一种富含抗菌物质的发酵饲料及其制备方法
阅读说明：本技术 一种富含抗菌物质的发酵饲料及其制备方法 (Fermented feed rich in antibacterial substances and preparation method thereof ) 是由 陈芳艳 钟杨生 李家安 严会超 林碧敏 林健荣 于 2021-07-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种富含抗菌物质的发酵饲料及其制备方法。所述发酵饲料由包括碳源、氮源、磷酸氢二钾、硫酸镁、水、多粘类芽孢杆菌SP1的原料发酵所得；所述多粘类芽孢杆菌SP1保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏日期为2021年4月16日,保藏编号为GDMCC No：61605。本发明的饲料制备方法工艺简单,通过本方法得到的发酵饲料,富含有抗菌物质,可替代部分抗生素的应用；同时有效磷、蛋白溶解度、酸溶蛋白含量升高,粗脂肪含量显著下降,利于动物,特别是幼仔吸收和利用,具有很好的推广应用价值。(The invention discloses a fermented feed rich in antibacterial substances and a preparation method thereof. The fermented feed is obtained by fermenting raw materials comprising a carbon source, a nitrogen source, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, water and paenibacillus polymyxa SP 1; the paenibacillus polymyxa SP1 is preserved in Guangdong province microorganism strain preservation center with the preservation date of 2021, 4 months and 16 days, and the preservation number is GDMCC No: 61605. the preparation method of the feed is simple in process, and the fermented feed obtained by the method is rich in antibacterial substances and can replace part of antibiotics; meanwhile, the content of available phosphorus, protein solubility and acid soluble protein is increased, the content of crude fat is obviously reduced, the absorption and utilization of animals, especially young animals are facilitated, and the method has good popularization and application values.)
技术领域
本发明涉及发酵饲料的技术领域，更具体地，涉及一种富含抗菌物质的发酵饲料及其制备方法。
背景技术
现有养殖饲料技术中，抗生素被大量使用，引发了一系列问题，运用抗生素会增加施用目标微生物、寄生虫的抗药性，而因为抗药性的出现人们往往再次使用时需要进一步加大抗生素的剂量和种类，这又会加剧抗药性的产生，因此形成恶性循环，造成抗生素的滥用；这不仅给养殖增加了大量成本和危害，而且抗生素在食物链运行过程中短时间难以消失，人类作为食物链的顶端成为了抗生素药物残留的受害者。在我国畜禽饲料禁用抗生素政策的全面实施的前提下，迫切需要一种避免抗生素带来的耐药性以及药物残留问题的饲料配方。
微生物发酵饲料具有提高动物饲料利用率和适口性、维持其肠道菌群微生态平衡、增强机体免疫功能、提高动物抗病力和生产性能等突出功能，凸显了其在动物养殖过程中饲料替代、减少抗生素使用、提高宿主免疫力和抵抗疾病发生等方面的潜在作用。如在饲料中添加抗菌肽(中国专利CN102150752A)、土霉素、甲酸盐等抗菌添加剂能起到抗菌的作用(中国专利CN1242689C)，但由于食源性致病微生物生存能力强，常分布于各种食物原料、污水中，长期使用抗菌添加剂，其成本较高，且对于养殖动物产生一定的毒害作用。
另外，养殖动物特别是幼仔，由于肠道功能发育不健全，对于食物中的高含量蛋白、粗脂肪难以消化吸收，产生消化障碍，并有呕吐、食欲不振、肠胃炎等症状，影响动物健康，严重时可导致死亡，影响养殖的成活率。磷不易被动物吸收，饲料中能被利用的磷成为有效磷，其含量越高，越利于动物对于磷的摄取。对于此问题，往往通过添加脂肪酶、蛋白酶、植酸酶等酶制剂的方法来促进动物的吸收(CN103719596A、CN104621413A)，但添加酶制剂所需费用较高。
