一种比率荧光法免疫层析检测试条及其检测方法
阅读说明：本技术 一种比率荧光法免疫层析检测试条及其检测方法 (Immunochromatography detection test strip by ratio fluorescence method and detection method thereof ) 是由 段学军 张旭东 樊荣 李玉彬 常天亮 李竹青 陈春晓 何永平 于 2020-11-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种比率荧光法免疫层析检测试纸条,试纸条包括依次相连接的样品垫、标记垫、包被膜和吸水垫；所述包被膜上依次设置校准线C线、测试T1线和测试T2线,所述C线上包被独立质控抗体；所述标记垫上含有荧光标记的重组抗原和荧光标记的独立质控抗原；所述T1线上包被有重组抗原；T2线上包被有重组抗原配体。通过测定T1线和T2线上两者荧光检测信号的比率(T1/T2),该T1/T2比率与样本中的抗体浓度成正相关,建立相关校准曲线方程,从而建立定性或者定量检测的荧光免疫层析检测方法。本发明提供的试纸条及方法克服了荧光检测背景信号的干扰,提高荧光免疫层析的灵敏度、精确度及可信度。(The invention provides a test strip for immunochromatography detection by a ratiometric fluorescence method, which comprises a sample pad, a marking pad, a coating film and a water absorption pad which are sequentially connected; a calibration line C, a test T1 line and a test T2 line are sequentially arranged on the coating film, and the C line is coated with an independent quality control antibody; the marking pad contains a fluorescence-marked recombinant antigen and a fluorescence-marked independent quality control antigen; the T1 line is coated with recombinant antigen; the T2 line is coated with a recombinant antigen ligand. By measuring the ratio of fluorescence detection signals of the T1 line and the T2 line (T1/T2), the T1/T2 ratio is in positive correlation with the antibody concentration in a sample, and a correlation calibration curve equation is established, so that the fluorescence immunochromatography detection method for qualitative or quantitative detection is established. The test strip and the method provided by the invention overcome the interference of fluorescence detection background signals and improve the sensitivity, accuracy and reliability of fluorescence immunochromatography.)
技术领域
本发明涉及医学检验领域，具体地，涉及一种比率荧光法免疫层析检测试条及其检测方法。
背景技术
