLⅣ)、环化序列区3(CS3)，所述的部分核苷酸序列被多聚腺苷酸(poly(A))序列替换后，所述的减毒黄病属病毒的3’非翻译区(3’UTR)保留3’非翻译区的哑铃区1(DB1)、重复环化序列区2(RCS2)、哑铃区2(DB2)、环化序列区2(CS2)、环化序列区1(CS1)以及环化序列区1后的短发夹-3’端茎环区(sHP-3’SL)。

在本公开的一个优选实施方案中，所述的部分核苷酸序列包括哑铃区1(DB1)、重复环化序列区2(RCS2)、哑铃区2(DB2)、环化序列区2(CS2)、环化序列区1(CS1)，所述的部分核苷酸序列被多聚腺苷酸(poly(A))序列替换后，所述的减毒黄病属病毒的3’非翻译区(3’UTR)保留3’非翻译区中的5’端茎环区I(SLI)、茎环区II(SLII)、重复环化序列区3(RCS3)、茎环区III(SLIII)、茎环区IV(SLIV)、环化序列区3(CS3)以及短发夹-3’端茎环区(sHP-3’SL)。

在本公开的一个优选实施方案中，所述的部分核苷酸序列包括5’端茎环区I(SLI)、茎环区II(SLII)、重复环化序列区3(RCS3)、茎环区III(SLIII)、茎环区IV(SLIV)、环化序列区3(CS3)、哑铃区1(DB1)、重复环化序列区2(RCS2)、哑铃区(DB2)、环化序列区2(CS2)，所述的部分核苷酸序列被多聚腺苷酸(poly(A))序列替换后，所述的减毒黄病属病毒的3’非翻译区(3’UTR)保留3’非翻译区的环化序列区1(CS1)以及环化序列区1后的短发夹-3’端茎环区(sHP-3’SL)。

在本公开的一个优选实施方案中，所述的部分核苷酸序列包括5’端茎环区II(SLII)、重复环化序列区3(RCS3)、茎环区Ⅳ(SLⅣ)、环化序列区3(CS3)、哑铃区1(DB1)、重复环化序列区2(RCS2)、哑铃区(DB2)、环化序列区2(CS2)，所述的部分核苷酸序列被多聚腺苷酸(poly(A))序列替换后，所述的减毒黄病属病毒的3’非翻译区(3’UTR)保留3’非翻译区的环化序列区1(CS1)以及环化序列区1后的短发夹-3’端茎环区(sHP-3’SL)。

在本公开的一个优选实施方案中，所述的部分核苷酸序列包括5’端茎环区II(SLII)、重复环化序列区3(RCS3)、哑铃区(DB)、重复环化序列区2(RCS2)、哑铃区(DB2)、环化序列区2(CS2)，所述的部分核苷酸序列被多聚腺苷酸(poly(A))序列替换后，所述的减毒黄病属病毒的3’非翻译区(3’UTR)保留3’非翻译区的5’端茎环区(SL)、环化序列区1(CS1)以及环化序列区1后的短发夹-3’端茎环区(sHP-3’SL)。

在本公开的一些优选实施方案中，所述溶瘤病毒还至少包含编码至少一个外源基因的序列。

在本公开的一些优选实施方案中，所述外源基因是治疗性基因。

在本公开的一些优选实施方案中，所述治疗基因是免疫刺激性基因或自杀基因。

在本公开的一些优选实施方案中，所述免疫刺激基因编码免疫刺激蛋白；优选地，所述免疫刺激蛋白选自细胞因子、趋化因子、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子、暴露于APC(抗原呈递细胞)的蛋白、生长因子、I类或II类主要组织相容性复合物(MHC)组分、细胞凋亡诱导物或抑制物、细胞生长抑制剂、免疫毒素和免疫检查点抑制剂的免疫逃逸机制的阻滞物。

在本公开的一些优选实施方案中，所述细胞因子是白细胞介素，更优选地，所述细胞因子选自IL-2、IL-6、IL-12、IL-15和IL-24。

在本公开的一些优选实施方案中，所述趋化因子选自CXCL10、CXCL9和CXCL11。

在本公开的一些优选实施方案中，所述干扰素选自IFN7和IFNα。

在本公开的一些优选实施方案中，所述集落刺激因子选自GM-CSF、G-CSF和M-CSF。

在本公开的一些优选实施方案中，所述APC(抗原呈递细胞)的蛋白选自B7.1和B7.2。

在本公开的一些优选实施方案中，所述生长因子选自转化生长因子TGF、成纤维细胞生长因子FGF和血管内皮生长因子VEGF。

在本公开的一些优选实施方案中，所述细胞凋亡诱导物或抑制物选自Bax、Bcl2和BcIX。

在本公开的一些优选实施方案中，所述细胞生长抑制剂选自p21、p16和Rb。

在本公开的一些优选实施方案中所述自杀基因选自胸苷激酶(TK)、胸苷酸激酶、胞嘧啶脱氨酶(CDase)和尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRTase)。

在一方面，本公开提供了一种DNA，所述DNA可被转录而产生所述的溶瘤病毒。

在本公开的一些优选实施方案中，所述DNA是黄病毒属病毒减毒株的感染性克隆。

在本公开的一些优选实施方案中，所述感染性克隆是质粒。

在一方面，本公开提供了一种细胞，其包含所述溶瘤病毒或所述DNA。

在一方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含所述溶瘤病毒、所述DNA和/或所述细胞。

在一方面，本公开提供了一种所述溶瘤病毒、所述DNA、所述细胞和/或所述组合物在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。

在本公开的一些优选实施方案中，所述肿瘤和/或癌症选自黑色素瘤、肝癌及卵巢癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌和胶质瘤。

在本公开的一些优选实施方案中，所述药物可一次或多次给药。

在本公开的一些优选实施方案中，所述药物可局部或全身给药。

本文的实施方案提供了以适于体内药物施用的生物相容形式向受试者施用组合物。“适于体内给药的生物相容形式”是指待施用的活性剂(例如，实施方案的药剂)的形式，其中活性剂的治疗效果超过任何毒性作用。治疗有效量的治疗组合物的施用定义为在实现期望结果必需的剂量和时间段上有效的量。例如，化合物的治疗活性量可以随诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发期望响应的能力等因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳治疗响应。

在一个实施方案中，化合物(例如，实施方案的活的减毒病毒)可以以方便的方式施用，例如，皮下、静脉内、通过口服施用、吸入、皮内、透皮应用、阴道内应用、局部施用、鼻内或直肠施用。根据施用途径，活性化合物可以包含在保护性缓冲液(例如清蛋白和海藻糖、泊洛沙姆407/海藻糖/清蛋白(FTA))中。在一个实施方案中，组合物可以口服施用。在另一个实施方案中，组合物可以静脉内施用。在一个实施方案中，组合物可以鼻内施用，例如吸入。在另一个实施方案中，组合物可以使用无针系统(例如)或其他皮内施用系统皮内施用。

在某些实施方案中，活的减毒病毒疫苗(例如，西尼罗病毒疫苗可以以稳定配制剂(例如清蛋白和海藻糖；FTA，或用于稳定活的减毒病毒的其他配制剂)施用于儿童或年轻人。如本文所用，“药学可接受载体”还可以包括稀释剂，例如盐水和水性缓冲溶液。可能有必要将活的减毒病毒配制剂与防止其失活的材料组合或将化合物与防止其失活的材料共施用。在某些实施方案中，活的减毒西尼罗病毒的一种或多种配制剂可以以初始剂量，接着在加强剂中对受试者皮下或皮内施用。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备分散剂。在通常的储存和使用条件下，这些制剂可以含有防腐剂，以防止微生物的生长或其他稳定化配方(例如，用于稳定化活的减毒黄病毒或其他稳定配制剂)。

适于可注射使用的药物组合物可以通过本领域已知的手段施用。例如，可以使用无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在一些实施方案中，组合物可以是无菌的并且可以是流体以易于可注射性。药学可接受载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用诸如卵磷脂的涂层材料，通过在分散体的情况下维持需要的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过添加各种抗细菌剂或抗真菌剂或其他试剂来实现微生物的预防。

在一些实施方案中，在配制时，溶液可以以与剂量配制剂相容的方式并以治疗有效的量施用。根据这些实施方案，配制剂可以容易地以多种剂型施用，例如上述可注射溶液的类型。

在某些实施方案中，单剂或多剂减毒黄病毒(例如西尼罗病毒)配制剂也可以施用于受试者。在一些实施方案中，可以用单剂配制剂治疗受试者。在其他实施方案中，可以用至少两剂活的减毒西尼罗病毒配制剂治疗受试者。在某些实施方案中，受试者可以在第0天施用减毒西尼罗病毒组合物，并在第一剂的约3个月内施用加强剂量。在某些实施方案中，受试者是从未暴露于西尼罗病毒的未免疫受试者(血清阴性)。在其他实施方案中，受试者可以先前暴露于西尼罗病毒和/或西尼罗病毒感染(血清阳性)。根据这些实施方案，血清阴性受试者可以在第0天进行治疗，然后在第一剂的6个月内、5个月内、4个月内、3个月内或更小接受加强剂，以便对西尼罗病毒产生增强的免疫应答。在某些实施方案中，儿童可以是约2岁至约17岁龄的儿童。在其他实施方案中，儿童是2岁至17岁龄。

