一种检测葡萄糖氧化酶活性的方法
阅读说明：本技术 一种检测葡萄糖氧化酶活性的方法 (Method for detecting activity of glucose oxidase ) 是由 程瑛 张成杰 徐丽 周樱 詹志春 于 2021-08-17 设计创作，主要内容包括：本发明属于酶制剂检测技术领域,具体提供了一种检测葡萄糖氧化酶活性的方法。本发明在待测葡萄糖氧化酶液和葡萄糖及碘化钾充分反应后加入硫酸终止反应,然后使用硫代硫酸钠滴定生成的碘,从而定量的计算出葡萄糖氧化酶的酶活性。该检测方法操作简单,反应时间短,检测灵敏准确,反应过程中使用的均为常规化学试剂,检测过程安全,反应条件温和,适用于食品酿造、饲料添加、面粉改良、医药领域等,而且不需要制作过氧化氢标准曲线,避免操作误差导致结果不准确。(The invention belongs to the technical field of enzyme preparation detection, and particularly provides a method for detecting the activity of glucose oxidase. The method comprises the steps of adding sulfuric acid to stop reaction after glucose oxidase liquid to be detected fully reacts with glucose and potassium iodide, and then titrating the generated iodine by using sodium thiosulfate, so that the enzyme activity of the glucose oxidase is quantitatively calculated. The detection method is simple to operate, short in reaction time, sensitive and accurate in detection, uses conventional chemical reagents in the reaction process, is safe in detection process, mild in reaction condition, suitable for the fields of food brewing, feed addition, flour improvement, medicines and the like, does not need to make a hydrogen peroxide standard curve, and avoids inaccurate results caused by operation errors.)
技术领域
本发明属于酶制剂检测技术领域，具体涉及一种检测葡萄糖氧化酶活性的方法。
背景技术
葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能够以分子氧为受体，将β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢。由于葡萄糖氧化酶具有催化效率高、无毒副作用、高度专一性等特点，并能将葡萄糖氧化成葡萄糖酸而起到去除葡萄糖、脱氧、杀菌效果，因而被广泛应用于医药生产、食品加工、饲料添加等方面，全球GOD年总产值超过150亿元，且需求量逐年以10％-30％速度递增。但是葡萄糖氧化酶的活力定义和检测方法没有国家标准，仅个别省份有地方标准，大多生产企业采用自己的企业标准测定。
目前，主要的葡萄糖氧化酶活力检测方法有滴定法、电化学法、分光光度计法、测压法、凝胶电泳法和傅里叶变换红外光谱法，其中电化学法、测压法、凝胶电泳法和傅里叶变换红外光谱法及连续分光光度法由于操作繁杂、仪器依赖和试剂缺乏等方面存在的问题，并未被大量推广使用。滴定法和普通分光光度计的原理均是葡萄糖氧化酶同葡萄糖反应，根据反应产物进行后续检测。分光光度计法通过使用靛红褪色法、醌亚胺法、邻苯二胺法和邻联茴香胺法等检测生成的有色物质，但是这些试剂中有很多试剂属于可致癌的剧毒化合物，并且存在显色物质不稳定的情况，而且其使用过氧化氢作为标曲来计算，存在标曲稳定性和可重复性比较差的问题，导致酶活力检测结果不稳定，不适合进行推广和制定标准。因此，需要寻找一种更准确，稳定性和可重复性更高的方法。滴定法在很多检测方法中是属于仲裁法，而目前使用的滴定法灵敏度较低且误差相对较大，因此，本发明在原有的滴定法基础上进行改善，设计出快速可靠、操作简单、灵敏准确、更稳定、重复性更高的、无毒副作用的葡萄糖氧化酶活力的方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中葡萄糖氧化酶活性检测可靠性和安全性低的问题。