发明内容
本发明为解决目前在饲料中运用抗生素、抗菌添加剂会导致耐药性、药物残留、药物毒害、酶制剂的添加造成工艺复杂成本高的技术缺陷，提供一种富含抗菌物质的发酵饲料及其制备方法。
本发明为了实现上述目的，采用以下技术方案：
本发明提供一种富含抗菌物质的发酵饲料及其制备方法，以提高饲料原料的利用率、对常见食源性致病微生物有有效作用可用于替代部分抗生素，并且工艺简单成本低，饲料安全无毒害，能普遍应用于畜禽养殖中，发酵所用的菌具有广谱抑菌效果，对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K12D31、大肠杆菌O78、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱沙门氏菌等常见畜禽致病菌有抑制作用，蚕类等昆虫类养殖对象常见致病菌苏云金杆菌、黑胸败血菌也有良好的抑菌作用，可以用作昆虫类养殖，特别是蚕类的饲料添加剂。发酵所用的菌SP1可以产生蛋白酶、脂肪酶、植酸酶，对于蛋白、脂肪、磷有良好的发酵作用，可以使饲料有效磷、蛋白溶解度、酸溶蛋白含量升高，粗脂肪含量显著下降，本发酵饲料利于畜禽特别是其幼仔对营养物质蛋白、脂肪、磷的吸收，降低饲料蛋白脂肪原料的添加量，能有效控制养殖成本。本饲料发酵是利用一种兼具高效发酵和抑菌功能的多粘类芽孢杆菌。
具体地，制备该发酵饲料的原料组分包括：碳源、氮源、磷酸氢二钾、硫酸镁、水、多粘类芽孢杆菌SP1。所述多粘类芽孢杆菌SP1保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2021年4月16日，保藏编号为GDMCC No：61605。
进一步的，各组分按重量份计为：碳源10-13份、氮源1-5份、磷酸氢二钾0.0025-0.25份、硫酸镁0.000073-0.0073份、水15-25份、多粘类芽孢杆菌SP1为2-4份。
优选地，所述碳源为麸皮或玉米粉，氮源为豆粕或豆粉。
进一步的，磷酸氢二钾采用磷酸氢水合物：K2HPO4·2H2O，硫酸镁采用硫酸镁水合物：MgSO4·7H2O。
更进一步的，各组分的重量份数为：麸皮12份、豆粕3份、K2HPO4·2H2O 0.03份、MgSO4·7H2O 0.0015份、水20份、多粘类芽孢杆菌SP1为3份。
进一步的，所述的发酵饲料，采用的水为无菌水。
进一步的，所述的发酵饲料，多粘类芽孢杆菌SP1使用形式为发酵液，其中菌密度不低于1×106cfu。
优选地，多粘类芽孢杆菌SP1发酵液菌密度为(1×106)-(1×1010)cfu。
经过优选的初始添加密度，是和其他各相匹配，并在相应温度条件下可以使饲料达到最优抑菌和发酵效果的最优饲料成品。
为达到上述目的，本发酵饲料采用的制备方法如图1，具体步骤为：
S1:原料预处理：取碳源、氮源、磷酸氢二钾、硫酸镁，加水混合均匀；然后灭菌；
S2:培养SP1菌得到发酵液；
S3:饲料发酵：无菌环境下，在步骤S1灭菌后的混合物中接种SP1菌发酵液进行发酵，发酵过程中间歇对水料进行翻动；发酵完成后，得到富含抗菌物质的发酵饲料。
其中，优选地，步骤S1中的灭菌温度为100-150℃，灭菌时间为15-30min。
优选地，步骤S3的发酵条件为：温度控制在29℃-31℃，发酵时间为30-72h，翻动频次为：每12小时1次。
本发明的有益效果为：
本发明在饲料原料中加入多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SP1发酵后获得(我国农业部将多粘类芽孢杆菌列为免做安全鉴定的一级菌种)，SP1为发明人课题组分离获得的一株可产生多肽抗生素、拮抗蛋白、酶蛋白等多种生物活性物质的多粘类芽孢杆菌，对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K12D31、大肠杆菌O78、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱沙门氏菌、苏云金杆菌、黑胸败血菌等多种菌株有良好的抑菌作用，发酵不产生硫化氢气体。与普通的发酵饲料主要通过微生物维持动物肠道菌群微生态平衡而提高畜禽的抗病能力相比，本发明专利提供的发酵饲料不仅可以调节动物肠道菌群微生态平衡、富含抗菌物质可以直接杀死病原菌，通过一种菌便可以完成发酵及抑菌作用，得到的发酵饲料对于普通畜禽常见肠道致病菌有抑制作用，特别对于昆虫类养殖对象蚕类致病菌有较好的抑制作用，可以通过抑制苏云金杆菌、黑胸败血菌实现对蚕类猝倒病、败血病的预防。
而且，该菌株能分泌脂肪酶、植酸酶等多种酶蛋白，可使原料中的有效磷、蛋白溶解度、酸溶蛋白含量升高，粗脂肪含量显著下降，利于动物，特别是幼仔吸收和利用。
本发酵饲料安全对养殖生物无毒害、发酵时间短、制备工艺简单，适合推广应用。
附图说明
图1为本发酵饲料的制备方法流程图
图2为不同碳源对SP1菌发酵效果的影响对比图