在另一个实施方案中，鼻用溶液或喷雾剂、气溶胶或吸入剂可以用于将活的减毒黄病毒(例如西尼罗病毒)病毒配制剂递送至受试者。某些配制剂可以包含赋形剂，例如，药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

可以用载体制备药物组合物，所述载体保护活性成分免于从体内快速消除，例如定时释放配制剂或涂层材料。此类载体可以包括受控释放配制剂，例如但不限于微包囊的递送系统和可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚乳酸和已知的其它物质。

在某些实施方案中，活的减毒黄病毒(例如西尼罗病毒)的剂量范围可以是最初施用的约10²至约10⁶PFU，并且任选地，然后是根据需要在30天内或之后长达12个月的至少第二次施用。

在某些实施方案中，本文公开的药物组合物可以在一剂或多剂中施用于受试者。在一些实施方案中，本文公开的免疫原性组合物可以以单剂或两剂或更多在预先确定的时间段内，包括但不限于约6个月内、约120天内、约90天内、约80天内、约70天内、约60天内、约50天内、约40天内、约30天内、约20天内、约10天内、约5天内或更小，或者在同一天在几小时或几分钟内施用于受试者或者在相同或不同解剖位置中同时施用。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以在彼此的约90天内、在彼此的约60天内、在彼此的约30天内、以及在彼此的小于约30天内施用。在一些实施方案中，本文公开的组合物可以皮下或皮内施用于受试者。在两个或更多个解剖部位中的施用可以包括施用的任何组合，包括在两个或更多个解剖部位中通过相同模式或者通过包括两个分开的解剖部位的两种不同模式。根据这些实施方案，两个或更多个解剖部位可以包括身体的不同肢体或不同区域。在某些实施方案中，可以在第0天在相同或多个解剖学位置中将两剂疫苗组合物连续导入受试者，例如以提供保护而免于所有黄病毒(例如西尼罗病毒)血清型(例如，交叉保护)。在其他实施方案中，药物组合物可以包括活的减毒西尼罗病毒与针对其他黄病毒(例如，寨卡病毒、日本脑炎、西尼罗河病毒、圣路易斯脑炎病毒、黄热病或其他病毒)的其他免疫原性试剂的组合。在某些实施方案中，本文公开的针对西尼罗病毒的疫苗可以用于减少其他相关的病毒感染，例如寨卡病毒感染。

在一些实施方案中，可以使用本文中公开的药物组合物来增加受试者中靶配制剂的免疫应答，其通过在接受此类针对黄病毒(例如西尼罗病毒)病毒的药物组合物的儿童或年轻人中组合针对黄病毒(例如西尼罗病毒)病毒的免疫原性组合物与加强CD8+ T细胞应答或针对西尼罗病毒的其他免疫应答的试剂进行。

通过局部应用的含有治疗有效量的丝氨酸蛋白酶抑制剂的乳膏、凝胶、冲洗液等完成局部施用。通过应用能够使丝氨酸蛋白酶抑制剂穿透皮肤并进入血流的乳膏、冲洗液、凝胶等完成经皮施用。另外，渗透泵可以用于施用。必要的剂量将随着所治疗的具体状况、施用方法和分子从身体清除的速率而变化。

其他实施方案涉及减少活的减毒病毒失活的方法，包括但不限于组合一种或多种活的减毒病毒与能够减少活的减毒病毒(例如黄病毒)失活的组合物。这些组合物可以包括但不限于一种或多种蛋白质试剂；一种或多种糖或多元醇试剂；和任选地一种或多种EO-PO嵌段共聚物，其中所述组合物可以减少失活或稳定化活的减毒病毒。

在某些实施方案中，本文涵盖的组合物可以部分或完全脱水或水合。在其他实施方案中，涵盖用于本文的药物或非药物组合物的稳定蛋白质试剂可包括但不限于乳清蛋白、人血清清蛋白、重组人血清清蛋白(rHSA)、牛血清清蛋白(BSA)、其他血清清蛋白或清蛋白基因家族成员。糖或多元醇试剂可以包括但不限于单糖、二糖、糖醇、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、纤维二糖、龙胆二糖、laminaribose、木二糖、甘露二糖、乳糖、果糖、山梨糖醇、甘露醇、乳糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、棉子糖、淀粉酶、环糊精、壳聚糖或纤维素。在某些实施方案中，表面活性剂可以包括但不限于非离子表面活性剂，例如烷基聚(环氧乙烷)、聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)的共聚物(EO-PO嵌段共聚物)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、烷基多聚葡萄糖苷(例如蔗糖单硬脂酸酯，月桂基二葡糖苷或单月桂酸山梨糖醇酯(sorbitanmonolaureate)、辛基葡糖苷和癸基麦芽糖苷)、脂肪醇(鲸蜡醇或油醇(olelylalcohol))或椰油酰胺(cocamides)(椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA和椰油酰胺TEA)。

在其他实施方案中，表面活性剂可以包括但不限于泊洛沙姆407(例如Pluronic)、替换泊洛沙姆407或除泊洛沙姆407之外的泊洛沙姆335、338或238、或与具有类似特性的其他EO-PO嵌段共聚物。

在一些实施方案中，疫苗组合物可以包括但不限于一种或多种蛋白质试剂，其为血清清蛋白；一种或多种海藻糖糖类；和一种或多种表面活性剂聚合物试剂，例如EO-PO嵌段共聚物、泊洛沙姆407或更具体地，Pluronic

在其他实施方案中，用于稳定化活病毒的配制剂可以包含一种或多种活黄病毒、一种或多种碳水化合物试剂和一种或多种氨基酸或其盐、酯或酰胺衍生物。在其他实施方案中，本文使用的配制剂稳定化活的减毒黄病毒用于商业用途。在一些实施方案中，组合物还包含缓冲剂。根据这些实施方案，缓冲液可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)。根据这些实施方案，缓冲剂可以包括氯化钠(NaCl)、磷酸一钠和/或磷酸二钠(Na2HPO4)、氯化钾(KCl)和磷酸钾(KH₂PO₄)中的至少一种。在一些实施方案中，组合物的缓冲剂可以包含浓度25mM至200mM的氯化钠。在其他实施方案中，本文公开的组合物可以包含尿素和/或MSG其他合适的试剂。

在一些实施方案中，活的减毒黄病毒如西尼罗病毒可以在配制剂中稳定化，所述配制剂包含但不限于浓度0.1％至0.2％(w/v)的重组HSA；和/或浓度约4.0％至约6.0％(w/v)的蔗糖；和/或浓度约2％至4％(w/v)的甘露醇浓度；和/或浓度约8.0mM至约22.0mM的丙氨酸；和/或浓度约1.0mM至约5.0mM的甲硫氨酸；和/或浓度约8.0mM至12.0mM的MSG；和/或浓度约0.1％至约0.3％(w/v)的尿素。在某些实施方案中，组合物可以包含重组HSA、海藻糖、甘露醇、丙氨酸、甲硫氨酸、MSG和尿素。在其他实施方案中，稳定化组合物可以包含浓度约0.1％至约0.2％(w/v)的HSA；浓度约4％至约6％(w/v)的海藻糖；浓度约2％至约4％(w/v)的甘露醇；其中丙氨酸浓度为8mM至22mM；其中甲硫氨酸浓度为1mM至5mM；其中MSG浓度为8mM至12mM；其中尿素浓度为0.1％至0.3％(w/v)。用于稳定化活的减毒病毒的某些配制剂可以包含但不限于重组HSA、蔗糖、丙氨酸和尿素。根据这些实施方案，HSA浓度可为约0.1％至约0.2％(w/v)；蔗糖浓度可以为约4％至约6％(w/v)；丙氨酸浓度可以为约8.0mM至约22mM；并且尿素浓度可以为约0.1％至约0.3％(w/v)。其他稳定化配制剂可以包括重组HSA、蔗糖、甲硫氨酸和尿素。重组HSA浓度可以为约0.1％至0.2％(w/v)；蔗糖浓度可以为约4.0％至约6.0％(w/v)；甲硫氨酸浓度可以为约1.0mM至约5.0mM；尿素浓度可以为约0.1％至约0.3％(w/v)。在其他实施方案中，稳定化配制剂可以包含重组HSA、蔗糖、精氨酸和尿素，其中重组HSA浓度可以为0.1％至0.2％(w/v)；蔗糖浓度可以为4％至6％(w/v)；精氨酸浓度可以为10mM至50mM；尿素浓度可以为0.1％至0.3％(w/v)。其他稳定化配制剂可以包括重组HSA、海藻糖、精氨酸和尿素，其中重组HSA浓度为约0.1％至0.2％(w/v)；海藻糖浓度为约4％至6％(w/v)；精氨酸浓度为约10mM至50mM；尿素浓度为约0.1％至0.3％(w/v)。在其他实施方案中，稳定化组合物可以包括重组HSA、海藻糖、MSG和尿素。根据这些实施方案，重组HSA浓度可以为约0.1％至约0.2％(w/v)；海藻糖浓度可以为约4.0％至约6.0％(w/v)；其中MSG浓度为8mM至12mM；并且其中尿素浓度为0.1％至0.3％(w/v)。