为此，本发明提供了一种检测葡萄糖氧化酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用磷酸盐缓冲液稀释葡萄糖氧化酶作为待测酶液，记录稀释倍数为N，并将待测酶液预热；
(2)配制葡萄糖溶液、碘化钾溶液和钼酸铵溶液，将三者混匀后预热，分为多份反应底物备用；
(3)取V1ml水浴预热后的待测酶液，加入到一份步骤(2)的反应底物中，酶解反应T分钟后立即加入硫酸溶液终止反应；
(4)取V1ml磷酸盐缓冲液加入到另一份步骤(2)的反应底物中，T分钟后立即加入与步骤(3)中等量的硫酸溶液，作为空白对照组；
(5)向步骤(3)得到的产物中滴加指示剂，混匀后，使用浓度为f mol/l的碘单质还原剂滴定至无色，记录碘单质还原剂消耗的体积为V2ml；同时对步骤(4)的空白对照组进行相同的滴定反应，记录碘单质还原剂消耗的体积为V3 ml；
(6)根据公式计算葡萄糖氧化酶活性X
其中，a为碘单质还原剂与双氧水的换算系数；1000为转化因子。
具体的，上述步骤(1)中的磷酸盐缓冲液是由NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O混合制备的浓度为0.05-0.25mol/l，pH为3.0-7.0的磷酸盐缓冲液。
具体的，上述磷酸盐缓冲液浓度为0.1mol/l，pH为6.0。
具体的，上述步骤(2)中葡萄糖溶液的浓度为180g/l，碘化钾溶液的浓度为100g/l，钼酸铵溶液的浓度为10g/l。
具体的，上述步骤(2)制备的反应底物中，碘化钾溶液：葡萄糖溶液：钼酸铵溶液的体积比为25:3:1。
具体的，上述步骤(3)中酶解反应的温度为20-45℃。
具体的，上述酶解反应的温度为37℃。
具体的，上述步骤(3)和步骤(4)中使用的硫酸溶液浓度为1mol/l。
具体的，上述步骤(5)中使用的指示剂为淀粉指示剂。
具体的，上述步骤(5)中使用的碘单质还原剂包括硫化氢、二氧化硫、硫代硫酸钠溶液中的一种。
本发明的原理为：在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖和氧反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在酸性条件下氧化碘化钾，产生定量的碘，后用碘单质还原剂滴定，可测出过氧化氢的含量，进而计算出葡萄糖氧化酶的活力。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明提供的这种葡萄糖氧化酶活性检测方法操作简单，反应时间短，检测灵敏准确；不需要制作过氧化氢标准曲线，避免操作误差导致结果不准确；使用的均为常规化学试剂，检测过程安全方便；反应条件温和，适用于食品酿造、饲料添加、面粉改良、医药领域等。
以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例1中葡萄糖氧化酶活力随反应温度变化的关系曲线。
图2是本发明实施例2中葡萄糖氧化酶活力随溶液pH变化的关系曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
本发明提供了测葡萄糖氧化酶活性的方法，包括以下步骤：
(1)使用磷酸盐缓冲液稀释葡萄糖氧化酶作为待测酶液，记录稀释倍数为N，并将待测酶液水浴预热；
其中，磷酸盐缓冲液是由NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O混合制备的浓度为0.05-0.25mol/l，pH为3.0-7.0的磷酸盐缓冲液；优选的，磷酸盐缓冲液浓度为0.1mol/l，pH为6.0；
(2)配制葡萄糖溶液、碘化钾溶液和钼酸铵溶液，将三者混匀后水浴预热，分为多份反应底物备用；
具体的，葡萄糖溶液的浓度为180g/l，碘化钾溶液的浓度为100g/l，钼酸铵溶液的浓度为10g/l；碘化钾溶液：葡萄糖溶液：钼酸铵溶液的体积比优选为25:3:1；
(3)取V1 ml水浴预热后的待测酶液，加入到一份步骤(2)的反应底物中，酶解反应T分钟后立即加入硫酸溶液终止反应；
具体的，酶解反应的温度为20-45℃，优选为37℃；
(4)取V1 ml磷酸盐缓冲液加入到另一份步骤(2)的反应底物中，T分钟后立即加入与步骤(3)中等量的硫酸溶液，作为空白对照组；
具体的，上述硫酸溶液浓度为1mol/l；
(5)向步骤(3)得到的产物中滴加指示剂，混匀后，使用浓度为f mol/l的碘单质还原剂滴定至无色，记录碘单质还原剂消耗的体积为V2 ml；同时对步骤(4)的空白对照组进行相同的滴定反应，记录碘单质还原剂消耗的体积为V3 ml；
具体的，指示剂为淀粉指示剂；碘单质还原剂包括硫化氢、二氧化硫、硫代硫酸钠溶液中的一种，优选为硫代硫酸钠；
(6)根据公式计算葡萄糖氧化酶活性X
其中，a为碘单质还原剂与双氧水的换算系数，碘单质还原剂为硫代硫酸钠时，换算系数a为2；1000为转化因子。
下面通过具体实施例对本发明检测葡萄糖氧化酶活性的方法的效果进行研究，本发明实施例中使用的葡萄糖氧化酶来自武汉新华扬生物股份有限公司。