荧光免疫层析快速检测技术是基于免疫层析原理建立起来的一种适用于现场检测的技术，典型的荧光免疫层析试条包括样品垫、荧光标记垫、包被膜和吸收垫。荧光免疫层析技术以硝酸纤维素膜作为固相载体，经渗透和毛细管虹吸作用使待测样品中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，通过荧光标记垫上标记物来呈现反应结果。该技术具有操作简便、检测快速和便携性强的优点。
对于传染疾病检测，检测的重复性、灵敏度和精确性要求极高。例如，新型冠状病毒S蛋白抗体检测试剂盒(荧光免疫层析法)，要求检测的非特异背景更低以降低假阳性，同时还要求好的灵敏度以提高阳性检出率。
但是，由于试条的层析过程复杂，硝酸纤维素膜疏水吸附作用、包被物质静电吸引等因素，都会造成一定的荧光检测信号的背景。如果荧光检测背景信号过高，会造成较大偏差的检测结果，从而不能准确真实的反应待测物质的含量，同时也会降低检测的灵敏度。因此，如何克服荧光检测背景信号的干扰，提高荧光免疫层析的灵敏度、精确度及可信度是需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是一种比率荧光法免疫层析检测试条及其检测方法，克服荧光检测背景信号的干扰，提高荧光免疫层析的灵敏度、精确度及可信度。
为了克服荧光检测背景信号的干扰，减少因为样本特性等原因造成的假阳性，设置与待测物浓度成正比的T1线，同时引入与待测物浓度成反比的T2线。测定临床样本时，T1线信号强度升高时，T2线信号强度应降低；T1线信号强度降低时，T2线信号强度应升高；在满足上述信号特征要求后，仪器才能给出有效测定结果，从而降低错误的几率。另一方面，通过T1与T2与待测物浓度的信号升降的设置，计算的T1/T2信号值将更灵敏反映待测物浓度的变化，从而提高检测试条的灵敏度。
为达到上述目的，本公开的第一个方面提供了一种免疫层析试条，该免疫层析试条包括依次相连接的样品垫、标记垫、包被膜和吸水垫；其中，所述包被膜上依次设置校准线C线、测试T1线和测试T2线，所述C线上包被独立质控抗体；所述标记垫上含有荧光标记的重组抗原和荧光标记的独立质控抗原；所述T1线上包被有重组抗原；T2线上包被有重组抗原配体。
优选的，所述T1线上包被有重组抗原，以0.2-4μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在T1线上干燥后得到的，与荧光标记的重组抗原均可结合样本中的抗体，形成双抗原夹心荧光免疫复合物，T1线上的荧光检测信号与样本中的抗体浓度成正比。
优选的，所述T2线上包被有重组抗原配体，以0.2-4μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在T1线上干燥后得到，可与荧光标记的重组抗原结合；如果荧光标记的重组抗原被样本中的抗体结合，T2线上重组抗原配体将不能结合这部分荧光标记的重组抗原；因此，T2线上的荧光检测信号与样本中的抗体浓度成反比。
采用本公开所提供的的免疫层析试条，可通过干式荧光免疫层析仪获得T1线和T2线上两者荧光检测信号的比率(T1/T2)，该T1/T2比率与样本中的抗体浓度成正相关，建立相关校准曲线方程，从而建立定性或者定量检测的荧光免疫层析检测方法。通过利用检测线T1线和T2线联动，克服荧光检测背景信号的干扰，提高荧光免疫层析的灵敏度、精确度及可信度。
本发明的第二个方面提供一种免疫层析检测方法，其中，所述方法包括以下步骤：
样品的检测：利用所述免疫层析试条对待测样品进行检测，收集免疫层析试纸上T1线、T2线和C线处的荧光曲线峰积分面积值，将T1线和T2线上两者荧光检测信号的比率(T1/T2)代入所述校准曲线方程获得待测样品中的待测物的检测浓度；
可选的，所述待测物为新冠病毒S蛋白抗体。
以检测新冠病毒S蛋白抗体为例，本公开所提供的试条及检测方法，采用重组新冠病毒S1-RBD抗原包被T1线，血管紧张素转化酶2(ACE2)重组蛋白包被T2线，羊抗鸡IgY抗体包被C线；同时，采用稀土元素铕包埋的荧光微球标记重组新冠病毒S1-RBD抗原([email protected])，干燥制备得到标记垫；组装制备成新冠病毒S蛋白抗体检测试剂盒。