本文的一些实施方案涉及用于运输或其他原因的部分或完全脱水的活的减毒病毒组合物。根据这些实施方案，组合物可以是20％或更多；30％或更多；40％或更多；50％或更多；60％或更多；70％或更多；80％或更多；或90％或更多脱水的。根据这些实施方案，在将药学可接受组合物施用受试者之前，病毒疫苗组合物可以脱水并在任何已知的稳定化组合物中再水合。

在某些实施方案中，受试者可以是哺乳动物，诸如人或兽医和/或家养动物或家畜或野生动物。在某些实施方案中，本公开的免疫原性组合物可以有效免疫青少年受试者，例如20岁龄或更小的人儿童。尽管与儿童使用的当前登革热病毒疫苗/免疫原性组合物(例如登革热/黄热病嵌合体)相关的现有技术报道了9岁龄或更小的儿童的低效力和/或免疫原性，但本文公开的免疫原性组合物可以在约1岁至约17岁或约1岁至约9岁龄或更大的儿童中产生有效免疫应答。与现有技术相比，本文公开的免疫原性组合物表现出优异的功效和免疫原性。

本发明的溶瘤病毒可以在BHK细胞或Vero细胞中扩增，病毒滴度可达到(1～10)×10⁷PFU。

实验证明，本发明的溶瘤病毒对12种肿瘤细胞系(包括Huh7(人肝癌上皮样细胞)、A549(人肺上皮细胞癌)、PC9(非小细胞肺癌细胞)、H1975(非小细胞肺癌细胞)、SKOV3(人卵巢上皮腺癌细胞)、U87MG(人脑上皮胶质母细胞瘤细胞)、U118MG(人脑胶质瘤细胞)、B16F1(小鼠黑色素瘤细胞)、4T1(小鼠乳腺上皮癌细胞)、HELA(人宫颈上皮腺癌细胞)、A375(人皮肤上皮黑色素瘤、A2058(人皮肤/淋巴结黑色素瘤)))具备细胞杀伤活性。并且，本发明利用小鼠黑色素瘤荷瘤模型、人黑色素瘤裸鼠荷瘤模型、人肝癌细胞裸鼠荷瘤模型及人卵巢癌裸鼠荷瘤模型，验证了本发明的溶瘤病毒以病毒剂量为1×10⁷PFU时在动物体内具有溶瘤作用，证实了本发明的溶瘤病毒具有良好的肿瘤靶向性以及抗肿瘤效果。

与经典肿瘤治疗方法相比，本发明的溶瘤病毒在体外细胞实验中可以感染和裂解多种肿瘤细胞，而对正常细胞影响较小，本身具有良好的肿瘤趋性，可以特异性杀伤肿瘤细胞。在异种移植肿瘤模型中可以抑制黑色素瘤、肝癌及卵巢癌的体内肿瘤生长，延迟肿瘤进展，即在体外或体内实验效果一致。另一方面，与其他溶瘤病毒疗法相比，本发明的溶瘤病毒由于是减毒的病毒株，故其具有更好的安全性及可靠性。本发明的溶瘤病毒能在Vero细胞中高效复制且病毒传代稳定，易用后期生产和应用。本发明的溶瘤病毒为RNA病毒，其cDNA易于操作，利于病毒基因组后期改造及应用。本发明的溶瘤病毒作为一种新型溶瘤病毒具有极大的肿瘤治疗应用前景。

实施例

本部分中所涉及的病毒感染、免疫荧光、CCK8检测细胞存活、病毒紫外灭活、病毒滴度测定、小鼠体内荷瘤模型建模、小鼠体内肿瘤瘤内给药、肿瘤组织研磨及病毒滴定测定等实验方法，如无特殊说明，均采用本领域的常规方法。以下列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以下实施例，还可以有许多变形。因此本领域的技术人员在本发明公开内容的基础上做的修改或改进，均应属于本发明要求保护的范围。

实施例1：黄病毒减毒株克隆的构建及病毒拯救

1.黄病毒减毒株克隆构建

黄病毒减毒株克隆构建示意图如图1所示。

以野生型(WT)的西尼罗病毒(WNV)毒株的感染性克隆的质粒DNA为骨架，将WNV的3’非翻译区(3’UTR)中从SLI至CS2的序列(包括5’端茎环区I(SLI)、茎环区II(SLII)、重复环化序列区3(RCS3)、茎环区III(SLIII)、茎环区Ⅳ(SLⅣ)、环化序列区3(CS3)、哑铃区1(DB1)、重复环化序列区2(RCS2)、哑铃区(DB2)、环化序列区2(CS2))删除，保留3’非翻译区的环化序列区1(CS1)以及环化序列区1后的短发夹-3’端茎环区(sHP-3’SL)，并在因删除从SLI至CS2的序列而造成的缺失部位插入poly(A)序列(130个腺苷酸)，得到WNV-poly(A)病毒减毒株质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

以野生型(WT)的日本脑炎病毒(JEV)毒株的感染性克隆的质粒DNA为骨架，将JEV的3’非翻译区(3’UTR)中从SLI至CS2的序列(包括SLI、SLII、RCS3、SLIII、SLIV、CS3、DB1、RCS2、DB2、CS2)删除，保留3’非翻译区的环化序列区1(CS1)以及环化序列区1后的短发夹-3’端茎环区(sHP-3’SL)，并在因删除从SLI至CS2的序列而造成的缺失部位插入poly(A)序列(150个腺苷酸)，得到JEV-poly(A)病毒减毒株质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

以野生型(WT)的登革热病毒2型新几内亚岛毒株(DENV-2(NGC))毒株的感染性克隆的质粒DNA为骨架，将DENV-2(NGC)的3’非翻译区(3’UTR)中从SLII至CS2的序列(包括SLII、RCS3、SLⅣ、CS3、DB1、RCS2、DB2、CS2)删除，保留3’非翻译区的环化序列区1(CS1)以及环化序列区1后的短发夹-3’端茎环区(sHP-3’SL)，并在因删除从SLI至CS2的序列而造成的缺失部位插入poly(A)序列(140个腺苷酸)，得到DENV-2(NGC)-poly(A)病毒减毒株质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

以野生型(WT)的黄热病病毒(YFV)毒株的感染性克隆的质粒DNA为骨架，将YFV的3’非翻译区(3’UTR)中从SLII至CS2的序列(包括SLII、RCS3、DB)删除，保留3’非翻译区的茎环区(SL)、环化序列区1(CS1)以及环化序列区1后的短发夹-3’端茎环区(sHP-3’SL)，并在因删除从SLI至CS2的序列而造成的缺失部位插入poly(A)序列(130个腺苷酸)，得到YFV-poly(A)病毒减毒株质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述毒株质粒均是以poly(A)序列替换3’UTR区中全部或部分5’端茎环区(SL)序列和全部DB序列，至少保留3’非翻译区的环化序列区1(CS1)以及环化序列区1后的短发夹-3’端茎环区(sHP-3’SL)，分别得到对应的poly(A)病毒减毒株质粒。

2.poly(A)体外转录RNA

将步骤1获得的poly(A)病毒减毒株质粒进行线性化，经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定线性化完全后，进行酚氯仿抽提，最后加入11μL无RNAase的水溶解，使用ThermoScientific NanoDrop 2000测定DNA的浓度并电泳检测DNA的质量。取1μg酚氯仿抽提后的DNA作为模板，使用体外转录试剂盒T7 mMESSAGE mMACHINE kit(Ambion)，按照试剂盒说明书体外转录得到重组poly(A)RNA，即WNV-poly(A)、JEV-poly(A)、DENV-2(NGC)-poly(A)和YFV-poly(A)病毒减毒株的基因组RNA。用Thermo Scientific NanoDrop 2000测定RNA的浓度，使用0.8％新鲜制备的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，于-80℃保存备用。