本发明实施例中葡萄糖氧化酶稀释之后的酶浓度控制在8-12U/ml。对于酶活性未知的样品，采用本发明提供的方法经过多次预实验得出酶活性大概范围后，将酶浓度控制在8-12U/ml再进行实验检测，其误差均小于8％(酶活性检测误差的规定值)。当酶浓度不在该范围之内时，稀释倍数不同，误差均大于8％。
实施例1：
本实施例检测了葡萄糖氧化酶在不同温度下的酶活性，具体步骤如下：
(1)配制磷酸盐缓冲液：取877ml的0.1mol/l NaH2PO4·2H2O和123ml的0.1mol/lNa2HPO4·12H2O混匀后使用0.1mol/l的Na2HPO4溶液调节pH至6.0，即得0.1mol/l的磷酸盐缓冲液；
使用磷酸盐缓冲液稀释葡萄糖氧化酶作为待测酶液，待测酶液在37℃水浴锅中水浴保温5min；
(2)制备底物试剂：180g/l的葡萄糖溶液，配制方法为称取无水葡萄糖18g，溶于80mL水中，搅拌至完全溶解后，用水定容至100ml；100g/l的碘化钾溶液，配制方法为称取碘化钾10g，溶于80ml水中，搅拌至完全溶解后，用水定容至100ml；10g/l的钼酸铵溶液，配制方法为称取1g钼酸铵，溶于80mL水中，搅拌至完全溶解后，用水定容至100m l；
制备反应底物：将2.5ml碘化钾溶液、0.3ml葡萄糖溶液和0.1ml钼酸铵溶液混合均匀，于37℃水浴锅中保温5min后作为一份反应底物；
(3)配制滴定反应试剂：1mol/l的硫酸溶液，配制方法为取30ml浓硫酸定容至100ml；10g/l的淀粉指示剂，配制方法为在约30ml沸水中加入1g溶于少量水的可溶性淀粉，加热沸腾3min后，定容至100ml，24h内使用；0.01mol/l的硫代硫酸钠溶液，配制方法为称取26g五水合硫代硫酸钠，加0.2g无水碳酸钠，溶于1000ml水中，缓缓煮沸10min，冷却放置2周后标定，稀释10倍后使用；
实验组1：移取0.1ml稀释N＝300倍并保温好的待测酶液于一份反应底物中，混匀，37℃水浴下酶解反应5min后加入2ml硫酸溶液终止反应，随后加入2滴淀粉指示剂，摇匀，使用硫代硫酸钠滴定至无色，记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积为V2＝10.5ml；
实验组2：采用与实验组1相同的酶解和滴定方法，区别在于酶解温度为20℃，酶液稀释倍数为N＝200倍，记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积为V2＝11.5ml；
实验组3：采用与实验组1相同的酶解和滴定方法，区别在于酶解温度为30℃，酶液稀释倍数为N＝300倍，记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积为V2＝9.8ml；
实验组4：采用与实验组1相同的酶解和滴定方法，区别在于酶解温度为45℃，酶液稀释倍数为N＝250倍，记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积为V2＝11.0ml；
实验组5：采用与实验组1相同的酶解和滴定方法，区别在于酶解温度为50℃，酶液稀释倍数为N＝220倍，记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积为V2＝11.9ml；
实验组6：采用与实验组1相同的酶解和滴定方法，区别在于酶解温度为60℃，酶液稀释倍数为N＝170倍，记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积为V2＝10.0ml；
实验组7：采用与实验组1相同的酶解和滴定方法，区别在于酶解温度为70℃，酶液稀释倍数为N＝100倍，记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积为V2＝10.6ml；
空白对照组：移取0.1ml磷酸盐缓冲液于一份反应底物中，混匀，分别于20℃、30℃、45℃、50℃、60℃、70℃反应5min后加入2ml硫酸溶液终止反应，随后加入2滴淀粉指示剂，摇匀，使用硫代硫酸钠滴定至无色，消耗的硫代硫酸钠溶液体积为V3＝0.06ml；
根据公式计算葡萄糖氧化酶活性X
其中，x为葡萄糖氧化酶活力，单位为u/g或u/ml；
V1为进行酶解反应的待测酶液体积，单位为ml；
V2为实验组消耗硫代硫酸钠的体积，单位为ml；
V3为空白对照组消耗硫代硫酸钠的体积，单位为ml；
f为硫代硫酸钠溶液的浓度，单位为mol/L，；
a为硫代硫酸钠与双氧水的换算系数，2mmol/l硫代硫酸钠相当于1mmol/l的双氧水，此时a＝2；
1000为转化因子，1mmol＝1000μmol；
N为葡萄糖氧化酶经磷酸盐缓冲液稀释的倍数；
T为酶解反应时间，单位为min；
葡萄糖氧化酶活力随反应温度变化的关系曲线如图1所示。
实施例2：
本实施例检测了葡萄糖氧化酶在不同pH下的酶活性，具体步骤如下：