检测过程中，标记垫上的[email protected]标记物结合样本中的S蛋白抗体，层析到T1线处，被包被的重组新冠病毒S1-RBD抗原结合形成双抗原夹心重组新冠病毒S1-RBD抗原-S蛋白抗体[email protected]复合物，T1线上的荧光检测信号与样本中的抗体浓度成正比。
未被T1线捕获的[email protected]标记物，继续层析到T2，没有结合样本中的S蛋白抗体的部分将被T2包被的ACE2捕获；结合S蛋白抗体的[email protected]复合物，由于RBD结合位点被S蛋白抗体结合，从而被阻断了与ACE2之间的结合，因此T2线上的荧光检测信号与样本中的抗体浓度成反比。
本发明在干式荧光免疫层析仪器上设置：在满足上述T1线和T2线相互联动的信号特征要求后，仪器才能给出有效测定结果。另一方面，通过T1与T2与待测物浓度的信号升降的设置，计算的T1/T2信号值将更灵敏反映待测物浓度的变化，从而提高检测试条的灵敏度。
采用本发明所提供的比率荧光法新冠病毒S蛋白抗体检测试条，可通过干式荧光免疫层析仪获得T1线和T2线上两者荧光检测信号的比率(T1/T2)，该T1/T2比率与样本中的抗体浓度成正相关，建立相关校准曲线方程，从而建立定性或者定量检测的新冠病毒S蛋白抗体荧光免疫层析检测方法。通过利用检测线T1线和T2线联动，克服荧光检测背景信号的干扰，提高新冠病毒S蛋白抗体的灵敏度、精确度及可信度。
本发明的第一个方面提供了一种免疫层析试条，该免疫层析试纸条包括依次相连接的样品垫、标记垫、包被膜和吸水垫；其中，所述包被膜上依次设置校准线C线、测试T1线和测试T2线，所述C线上包被独立质控抗体；所述标记垫上含有荧光标记的重组抗原和荧光标记的独立质控抗原；所述T1线上包被有重组抗原；T2线上包被有重组抗原配体。
其中，所述样品垫、标记垫、包被膜和吸水垫的长度比优选为(13-17)∶(10-12)∶(20-24)∶(20-24)。
本发明所提供的试纸条中，C线、T1线、T2线在所述试纸条的长度方向上平行排列且各线的宽度相等。C线和T1线与T2线的距离可以相同也可以不同，优选的情况下，为了获得更加准确的定量检测数据，C线与T1线的距离和T1线与T2线的距离可以为3-4mm。
所述C线上包被的独立质控抗体是由浓度为10-40ng/mL的独立质控抗体溶液以0.2-4μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在C线上干燥后得到的。
所述T1线上包被的重组抗原，是由0.2-2mg/mL的重组抗原溶液以0.2-4μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在T1线上干燥后得到。
所述T2线上包被的重组抗原配体，是由0.2-2mg/mL的重组抗原配体溶液以0.2-4μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在T2线上干燥后得到。
在本发明的一种
具体实施方式
中，所述T1线包被的重组抗原是重组新冠病毒S1-RBD抗原，所述T2线包被的重组抗原配体为ACE2，所述C线包被的独立质控抗体是羊抗鸡IgY抗体，所述的独立质控抗原是鸡IgY。
在本发明所提供的试条的制备过程中，将稀土元素铕包埋的荧光微球标记重组新冠病毒S1-RBD抗原(S1-RBD抗原@EuNP)和稀土元素铕包埋的荧光微球标记鸡IgY([email protected])以2-3mg/mL的浓度溶于喷涂缓冲液中，并使用3-5μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在标记垫上干燥；
其中，所述喷涂缓冲液为含有质量体积比为0.3-0.7％的BSA和质量体积比为0.2-0.3％的Tween-20的浓度为0.01-0.03M的磷酸盐缓冲液，所述喷涂缓冲液的pH值为7.2-7.6。
检测过程中，在本发明所提供的试条中标记垫上的[email protected]标记物结合样本中的S蛋白抗体，层析到T1线处，被包被的重组新冠病毒S1-RBD抗原结合形成双抗原夹心重组新冠病毒S1-RBD抗原-S蛋白抗体[email protected]复合物，T1线上的荧光检测信号与样本中的抗体浓度成正比。