3.poly(A)病毒拯救

实验分为以下两组：

(1)实验组：将步骤2体外转录得到的重组poly(A)RNA使用脂质体转染的方法转染于BHK-21细胞；

(2)对照组：将野生型病毒RNA使用脂质体转染的方法转染于BHK-21细胞，做为阳性对照。

具体实验步骤如下：于转染前一天，接种2×105个BHK-21细胞于35mm细胞培养皿中，每皿放置三个10mm×10mm盖玻片，使细胞在转染当天达到约80％；转染时，先弃培养皿中培养基，用1ml Opti-MEM洗一次，再加1ml Opti-MEM(使细胞处于浸润状态)；于1.5ml EP管中加入1ml Opti-MEM，加4μl DMRIE-C(DMRIE-C用前先混匀)先上下颠倒混匀，再分别在实验组中加入1μg体外转录得到的重组poly(A)RNA，在对照组中加入1μg野生型病毒RNA，上下颠倒混匀；迅速弃培养皿中Opti-MEM，将混匀物加入皿中(动作要轻，勿对着细胞吹打)；于37℃ CO2培养箱中培养4h后，弃培养物，再各加2mL含2％FBS的DMEM培养基。显微镜下观察实验组和对照组的细胞状态，并分别于转染后24、48、72h取一个玻片用5％丙酮固定液(购于国药集团化学试剂公司)对细胞进行固定，室温固定15分钟，PBS洗三遍后，于4℃保存，并于IFA检测阳性率高时分别收集上清作为减毒黄病毒的poly(A)P0代病毒，即获得4种P0代WNV-poly(A)、JEV-poly(A)、DENV-2(NGC)-poly(A)和YFV-poly(A)减毒株，于-80℃保存。

4.间接免疫荧光(IFA)检测重组poly(A)的病毒蛋白表达

于室温环境下将上述步骤3中4℃保存的玻片孵育一抗，黄病毒减毒株抗体为1∶500倍稀释的4G2单克隆抗体(黄病毒E蛋白通用抗体)。室温孵育一抗1～2h，PBS冲洗10遍后，于室温避光孵育二抗，抗体为1∶125倍稀释的偶联异硫氰酸荧光素(FITC)羊抗鼠抗体。二抗孵育1h后，PBS冲洗10遍，取出载玻片，做好标记，每个标记处，点95％甘油，将盖玻片有细胞面朝下，置于甘油滴上，于荧光显微镜下使用200×放大倍数进行观察(图1)。

图1结果表明，WNV-poly(A)、JEV-poly(A)、DENV-2(NGC)-poly(A)和YFV-poly(A)减毒株在每个时间点的阳性率均比WT的低，但随着转染后培养时间的延长，阳性细胞数目逐渐增加，与WT趋势一致，表明WNV-poly(A)、JEV-poly(A)、DENV-2(NGC)-poly(A)和YFV-poly(A)均拯救出了感染性的病毒颗粒。

此外，将WNV-poly(A)、JEV-poly(A)、DENV-2(NGC)-poly(A)和YFV-poly(A)连续传代10代，polyA插入位置以及数量基本保持不变约130-150A，这表明以上poly(A)病毒具有很好的遗传稳定性。

后续实验使用WNV-poly(A)病毒进一步研究黄病毒属病毒减毒株对肿瘤细胞的溶瘤作用。

实施例2：体外WNV-poly(A)对肿瘤细胞的溶瘤作用

本实施例通过以固定MOI剂量的实施例1制备的WNV-poly(A)病毒减毒病毒(WNV-poly(A))感染肿瘤细胞后，明场观察其对肿瘤细胞的杀伤作用(图2A)，并用CCK8检测不同剂量WNV-poly(A)对肿瘤细胞的杀伤来确定病毒的体外溶瘤效果(图2B)。其中：

对照组(MOCK)：不加病毒的培养基培养的肿瘤细胞组；

实验组：加WNV-poly(A)的培养基培养的肿瘤细胞组。

1.明场观察WNV-poly(A)对肿瘤细胞及正常细胞的溶瘤作用

分别将12种肿瘤细胞Huh7、A549、PC9、H1975、SKOV3、U87MG、U118MG、B16F1、4T1、HELA、A375和A2058及3种正常细胞MLE-12、MEF、L-02细胞按照8×10⁴个细胞/孔接种于12孔细胞培养板中，采用加有10％血清(FBS)的DMEM或1640培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素，在37℃，5％CO₂加湿培养箱中培养。细胞贴壁生长后将培养基换成2％FBS的DMEM培养基，并以MOI＝10的WNV-poly(A)的剂量，在感染72小时后明场观察肿瘤细胞的死亡情况。

结果显示，在检测的12种肿瘤细胞中WNV-poly(A)都能明显诱导肿瘤细胞的死亡或生长显著抑制，但其对检测的3种正常细胞无明显影响(图2A)。以上结果初步表明了WNV-poly(A)在体外实验中具有广谱的溶瘤效果，且对正常细胞几乎无损伤。

2.CCK8检测不同剂量WNV-poly(A)对肿瘤细胞的溶瘤作用

为进一步定量验证WNV-poly(A)的体外溶瘤作用，利用CCK8检测试剂盒检测不同MOI剂量感染后病毒对肿瘤细胞的溶瘤作用。

测试方法为：分别将肿瘤细胞Huh7、A549、SKOV3、B16F1、4T1、HELA及正常细胞MLE-12、MEF、L-02细胞按照4000个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁生长后按照MOI分别为：0、0.001、0.01、0.1、1、10的剂量感染WNV-poly(A)，每组5个复孔。72小时后，利用CCK8检测试剂盒检测细胞活性。CCK8加入细胞后可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物，通过酶标仪检测波长450处读取的OD值间接反映活细胞数量，OD值的高低与细胞增殖情况成正比，与细胞毒性成反比。各组数据以无细胞与病毒的等体积DMEM培养基加CCK8为空白组，以未加病毒(MOI＝0)为对照组，计算公式＝(加病毒组-空白组)/(对照组-空白组)×100。结果通过GraphPadPrism7软件计算出平均值和标准差。结果绘制不同感染剂量WNV-poly(A)对各肿瘤细胞及正常细胞的细胞活性检测结果图。

结果如图2B所示，WNV-poly(A)对检测的6种肿瘤细胞具有明显的杀伤作用，但其对检测的3种正常细胞的存活无明显影响。且进一步观察不同MOI的作用发现，WNV-poly(A)对肿瘤细胞的杀伤呈明显的病毒感染剂量依赖性，随着病毒感染剂量的增加肿瘤细胞的死亡明显增加。此结果进一步确定了WNV-poly(A)在体外实验中具有显著且广谱的溶瘤效果，并对正常细胞几乎无损伤。

实施例3：体外WNV-wT和WNV-poly(A)对正常细胞和肿瘤细胞上的杀伤差异

本实施例通过以固定MOI剂量的野生型西尼罗病毒(WNV-WT由WNV感染性克隆3356株转染产毒得到)和实施例1制备的WNV-poly(A)病毒病毒(WNV-poly(A))感染肿瘤细胞后，明场观察其对正常细胞和肿瘤细胞的杀伤作用(图3A)，并用CCK8检测不同剂量WNV-WT和WNV-poly(A)对正常细胞和肿瘤细胞的杀伤来确定WNV-WT和WNV-poly(A)对正常细胞和肿瘤细胞上的杀伤差异，进一步的通过比较WNV-WT和WNV-poly(A)在正常细胞及肿瘤细胞上的生长曲线确定WNV-poly(A)对肿瘤细胞的杀伤特异性(图3B)。其中：

对照组(MOCK)：不加病毒的培养基培养的肿瘤细胞组；

实验组：加WNV-WT或WNV-poly(A)的培养基培养的肿瘤细胞组。

1.明场观察WNV-WT和WNV-poly(A)对正常细胞和肿瘤细胞的溶瘤作用

分别将3种肿瘤细胞B16F1、Huh7、SKOV3及正常细胞MLE-12、MEF、L-02细胞按照8×10⁴个细胞/孔接种于12孔细胞培养板中，10％血清(FBS)的DMEM或1640培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素，在37℃，5％CO₂加湿培养箱中培养。细胞贴壁生长后将培养基换成2％FBS的DMEM培养基，并以MOI＝10感染WNV-WT和WNV-poly(A)，在感染72小时后明场观察正常细胞和肿瘤细胞的死亡情况。

结果显示，在测试的3种肿瘤细胞中，明显可见WNV-WT和WNV-poly(A)对这3种肿瘤细胞的杀伤都很明显，但在3种正常细胞MLE-12、MEF及L-02中，WNV-WT都诱导显著的细胞死亡，而WNV-poly(A)对这3种细胞无杀伤作用(图3A)。以上结果初步表明相对WNV-WT、WNV-poly(A)具有对肿瘤细胞的溶瘤性。WNV-WT对正常细胞有杀伤作用，而WNV-poly(A)对正常细胞无杀伤作用。以上结果表明WNV-poly(A)具有对肿瘤细胞的溶瘤特异性。