(1)配制不同pH的磷酸盐缓冲液：将0.1mol/l NaH2PO4·2H2O和0.1mol/lNa2HPO4·12H2O混匀后，使用0.1mol/l的Na2HPO4溶液调节pH，制备浓度为0.1mol/l，pH分别为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0和8.0的磷酸盐缓冲液；
(2)制备底物试剂：180g/l的葡萄糖溶液，配制方法为称取无水葡萄糖18g，溶于80mL水中，搅拌至完全溶解后，用水定容至100ml；100g/l的碘化钾溶液，配制方法为称取碘化钾10g，溶于80ml水中，搅拌至完全溶解后，用水定容至100ml；10g/l的钼酸铵溶液，配制方法为称取1g钼酸铵，溶于80mL水中，搅拌至完全溶解后，用水定容至100ml；
制备反应底物：将2.5ml碘化钾溶液、0.3ml葡萄糖溶液和0.1ml钼酸铵溶液混合均匀，于37℃水浴锅中保温5min后作为一份反应底物；
(3)配制滴定反应试剂：1mol/l的硫酸溶液，配制方法为取30ml浓硫酸定容至100ml；10g/l的淀粉指示剂，配制方法为在约30ml沸水中加入1g溶于少量水的可溶性淀粉，加热沸腾3min后，定容至100ml，24h内使用；0.01mol/l的硫代硫酸钠溶液，配制方法为称取26g五水合硫代硫酸钠，加0.2g无水碳酸钠，溶于1000ml水中，缓缓煮沸10min，冷却放置2周后标定，稀释10倍后使用；
实验组1：使用pH为6.0的磷酸盐缓冲液稀释葡萄糖氧化酶作为待测酶液，稀释倍数为N＝300，待测酶液在37℃水浴锅中水浴保温5min；移取0.1ml保温好的待测酶液于一份反应底物中，混匀，37℃水浴下酶解反应5min后加入2ml硫酸溶液终止反应，随后加入2滴淀粉指示剂，摇匀，使用硫代硫酸钠滴定至无色，记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积为V2＝10.5ml；
实验组2：采用与实验组1相同的实验方法，区别在于使用pH为3.0的磷酸盐缓冲液稀释葡萄糖氧化酶作为待测酶液，酶液稀释倍数为N＝200,记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积为V2＝10.82ml；
实验组3：采用与实验组1相同的实验方法，区别在于使用pH为4.0的磷酸盐缓冲液稀释葡萄糖氧化酶作为待测酶液，酶液稀释倍数为N＝240,记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积为V2＝10.42ml；
实验组4：采用与实验组1相同的实验方法，区别在于使用pH为5.0的磷酸盐缓冲液稀释葡萄糖氧化酶作为待测酶液，酶液稀释倍数为N＝250,记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积为V2＝10.22ml；
实验组5：采用与实验组1相同的实验方法，区别在于使用pH为5.5的磷酸盐缓冲液稀释葡萄糖氧化酶作为待测酶液，酶液稀释倍数为N＝270,记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积为V2＝11.02ml；
实验组6：采用与实验组1相同的实验方法，区别在于使用pH为7.0的磷酸盐缓冲液稀释葡萄糖氧化酶作为待测酶液，酶液稀释倍数为N＝190,记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积为V2＝10.02ml；
实验组7：采用与实验组1相同的实验方法，区别在于使用pH为8.0的磷酸盐缓冲液稀释葡萄糖氧化酶作为待测酶液，酶液稀释倍数为N＝60,记录消耗的硫代硫酸钠溶液体积为V2＝11.42ml；
空白对照组：移取pH为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0和8.0磷酸盐缓冲液0.1ml于一份反应底物中，混匀，37℃反应5min后加入2ml硫酸溶液终止反应，随后加入2滴淀粉指示剂，摇匀，使用硫代硫酸钠滴定至无色，消耗的硫代硫酸钠溶液体积为V1＝0.04ml；
(4)根据公式计算葡萄糖氧化酶活性X
其中，x为葡萄糖氧化酶活力，单位为u/g或u/ml；
V1为进行酶解反应的待测酶液体积，单位为ml；
V2为实验组消耗硫代硫酸钠的体积，单位为ml；
V3为空白对照组消耗硫代硫酸钠的体积，单位为ml；
f为硫代硫酸钠溶液的浓度，单位为mol/L，；
a为硫代硫酸钠与双氧水的换算系数，2mmol/l硫代硫酸钠相当于1mmol/l的双氧水，此时a＝2；
1000为转化因子，1mmol＝1000μmol；
N为葡萄糖氧化酶经磷酸盐缓冲液稀释的倍数；
T为酶解反应时间，单位为min；
葡萄糖氧化酶活力随溶液pH变化的关系曲线如图2所示。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种双量程气体检测装置及气体检测仪