未被T1线捕获的[email protected]标记物，继续层析到T2，没有结合样本中的S蛋白抗体的部分将被T2包被的ACE2捕获；结合S蛋白抗体的[email protected]复合物，由于RBD结合位点被S蛋白抗体结合，从而被阻断了与ACE2之间的结合，因此T2线上的荧光检测信号与样本中的抗体浓度成反比。
其中，所述荧光微球为聚苯乙烯包埋镧系元素微球，优选的是稀土元素铕包埋的荧光微球。
其中，所述荧光微球的尺寸优选为50-300nm，优选的是100nm。
本发明的第二个方面提供一种免疫层析检测方法，所述方法包括以下步骤：
采用本发明所提供的比率荧光法检测试条，可通过干式荧光免疫层析仪获得T1线和T2线上两者荧光检测信号的比率(T1/T2)，该T1/T2比率与样本中的抗体浓度成正相关，建立相关校准曲线方程，从而建立定性或者定量检测的荧光免疫层析检测方法。
样品的检测：利用所述免疫层析试条对待测样品进行检测，收集免疫层析试纸上T1线、T2线和C线处的荧光曲线峰积分面积值，将T1线和T2线上两者荧光检测信号的比率(T1/T2)代入所述校准曲线方程获得待测样品中的待测物的检测浓度；
在本发明所述的方法中，可以利用本领域常规的收集荧光免疫层析试条检测信号的仪器收集C线、T1线和T2线处的荧光曲线峰积分面积值。例如，可以使用干式荧光免疫检测仪。
在本发明中，数据的收集、处理、计算以及储存可以利用按本公开的技术方案所编程的计算机软件完成，从而实现检测结果的自动化输出，节省检测的劳动量。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述待测物为新冠病毒S蛋白抗体。
其中，新冠病毒S蛋白抗体免疫层析试纸条的检测原理可能包括：将待检样品滴入样品垫中，若待测样品中有待测新冠病毒S蛋白抗体，则待检样品中的待测新冠病毒S蛋白抗体先和所述标记的[email protected]结合形成复合体，由于毛细管作用，待测抗体和标记的[email protected]形成的复合体沿包被膜向前泳动，到达检测线(T1线)时遇到包被在硝酸纤维素基膜上的重组新冠病毒S1-RBD抗原，由于重组新冠病毒S1-RBD抗原和[email protected]分别能与待测抗体的不同抗体表位结合，从而形成“重组新冠病毒S1-RBD抗原-待测抗体[email protected]”复合体，在T1线处形成特异性的层析线；没有和待测抗体结合的所述标记的[email protected]则会直接通过T1线，达到T2线后被上面的ACE2捕获，从而在T2线上形成层析线，即判为阳性结果；若样品中无待测抗体，由于无法在T1线上形成“重组新冠病毒S1-RBD抗原-待测抗体[email protected]”复合体，从而使得T1线上不会产生层析线，没有和待测抗体结合的标记的[email protected]则会直接通过T1线，达到T2线后被ACE2捕获，从而富集在T2线上，即判为阴性结果。
附图说明
图1.比率荧光法新冠病毒S蛋白抗体检测试纸条的检测原理示意图。
图2.比率荧光法新冠病毒S蛋白抗体检测的校准曲线。
具体实施方式
以下通过实施例进一步详细说明本公开：
以下实施例中，除特别说明外硼酸盐缓冲液的浓度为0.03-0.07M，pH为8.0-8.5，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.03M，pH为7.2-7.6。
重组新冠病毒S1-RBD抗原、血管紧张素转化酶2(ACE2)重组蛋白、抗新冠病毒RBD单域抗体均市售；FIC-H型干式荧光免疫检测仪为国产厂家生产。
实施例1免疫层析试条的制备
制备重组新冠病毒S1-RBD抗原溶液：用硼酸盐缓冲液将重组新冠病毒S1-RBD抗原超滤得到重组新冠病毒S1-RBD抗原溶液；将重组新冠病毒S1-RBD抗原溶液浓度调整为1.0mg/mL。
制备血管紧张素转化酶2(ACE2)重组蛋白溶液：用硼酸盐缓冲液将重组血管紧张素转化酶2(ACE2)重组蛋白超滤得到血管紧张素转化酶2(ACE2)重组蛋白溶液；将血管紧张素转化酶2(ACE2)重组蛋白溶液浓度调整为2.0mg/mL。