2.CCK8检测不同剂量WNV-WT和WNV-poly(A)对正常细胞和肿瘤细胞的杀伤：

为进一步定量验证WNV-WT和WNV-poly(A)对肿瘤细胞和正常细胞的溶瘤差异性，利用CCK8检测试剂盒检测不同MOI剂量感染后病毒对各细胞的溶瘤作用。

测试方法为：分别将Huh7、SKOV3、B16F1及正常细胞MLE-12、MEF、L-02细胞按照4000个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁生长后按照MOI分别为：0、0.001、0.01、0.1、1、10的剂量分别感染WNV-WT和WNV-poly(A)，每组5个复孔。按照实施例2所述的CCK8检测方法测定感染72小时后细胞的存活情况。

结果显示，对3种肿瘤细胞而言，WNV-WT和WNV-poly(A)对3种肿瘤细胞都具有感染剂量依赖性的杀伤，且WNV-WT要比WNV-poly(A)的杀伤效果更明显(图3B)。从3种正常细胞的结果看，WNV-WT对检测的3种正常细胞都有明显的杀伤，且其杀伤呈明显的病毒感染剂量依赖性，但WNV-poly(A)对正常细胞无明显杀伤作用。以上结果进一步表明WNV-poly(A)具有对肿瘤细胞的溶瘤特异性。

3.WNV-WT和WNV-poly(A)在正常细胞MEF和肿瘤细胞Huh7、A375、B16F1内复制差异检测

本实验通过在35mm细胞培养皿中接种2×10⁵肿瘤细胞，在37℃，5％CO₂培养条件下，待汇合度达到60％时，按照感染复数MOI为10，向小皿中加入500μl稀释后的WNV-WT和WNV-poly(A)，37℃、5％CO₂培养箱中吸附2h后，弃病毒液，每孔中加入2ml含2％胎牛血清的DMEM培养基，于37℃，5％CO₂培养条件下培养，分别于感染后每24h收300μl病毒上清并补加300μl含2％胎牛血清的DMEM培养基，作为不同时间点的病毒样，于-80℃保存。将不同时间点的病毒样进行噬斑实验鉴定噬斑形态并测定其生长曲线：在24孔细胞培养板的各孔中分别接种1×10⁵个BHK-21细胞，待细胞汇合度达到90％时，弃孔中的培养基，加入100μL用含2％FBS的DMEM培养基10倍比稀释的上述不同时间点收集的病毒，37℃吸附1h，每15分钟充分晃动一次。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入含有2％FBS的DMEM培养基和2％甲基纤维素的覆盖物，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养4天，待噬斑形成后用含有1％结晶紫和3.7％甲醛的染色液染色，室温处理30min后，取出孔中的染色液，并用流水冲洗孔底，烘干后即可计数换算成病毒滴度，绘制生长曲线。结果表明WNV-WT和WNV-poly(A)在B16F1(图3C)，A375(图3D)，Huh7(图3E)细胞上都可以很好的扩增，但在正常细胞MEF上WNV-WT的扩增明显好于WNV-poly(A)(图3F)。

实施例4：西尼罗病毒减毒株引起肿瘤细胞凋亡

本实施例通过Anexin-V/PI染色及WB检测胞内Caspase3的剪切进一步确定WNV-poly(A)对肿瘤细胞Huh7、SKOV3、B16F1的杀伤方式。其中：

对照组(MOCK)：不加病毒的培养基培养的肿瘤细胞组；

实验组：加WNV-poly(A)的培养基培养的肿瘤细胞组。

1.用Anexin-V/PI检测WNV-poly(A)对Huh7、SKOV3和B16F1的凋亡作用

分别将肿瘤细胞Huh7、SKOV3、B16F1按照8×10⁴个细胞/孔接种于12孔细胞培养板中，10％血清(FBS)的DMEM或1640培养基过夜培养。细胞贴壁生长后将培养基换成2％FBS的DMEM培养基，并以MOI＝10剂量感染48小时后通过Anexin-V/PI染色测定肿瘤细胞的凋亡。

实验方法如下：用无EDTA的胰蛋白酶消化感染后的肿瘤细胞，并收集至EP管中。用200μl AnnexinV结合缓冲液重悬细胞。每管加5μl Annexin-V溶液，4℃避光孵育15min。再加入5μl 20μg/ml PI溶液，轻轻混匀，4℃避光孵育15min。将细胞转入流式管中，上机进行检测。Annexin V单染代表细胞发生早期凋亡，Annexin V/PI双染代表细胞处于晚期凋亡，PI单阳性代表发生细胞明显坏死。结果显示WNV-poly(A)能显著诱导肿瘤细胞Huh7、SKOV3的凋亡，且对B16F1具有明显的促坏死作用(图4A)。

2.WNV-poly(A)感染后检测Huh7、SKOV3和B16F1细胞内Caspase3的剪切

分别将肿瘤细胞Huh7、SKOV3、B16F1按照2×10⁵个细胞/孔接种于12孔细胞培养板中，细胞贴壁生长后将培养基换成2％FBS的DMEM，并以MOI＝10剂量分别于感染24h和感染48h收细胞样。

实验方法如下：每孔加200μl含有RIPA裂解液，用细胞刮收集细胞到新的EP管中，放冰上孵育30min，加入5×上样缓冲液(loadingbuffer)50μl，混合后于100℃加热10min，使其充分的变性，4℃，12000rpm，离心2min，除去沉淀，得到的上清样进行Westem-blot检测凋亡相关蛋白变化水平，以β-actin作为对照内参。结果显示Huh7，SKOV3在检测的24h及48h都出现了明显的Caspase3的剪切(图4B)。上述实验结果说明，WNV-poly(A)能引起显著的Huh7和SKOV3的凋亡，而造成B16F1细胞死亡的杀伤形式并不是凋亡。WNV-poly(A)引起肿瘤细胞溶瘤的机理除了凋亡外，可能还存在其他机理。

实施例5：灭活WNV-poly(A)对肿瘤细胞的溶瘤作用

本实施例通过UV对已知滴度的WNV-poly(A)病毒进行灭活处理，获得UV灭活的WNV-poly(A)(UV-WNV-poly(A))且通过上述噬斑实验确定病毒已完全灭活。

将肿瘤细胞Huh7和SKOV3按2×10⁵个细胞/孔接种于12孔细胞培养板中，细胞贴壁生长后将培养基换成2％FBS的DMEM，并以MOI＝10UV-WNV-poly(A)及WNV-poly(A)的剂量，感染48小时后用含有1％结晶紫和3.7％甲醛的染色液染色，室温处理30min后，取出孔中的染色液，并用流水冲洗孔底，烘干后观察UV灭活病毒对肿瘤细胞的作用。

实验结果显示，UV-WNV-poly(A)感染后结果与MOCK组一致，细胞生长正常，结晶紫染色完整，且无病毒空斑出现，而WNV-poly(A)感染后肿瘤细胞明显死亡，结晶紫染色显示基本无活细胞(图5)。这说明与WNV-poly(A)感染肿瘤细胞的相比，经过UV灭活的UV-WNV-poly(A)失去了对肿瘤细胞的溶瘤作用。

实施例6：体内检测WNV-poly(A)多次给毒后对黑色素瘤的溶瘤作用

本实施例选取2种黑色素瘤细胞系，分别是小鼠黑色素瘤细胞B16F1和人黑色素瘤细胞A375，建立体内移植瘤模型，瘤内3天给毒一次观察WNV-poly(A)对体内移植瘤的治疗作用。并进一步通过流式检测肿瘤内及系统的免疫应答情况。其中：

1.WNV-poly(A)对荷瘤模型小鼠体内肿瘤的作用

对照组(MOCK)：瘤内给不加病毒的2％FBS DMEM培养基；

实验组：瘤内给加WNV-poly(A)的2％FBS DMEM培养基。

实施方法如下：选择6-8周龄C57小鼠，皮下接种2×10⁵个鼠黑色素瘤细胞B16F1，至能触摸到移植瘤时，将小鼠分成两组，一组给予每只含1×10⁷PFU WNV-poly(A)的2％FBSDMEM(作为实验组)，一组给予等体积2％FBS DMEM(作为对照组)，直接注射于瘤体上进行治疗，每3天给毒一次，并测量肿瘤体积及小鼠体重，连续给毒四次后处死小鼠，收集肿瘤组织，并对其称重。肿瘤体积计算公式为(长×宽2)/2。对B16F1小鼠黑色素瘤的治疗结果如图6所示，肿瘤形态结果直观显示WNV-poly(A)对B16F1肿瘤有显著治疗作用(图6A)，同样，肿瘤体积减小(图6B)和肿瘤重量减轻(图6C)也说明WNV-poly(A)显著抑制了肿瘤的生长。且如图6D所示，在WNV-poly(A)治疗后并不影响小鼠体重变化。进一步通过噬斑检测组织病毒滴度，结果显示在检测的肿瘤组织、脑组织及脾组织和血清中均未检测到病毒(图6E)。

类似于小鼠黑色素瘤细胞B16F1的体内移植瘤模型建立，还构建了人黑色素瘤细胞A375体内移植瘤模型。选择4-5周龄Nude Bab/c小鼠，皮下接种1×10⁷个人黑色素瘤细胞A375，至能触摸到移植瘤时，将小鼠分成两组，一组给予每只1×10⁷PFU WNV-poly(A)，一组给予等体积2％FBS DMEM，直接注射于瘤体上进行治疗，每3天给毒一次，并测量肿瘤体积及小鼠体重，连续给毒四次后处死小鼠，收集肿瘤组织，并对其称重。结果发现WNV-poly(A)对人黑色素瘤肿瘤A375都有显著抑制作用，且并不影响小鼠的体重变化，但能在肿瘤组织中检测到病毒(图6F-J)。

体内荷瘤模型结果表明，WNV-poly(A)对人黑色素瘤细胞及小鼠黑色素瘤有显著的抑制作用。

2.WNV-poly(A)对肿瘤免疫微环境的作用

本实验通过流式检测了WNV-poly(A)对肿瘤免疫微环境的作用。

其中，图7A-7E的实验分为以下两组：

对照组(MOCK)：瘤内给不加病毒的2％FBS DMEM培养基；

实验组：瘤内给加WNV-poly(A)的2％FBS DMEM培养基。

图7F的实验分为以下五组：

对照组(MOCK)：瘤内给不加病毒的PBS组；

WNV-poly(A)+PBS组：瘤内给WNV-poly(A)病毒组，病毒用PBS稀释；

WNV-poly(A)+Anti-NK组：瘤内给WNV-poly(A)病毒加清除NK细胞的抗体；

WNV-poly(A)+Anti-CD4组：瘤内给WNV-poly(A)病毒加清除CD4+ T细胞的抗体；

WNV-poly(A)+Anti-CD8组：瘤内给WNV-poly(A)病毒加清除CD8+ T细胞的抗体。

在治疗终点处死小鼠后摘取肿瘤组织及脾组织。对于小鼠脾组织的处理，摘取脾脏后加PBS用200目的筛网磨碎，1200rpm，离心5分钟，离心毕，弃去上清，向得到的细胞沉淀中加入3ml的红细胞裂解液，4℃静置10min后加20ml PBS洗一遍，离心毕，弃去上清，用枪尖挑出裂解后的组织蛋白。加入1ml PBS悬起细胞，将细胞按100μl/管分管，并加入同型对照抗体封闭30min，封闭后，加入各种荧光标记的抗体，4℃孵育1h，PBS洗后，上机进行检测。对于小鼠肿瘤组织的处理，将肿瘤组织剪切成小块后加PBS于200目的筛网研磨，将所得研磨液离心，700rpm，1min，收集上清离心1200rpm，10min，得到的细胞沉淀加入红细胞裂解液，4℃静置10min后加20ml PBS洗一遍，离心毕，弃去上清，用枪尖挑出裂解后的组织蛋白。加入1ml PBS悬起细胞，将细胞按100μl/管分管，并加入同型对照抗体封闭30min，封闭后，加入各种荧光标记的抗体，4℃孵育1h，PBS洗后，上机进行检测。

流式结果显示，相比于对照组(MOCK)，WNV-poly(A)处理组的肿瘤微环境中CD45+的免疫细胞的比例明显增加(图7A)，且进一步分析各免疫细胞的比例时发现CD8+ T细胞的比例显著增加，调节性T细胞(Treg细胞)的比例显著降低(图7B)。脾中也观察到Treg细胞的比例显著降低(图7C)。且进一步分析CD8+ T的表型发现肿瘤中效应CD8和记忆CD8都显著增加，而脾中的无变化(图7D，E)。

为了进一步确定CD8在WNV-poly(A)溶瘤治疗中的作用，用抗CD8抗体(Anti-CD8)进行了CD8+ T细胞的清除实验。同时，分别用抗CD4抗体(Anti-CD4)和抗NK抗体(Anti-NK)分别清除CD4+ T细胞及NK细胞，并以其作为CD8+ T细胞清除的对照实验组。且同时比较只打PBS不打毒的对照组(MOCK)(作为阴性对照组)及用PBS稀释的打毒组(作为阳性对照组)。实验结果表明，CD8+ T细胞清除后WNV-poly(A)的溶瘤效果显著降低，但CD8+ T细胞的清除并没有完全抵消WNV-poly(A)的溶瘤作用，对照组清除CD4+ T细胞及NK细胞对WNV-poly(A)的治疗并无影响(图7F-H)。结果表明WNV-poly(A)能明显诱导肿瘤内及机体中的CD8+ T细胞的活化，且进一步的清除实验结果表明WNV-poly(A)的治疗作用部分依赖于CD8+ T细胞。

实施例7：双侧荷瘤单侧给WNV-poly(A)后对溶瘤作用的影响

本实施例通过小鼠黑色素瘤细胞B16F1体内双侧荷瘤单侧给毒的模型确定WNV-poly(A)是否对远端肿瘤有效，以进一步明确免疫应答在WNV-poly(A)治疗中的作用。其中：

对照组(MOCK)：瘤内给不加病毒的培养基；

实验组：瘤内给加WNV-poly(A)的培养基。

实施方法如下：选择6-8周龄C57小鼠，左侧腋下接种2×10⁵个鼠黑色素瘤细胞B16F1，右侧腋下接种5×10⁴细胞，至左侧能触摸到移植瘤时，将小鼠分成两组，左侧给予治疗，一组给予每只含1×10⁷PFU WNV-poly(A)的2％FBS DMEM培养基，一组给予等体积2％FBS DMEM培养基，直接注射于瘤体上，每3天给毒一次，并测量肿瘤体积及小鼠体重，连续给毒四次后处死小鼠，收集肿瘤组织，并对其称重(图8A)。肿瘤体积计算公式为(长×宽2)/2。

治疗结果如图8所示，肿瘤形态结果直观显示WNV-poly(A)对B16F1给毒侧及远端侧肿瘤都有显著治疗作用(图8B)。同样，肿瘤体积减小(图8C)和肿瘤重量减轻(图8D)也说明WNV-poly(A)显著抑制了远端肿瘤的生长。且进一步噬斑检测。此结果表明WNV-poly(A)对远端肿瘤有明显的治疗效果，且在肿瘤组织中未检测到病毒，说明WNV-poly(A)对远端组织的治疗作用主要取决于其激活的免疫应答。

实施例8：病毒自身对肿瘤细胞的溶瘤作用

之前的实验结果观察到WNV-poly(A)治疗后有效的逆转了肿瘤免疫抑制微环境，且显著刺激CD8+ T细胞的活化，进一步清除CD8+ T细胞发现其溶瘤作用确实减弱了，但却没有完全的抵消WNV-poly(A)的溶瘤效果。这提示WNV-poly(A)治疗中还存在除免疫应答外的其他溶瘤机制。调研文献发现在病毒的溶瘤治疗中，除病毒激活的免疫应答有效的抑制肿瘤外，病毒自身对肿瘤细胞的杀伤也发挥关键的溶瘤效果。

为了确定WNV-poly(A)自身的溶瘤效果，本实施例通过比较仅给毒一次的给毒方式来探究在WNV-poly(A)治疗过程中除免疫应答外病毒自身对肿瘤细胞的杀伤是否对溶瘤发挥作用。其中：

图9A-C的实验分为以下五组：

对照组(MOCK)：瘤内给2％FBS DMEM培养基；

灭活病毒组：瘤内给加紫外灭活WNV-poly(A)病毒1×10⁷PFU的2％FBS DMEM培养基；

WNV-poly(A)-1×10⁷组：瘤内给加WNV-poly(A)病毒1×10⁷PFU的2％FBS DMEM培养基；

WNV-poly(A)-1×10⁵组：瘤内给加WNV-poly(A)病毒1×10⁵PFU的2％FBS DMEM培养基；

WNV-poly(A)-1×10³组：瘤内给加WNV-poly(A)病毒1×10³PFU的2％FBS DMEM培养基；

本实施例检测了一次给不同剂量WNV-poly(A)治疗后的溶瘤作用，结果发现WNV-poly(A)一次给毒治疗呈剂量依赖性，1×10⁷PFU有效抑制肿瘤生长，1×10⁵PFU部分肿瘤有效部分肿瘤无效，1×10³PFU病毒无治疗效果(图9A-C)。

接下来本实施例检测了一次给毒1×10⁷PFU WNV-poly(A)后不同天数肿瘤内病毒载量，结果发现和给毒后一天相比，三天后肿瘤组织检测发现瘤内病毒滴度增加了10倍，接下来在给毒后5天、7天及9天、11天、14天分别检测了肿瘤病毒滴度，发现病毒载量逐渐降低，至11天未检测到病毒(图9D)。

图9E-9H的实验分为以下两组：

对照组(MOCK)：瘤内给不加病毒的2％FBS DMEM培养基；

实验组：瘤内给加WNV-poly(A)的2％FBS DMEM培养基

为了进一步确定一次给毒中免疫系统是否发挥作用，检测了一次给毒1×10⁷PFUWNV-poly(A)后的肿瘤及脾内的免疫应答情况，结果发现无论是肿瘤内还是脾脏内都未发现免疫细胞的激活，进一步证明在没有激活免疫应答的情况下，WNV-poly(A)也能自身发挥溶瘤作用有效抑制肿瘤生长(图9E-H)。此结果表明WNV-poly(A)给毒一次仍具有明显的对黑色素瘤的抑制作用，且给毒后病毒在肿瘤组织中发生复制。