用喷金点膜机分别将重组新冠病毒S1-RBD抗原溶液和血管紧张素转化酶2(ACE2)重组蛋白溶液喷于硝酸纤维素膜上，形成相互平行的检测T1线和T2线；烘干；将稀土元素铕包埋的荧光微球标记重组新冠病毒S1-RBD抗原(S1-RBD抗原@EuNP)以2-3mg/mL的浓度溶于喷涂缓冲液中，并使用3-5μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在标记垫上干燥；所述喷涂缓冲液为含有质量体积比为0.3-0.7％的BSA和质量体积比为0.2-0.3％的Tween-20的浓度为0.01-0.03M的磷酸盐缓冲液，所述喷涂缓冲液的pH值为7.2-7.6。
然后将样品垫、标记垫、喷有T1线、T2线的包被膜(硝酸纤维素膜)和吸水纸依次连接组装，样品垫、标记垫、包被膜和吸水垫的长度比为15∶10∶20∶24。而后裁切包装备用，获得免疫层析试条。
实施例2检测待测样本
(1)样本稀释液的制备
在pH为8.0-8.5的硼酸缓冲液中，加入终浓度为1％(v/v)的吐温20、终浓度为0.9％％氯化钠和终浓度为0.03％的proclin300，终浓度为0.2％(v/v)的BiosaccharideGum-1。
(2)样品制备
将抗新冠病毒RBD单域抗体用2018年体检正常人血清进行梯度稀释，分别获得浓度为0mg/mL、0.039mg/mL、0.078mg/mL、0.156mg/mL、0.313mg/mL、0.625mg/mL、1.25mg/mL的一系列抗新冠病毒RBD单域抗体校准溶液。
(3)校准曲线的绘制
取试纸条，室温平衡10分钟，打开包装取出试纸条；取50μL抗新冠病毒RBD单域抗体溶液校准溶液和50μL的样本稀释液混合均匀后，取90μL混合液加入到试纸条样品垫上，静置15分钟后，将试纸条按照箭头方向插入干式荧光免疫检测仪中，每个浓度的校准溶液均进行检测。收集免疫层析试纸上T1线、T2线和C线处的荧光曲线峰积分面积值，将T1线和T2线上两者荧光检测信号的比率(T1/T2)与各校准溶液的抗新冠病毒RBD单域抗体浓度值作校准曲线，并获得校准曲线方程，曲线方程为：y＝3.190x+0.040，如图2。
(4)对比例检测
利用实施例1的方法制备免疫层析试条，区别仅在于，试条仅具有一条T线和一条C线，喷金点膜机的喷涂速度为1μL/cm，T线为浓度1mg/mL的重组新冠病毒S1-RBD抗原溶液包被干燥而得，C线为浓度1mg/mL的羊抗鸡IgY抗体溶液包被干燥而得，获得常规的对比荧光免疫层析试条。
利用对比例1所述对比试条对抗新冠病毒RBD单域抗体校准溶液和配制的样本进行检测，使用干式荧光免疫检测仪收集T线和C线的荧光曲线峰积分面积值检测结果，并将T线检测信号对C线检测信号的比率(T/C)作为纵坐标y，以校准品溶液的浓度值做为横坐标x，得到校准曲线，曲线方程为：y＝1.309x+0.030。
(5)测试例检测
分别用所述实施例1的免疫层析试条检测待测样品(配制浓度为0.020mg/mL、0.04mg/mL的抗新冠病毒RBD单域抗体溶液)，使用FIC-H型干式荧光免疫检测仪获得T1线和T2线上两者荧光检测信号的比率(T1/T2)，通过上述校准曲线方程计算得出待测样品中的待测物检测浓度；检测结果如表1所示。
分别用所述对比例1的免疫层析试条检测待测样品(配制浓度为0.020mg/mL、0.04mg/mL的抗新冠病毒RBD单域抗体溶液)，按照常规方法，使用干式荧光免疫检测仪收集T线和C线的荧光曲线峰积分面积值检测结果，并将T线检测信号对C线检测信号的比率(T/C)代入校准曲线计算样本的抗新冠病毒RBD单域抗体浓度，检测结果如表1所示。
表1测试例和对比例的检测结果
从表1的结果可以看出，实施例1利用本公开所提供的比率荧光法免疫层析检测试条及其检测方法对待测样品进行检测，0.020mg/mL的抗新冠病毒RBD单域抗体溶液与0mg/mL的抗新冠病毒RBD单域抗体溶液的检测信号T1/T2区分明显；对比例普通荧光免疫层析试条的情况则是：0.04mg/mL的抗新冠病毒RBD单域抗体溶液与0mg/mL的抗新冠病毒RBD单域抗体溶液的检测信号T1/T2区分明显。结果说明相比于传统的普通荧光免疫层析试条及检测方法，利用比率荧光法免疫层析检测试条及其检测方法能够获得更加灵敏的检测数据。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，并以比率荧光法新冠病毒S蛋白抗体检测试条举例说明本公开的技术构思及方案。但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：荧光偏振免疫分析和荧光标记物质