实施例9：WNV-poly(A)的广谱溶瘤作用

本实施例通过检测WNV-poly(A)对人肝癌细胞Huh7及人卵巢癌细胞SKOV3的体内溶瘤作用验证WNV-poly(A)的溶瘤广谱性。

本实验分为以下两组：

对照组(MOCK)：瘤内给不加病毒的2％FBS DMEM培养基；

实验组：瘤内给加WNV-poly(A)的2％FBS DMEM培养基。

实验操作如图10A及图10F所示，选择4-5周龄Nude Bab/c小鼠，皮下接种2×10⁶个人肝癌细胞Huh7或3×10⁶个人卵巢癌细胞SKOV3，至能触摸到移植瘤时，将小鼠分成两组，一组给予每只1×10⁷PFU WNV-poly(A)，一组给予等体积2％FBS DMEM，直接注射于瘤体上进行治疗，每3天给毒一次，并测量肿瘤体积及小鼠体重，连续给毒四次后处死小鼠，收集肿瘤组织，并对其称重。

结果发现，WNV-polv(A)对人肝癌细胞Huh7(图10B-D)及人卵巢癌细胞SKOV3(图10G-I)都有显著抑制作用。且进一步分析病毒的组织嗜性发现在人肝癌细胞Huh7(图10E)及人卵巢癌细胞SKOV3(图10J)模型中，各组织中仅能在肿瘤组织中检测到病毒。此结果表明，WNV-poly(A)除对黑色素瘤有明显的溶瘤作用外，对肝癌及卵巢癌也有明显的溶瘤效果。这也进一步说明了WNV-poly(A)潜在的广谱性肿瘤治疗潜力。

实施例10：WNV-poly(A)不同给毒方式的治疗效果检测

本实施例通过检测WNV-poly(A)不同给毒方式在人肝癌细胞Huh7的体内溶瘤作用以验证WNV-poly(A)的治疗方式有效性。

实验操作如下：选择4-5周龄Nude Bab/c小鼠，皮下接种1×10⁶个人肝癌细胞Huh7至能触摸到移植瘤时，将小鼠分成4组，其中三组按不同给毒方式(肌肉注射(i.m.)、静脉注射(i.v)、瘤内注射(i.t.))给予每只1×10⁷PFU WNV-poly(A)，一组给予等体积2％FBSDMEM，每3天给毒一次，并测量肿瘤体积，及观察小鼠的生存情况至治疗20天。结果发现，以静脉和瘤内给毒后能明显抑制肿瘤的生长，而肌肉注射对肿瘤基本无治疗作用(图11A)。且通过监测肿瘤的体积变化也可以显著看出静脉和瘤内给毒的治疗效果(图11B)。进一步观察小鼠的生存率发现，瘤内及肌肉给毒不影响小鼠的生存，但静脉给毒有40％的小鼠出现死亡(图11C)。

综上所述，静脉给毒及瘤内给毒对肿瘤治疗都有效，但相对于静脉给毒瘤内给毒更为安全。

序列表

<110> 北京舜雷科技有限公司

中国科学院武汉病毒研究所

<120> 一种减毒黄病属病毒在溶瘤中的应用

<130> MTI21152

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10642

<212> DNA

<213> West Nile virus

<400> 1

agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaactt agtagtgttt gtgaggatta acaacaatta 60

acacagtgcg agctgtttct tagcacgaag atctcgatgt ctaagaaacc aggagggccc 120

ggcaagagcc gggctgtcaa tatgctaaaa cgcggaatgc cccgcgtgtt gtccttgatt 180

ggactgaaga gggctatgtt gagcctgatc gacggcaagg ggccaatacg atttgtgttg 240

gctctcttgg cgttcttcag gttcacagca attgctccga cccgagcagt gctggatcga 300

tggagaggtg tgaacaaaca aacagcgatg aaacaccttc tgagttttaa gaaggaacta 360

gggaccttga ccagtgctat caatcggcgg agctcaaaac aaaagaaaag aggaggaaag 420

accggaattg cagtcatgat tggcctgatc gccagcgtag gagcagttac cctctctaac 480

ttccaaggga aggtgatgat gacggtaaat gctactgacg tcacagatgt catcacgatt 540

ccaacagctg ctggaaagaa cctatgcatt gtcagagcaa tggatgtggg atacatgtgc 600

gatgatacta tcacttatga atgcccagtg ctgtcggctg gtaatgatcc agaagacatc 660

gactgttggt gcacaaagtc agcagtctac gtcaggtatg gaagatgcac caagacacgc 720

cactcaagac gcagtcggag gtcactgaca gtgcagacac acggagaaag cactctagcg 780

aacaagaagg gggcttggat ggacagcacc aaggccacaa ggtatttggt aaaaacagaa 840

tcatggatct tgaggaaccc tggatatgcc ctggtggcag ccgtcattgg ttggatgctt 900

gggagcaaca ccatgcagag agttgtgttt gtcgtgctat tgcttttggt ggccccagct 960

tacagcttca actgccttgg aatgagcaac agagacttct tggaaggagt gtctggagca 1020

acatgggtgg atttggttct cgaaggcgac agctgcgtga ctatcatgtc taaggacaag 1080

cctaccatcg atgtgaagat gatgaatatg gaggcggcca acctggcaga ggtccgcagt 1140

tattgctatt tggctaccgt cagcgatctc tccaccaaag ctgcgtgccc gaccatggga 1200

gaagctcaca atgacaaacg tgctgaccca gcttttgtgt gcagacaagg agtggtggac 1260

aggggctggg gcaacggctg cggactattt ggcaaaggaa gcattgacac atgcgccaaa 1320

tttgcctgct ctaccaaggc aataggaaga accatcttga aagagaatat caagtacgaa 1380

gtggccattt ttgtccatgg accaactact gtggagtcgc acggaaacta ctccacacag 1440

gttggagcca ctcaggcagg gagattcagc atcactcctg cggcgccttc atacacacta 1500

aagcttggag aatatggaga ggtgacagtg gactgtgaac cacggtcagg gattgacacc 1560

aatgcatact acgtgatgac tgttggaaca aagacgttct tggtccatcg tgagtggttc 1620

atggacctca acctcccttg gagcagtgct ggaagtactg tgtggaggaa cagagagacg 1680

ttaatggagt ttgaggaacc acacgccacg aagcagtctg tgatagcatt gggctcacaa 1740

gagggagctc tgcatcaagc tttggctgga gccattcctg tggaattttc aagcaacact 1800

gtcaagttga cgtcgggtca tttgaagtgt agagtgaaga tggaaaaatt gcagttgaag 1860

ggaacaacct atggcgtctg ttcaaaggct ttcaagtttc ttgggactcc cgcagacaca 1920

ggtcacggca ctgtggtgtt ggaattgcag tacactggca cggatggacc ttgtaaagtt 1980

cctatctcgt cagtggcttc attgaacgac ctaacgccag tgggcagatt ggtcactgtc 2040

aacccttttg tttcagtggc cacggccaac gctaaggtcc tgattgaatt ggaaccaccc 2100

tttggagact catacatagt ggtgggcaga ggagaacaac agatcaatca ccattggcac 2160

aagtctggaa gcagcattgg caaagccttt acaaccaccc tcaaaggagc gcagagacta 2220

gccgctctag gagacacagc ttgggacttt ggatcagttg gaggggtgtt cacctcagtt 2280

gggaaggctg tccatcaagt gttcggagga gcattccgct tactgttcgg aggcatgtcc 2340

tggataacgc aaggattgct gggggctctc ctgttgtgga tgggcatcaa tgctcgtgat 2400

aggtccatag ctctcacgtt tctcgcagtt ggaggagttc tgctcttcct ctccgtgaac 2460

gtgcacgctg acactgggtg tgccatagac atcagccggc aagagctgag atgtggaagt 2520

ggagtgttca tacacaatga tgtggaggct tggatggacc gatacaagta ttaccctgaa 2580

acgccacaag gcctagccaa gatcattcag aaagctcata aggaaggagt gtgcggtcta 2640

cgatcagttt ccagactgga gcatcaaatg tgggaagcag tgaaggacga gctgaacact 2700

cttttgaagg agaatggtgt ggaccttagt gtcgtggttg agaaacagga gggaatgtac 2760

aagtcagcac ctaaacgcct caccgccacc acggaaaaat tggaaattgg ctggaaggcc 2820

tggggaaaga gtattttatt tgcaccagaa ctcgccaaca acacctttgt ggttgatggt 2880

ccggagacca aggaatgtcc gactcagaat cgcgcttgga atagcttaga agtggaggat 2940

tttggatttg gtctcaccag cactcggatg ttcctgaagg tcagagagag caacacaact 3000

gaatgtgact cgaagatcat tggaacggct gtcaagaaca acttggcgat ccacagtgac 3060

ctgtcctatt ggattgaaag caggctcaat gatacgtgga agcttgaaag ggcagttctg 3120

ggtgaagtca aatcatgtac gtggcctgag acgcatacct tgtggggcga tggaatcctt 3180

gagagtgact tgataatacc agtcacactg gcgggaccac gaagcaatca caatcggaga 3240

cctgggtaca agacacaaaa ccagggccca tgggacgaag gccgggtaga gattgacttc 3300

gattactgcc caggaactac ggtcaccctg agtgagagct gcggacaccg tggacctgcc 3360

actcgcacca ccacagagag cggaaagttg ataacagatt ggtgctgcag gagctgcacc 3420

ttaccaccac tgcgctacca aactgacagc ggctgttggt atggtatgga gatcagacca 3480

cagagacatg atgaaaagac cctcgtgcag tcacaagtga atgcttataa tgctgatatg 3540

attgaccctt ttcagttggg ccttctggtc gtgttcttgg ccacccagga ggtccttcgc 3600

aagaggtgga cagccaagat cagcatgcca gctatactga ttgctctgct agtcctggtg 3660

tttgggggca ttacttacac tgatgtgtta cgctatgtca tcttggtggg ggcagctttc 3720

gcagaatcta attcgggagg agacgtggta cacttggcgc tcatggcgac cttcaagata 3780

caaccagtgt ttatggtggc atcgtttctc aaagcgagat ggaccaacca ggagaacatc 3840

ttgttgatgt tggcggctgt tttctttcaa atggcttatc acgatgcccg ccaaattctg 3900

ctctgggaga tccctgatgt gttgaattca ctggcggtag cttggatgat actgagagcc 3960

ataacattca caacgacatc aaacgtggtt gttccgctgc tagccctgct aacacccggg 4020

ctgagatgct tgaatctgga tgtgtacagg atactgctgt tgatggtcgg aataggcagc 4080

ttgatcaggg agaagaggag tgcagctgca aaaaagaaag gagcaagtct gctatgcttg 4140

gctctagcct caacaggact tttcaacccc atgatccttg ctgctggact gattacatgt 4200

gatcccaacc gtaaacgcgg atggcccgca actgaagtga tgacagctgt cggcctgatg 4260

tttgccatcg tcggagggct ggcagagctt gacattgact ccatggccat tccaatgact 4320

atcgcggggc tcatgtttgc tgctttcgtg atttctggga aatcaacaga tatgtggatt 4380

gagagaacgg cggacatttc ctgggaaagt gatgcagaaa ttacaggctc gagcgaaaga 4440

gttgatgtgc ggcttgatga tgatggaaac ttccagctca tgaatgatcc aggagcacct 4500

tggaagatat ggatgctcag aatggtctgt ctcgcgatta gtgcgtacac cccctgggca 4560

atcttgccct cagtagttgg attttggata actctccaat acacaaagag aggaggcgtg 4620

ttgtgggaca ctccctcacc aaaggagtac aaaaaggggg acacgaccac cggcgtctac 4680

aggatcatga ctcgtgggct gctcggcagt tatcaagcag gagcgggcgt gatggttgaa 4740

ggtgttttcc acaccctttg gcatacaaca aaaggagccg ctttgatgag cggagagggc 4800

cgcctggacc catactgggg cagtgtcaag gaggatcgac tttgttacgg aggaccctgg 4860

aaattgcagc acaagtggaa cgggcaggat gaggtgcaga tgattgtggt ggaacctggc 4920

aagaacgtta agaacgtcca gacgaaacca ggggtgttca aaacacctga aggagaaatc 4980

ggggccgtga ctttggactt ccccactgga acatcaggct caccaatagt ggacaaaaac 5040

ggtgatgtga ttgggcttta tggcaatgga gtcataatgc ccaacggctc atacataagc 5100

gcgatagtgc agggtgaaag gatggatgag ccaatcccag ccggattcga acctgagatg 5160

ctgaggaaaa aacagatcac tgtactggat ctccatcccg gcgccggtaa aacaaggagg 5220

attctgccac agatcatcaa agaggccata aacagaagac tgagaacagc cgtgctagca 5280

ccaaccaggg ttgtggctgc tgagatggct gaagcactga gaggactgcc catccggtac 5340

cagacatccg cagtgcccag agaacataat ggaaatgaga ttgttgatgt catgtgtcat 5400

gctaccctca cccacaggct gatgtctcct cacagggtgc cgaactacaa cctgttcgtg 5460

atggatgagg ctcatttcac cgacccagct agcattgcag caagaggtta catttccaca 5520

aaggtcgagc taggggaggc ggcggcaata ttcatgacag ccaccccacc aggcacttca 5580

gatccattcc cagagtccaa ttcaccaatt tccgacttac agactgagat cccggatcga 5640

gcttggaact ctggatacga atggatcaca gaatacaccg ggaagacggt ttggtttgtg 5700

cctagtgtca agatggggaa tgagattgcc ctttgcctac aacgtgctgg aaagaaagta 5760

gtccaattga acagaaagtc gtacgagacg gagtacccaa aatgtaagaa cgatgattgg 5820

gactttgtta tcacaacaga catatctgaa atgggggcta actttaaggc gagcagggtg 5880

attgacagcc ggaagagtgt gaaaccaacc atcataacag aaggagaagg gagagtgatc 5940

ctgggagaac catctgcagt gacagcagct agtgccgccc agagacgtgg acgtatcggt 6000

agaaatccgt cgcaagttgg tgatgagtac tgttatgggg ggcacacgaa tgaagacgac 6060

tcgaacttcg cccattggac tgaggcacga atcatgctgg acaacatcaa catgccaaac 6120

ggactgatcg ctcaattcta ccaaccagag cgtgagaagg tatataccat ggatggggaa 6180

taccggctca gaggagaaga gagaaaaaac tttctggaac tgttgaggac tgcagatctg 6240

ccagtttggc tggcttacaa ggttgcagcg gctggagtgt cataccacga ccggaggtgg 6300

tgctttgatg gtcctaggac aaacacaatt ttagaagaca acaacgaagt ggaagtcatc 6360

acgaagcttg gtgaaaggaa gattctgagg ccgcgctgga ttgacgccag ggtgtactcg 6420

gatcaccagg cactaaaggc gttcaaggac ttcgcctcgg gaaaacgttc tcagataggg 6480

ctcattgagg ttctgggaaa gatgcctgag cacttcatgg ggaagacatg ggaagcactt 6540

gacaccatgt acgttgtggc cactgcagag aaaggaggaa gagctcacag aatggccctg 6600

gaggaactgc cagatgctct tcagacaatt gccttgattg ccttattgag tgtgatgacc 6660

atgggagtat tcttcctcct catgcagcgg aagggcattg gaaagatagg tttgggaggc 6720

gctgtcttgg gagtcgcgac ctttttctgt tggatggctg aagttccagg aacgaagatc 6780

gccggaatgt tgctgctctc ccttctcttg atgattgtgc taattcctga gccagagaag 6840

caacgttcgc agacagacaa ccagctagcc gtgttcctga tttgtgtcat gacccttgtg 6900

agcgcagtgg cagccaacga gatgggttgg ctagataaga ccaagagtga cataagcagt 6960

ttgtttgggc aaagaattga ggtcaaggag aatttcagca tgggagagtt tcttttggac 7020

ttgaggccgg caacagcctg gtcactgtac gctgtgacaa cagcggtcct cactccactg 7080

ctaaagcatt tgatcacgtc agattacatc aacacctcat tgacctcaat aaacgttcag 7140

gcaagtgcac tattcacact cgcgcgaggc ttccccttcg tcgatgttgg agtgtcggct 7200

ctcctgctag cagccggatg ctggggacaa gtcaccctca ccgttacggt aacagcggca 7260

acactccttt tttgccacta tgcctacatg gttcccggtt ggcaagctga ggcaatgcgc 7320

tcagcccagc ggcggacagc ggccggaatc atgaagaacg ctgtagtgga tggcatcgtg 7380

gccacggacg tcccagaatt agagcgcacc acacccatca tgcagaagaa agttggacag 7440

atcatgctga tcttggtgtc tctagctgca gtagtagtga acccgtctgt gaagacagta 7500

cgagaagccg gaattttgat cacggccgca gcggtgacgc tttgggagaa tggagcaagc 7560

tctgtttgga acgcaacaac tgccatcgga ctctgccaca tcatgcgtgg gggttggttg 7620

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<210> 4

<211> 10775

<212> DNA

<213> Yellow fever virus

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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 10620

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<210> 5

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<213> zika virus

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<210> 6

<211> 10903

<212> DNA

<213> Tick-borne encephalitis virus

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