图3不同氮源对SP1菌落数的影响对比图
图4麸皮与豆粕质量比对SP1菌落数的影响对比图
图5添加不同浓度K2HPO4对SP1菌落数影响对比图
图6添加不同浓度MgSO4对SP1菌落数的影响对比图
图7添加不同浓度MnSO4对SP1菌落数的影响对比图
图8不同料水比对发酵活菌数的影响对比图
图9不同接种量对发酵活菌数的影响对比图
图10不同发酵时长对发酵活菌数的影响对比图
图11发酵上清液和发酵饲料提取液的抑菌活性图
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1-2为饲料的实施例，实施例3-11为本发酵饲料结合饲料制备方法的实施例。
实施例1发酵菌筛选
申请人从华南农业大学桑园的土壤中，采用琼脂孔扩散法，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，比较筛选获得一株抑菌活性最高的菌株，记为菌株SP1。
经形态鉴定、分子鉴定的综合结果，鉴定菌株SP1属于多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，并于2021年4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址是广东省科学院微生物研究所(广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，保藏编号为GDMCC No：61605。
实施例2制备发酵饲料
1、按照以下重量组分称取各组分：
碳源麸皮12份、
氮源豆粕3份、
磷酸氢二钾水合物(K2HPO4·2H2O)0.03份、
硫酸镁水合物(MgSO4·7H2O)0.0015份、
水20份，
多粘类芽孢杆菌3份，多粘类芽孢杆菌为SP1菌，SP1菌密度为1×106cfu/每份。
2、发酵饲料制备方法包括如下步骤：
S1:原料预处理：取碳源、氮源、磷酸氢二钾水合物、硫酸镁水合物，加水混合均匀；然后120℃灭菌20min；
S2:培养SP1菌得到发酵液；
S3:饲料发酵：无菌环境下，在步骤S1灭菌后的按每30g混合物接种3mL SP1菌发酵液(1×106cfu/mL)，(30±1)℃恒温进行发酵48h，间歇对水料进行翻动,翻动频次为每12小时1次；发酵完成后，得到富含抗菌物质的发酵饲料。
实施例3制备发酵饲料
1、按照以下重量组分称取各组分：
碳源玉米粉12份、
氮源豆粉3份、
磷酸氢二钾水合物(K2HPO4·2H2O)0.03份、
硫酸镁水合物(MgSO4·7H2O)0.0015份、
水20份，
多粘类芽孢杆菌3份，多粘类芽孢杆菌为SP1菌，SP1菌密度为1×106cfu/每份。
2、发酵饲料制备方法同实施例2。
实施例4制备发酵饲料
1、按照以下重量组分称取各组分：
碳源麸皮10份、
氮源豆粕1份、
磷酸氢二钾水合物(K2HPO4·2H2O)0.0025份、
硫酸镁水合物(MgSO4·7H2O)0.000073份、
水15份，
多粘类芽孢杆菌2份，多粘类芽孢杆菌为SP1菌，SP1菌密度为1×106cfu/每份。
2、发酵饲料制备方法同实施例2。
实施例5制备发酵饲料
1、按照以下重量组分称取各组分：
碳源玉米粉13份、
氮源豆粉5份、
磷酸氢二钾水合物(K2HPO4·2H2O)0.25份、
硫酸镁水合物(MgSO4·7H2O)0.0073份、
水25份，
多粘类芽孢杆菌4份，多粘类芽孢杆菌为SP1菌，SP1菌密度为1×106cfu/每份。
2、发酵饲料制备方法同实施例2。
实施例6制备发酵饲料
1、按照以下重量组分称取各组分：
碳源麸皮10份、
氮源豆粕5份、
磷酸氢二钾水合物(K2HPO4·2H2O)0.0025份、
硫酸镁水合物(MgSO4·7H2O)0.0073份、
水20份，
多粘类芽孢杆菌3份，多粘类芽孢杆菌为SP1菌，SP1菌密度为1×106cfu/每份。
2、发酵饲料制备方法同实施例2。
实施例7发酵饲料的指标测试
1、理化性质
对实施例2-6所得的饲料进行发酵前后的理化性质观察和相关指标测定，结果显示：本发明制备的发酵饲料呈黄褐色，具有豆香气，活菌数高达6×109cfu/g以上，其中实施例2制备的发酵饲料的活菌数为6.33×109cfu/g，有良好的抑菌效果。
2、发酵效果
以实施例2制备的发酵饲料为例测试其发酵前后相关指标的变化情况。
结果显示，本发酵饲料发酵效果良好，与发酵前相比，发酵后有效磷含量提高了48.44％，蛋白溶解度中氮含量提高了11.11％，酸溶蛋白中氮含量提高了35.29％，粗脂肪含量下降了43.79％，更有利于动物，特别是肠胃功能不健全的幼仔对于脂肪及蛋白质的的吸收利用，减少因脂肪过量引起的呕吐、消化不良(表1)。
表1发酵前后各项指标变化
实施例8发酵饲料原料中碳源的选择
以实施例2的方法为基础上变换碳源进行实验。具体是：分别取12g稻壳、12g麸皮和12g玉米粉作为碳源，每组各加入3g黄豆粉作为氮源，再加入一定质量的K2HPO4·2H2O和MgSO4·7H2O，搅拌混合均匀后，将各组分别加入15mL无菌水，然后120℃高温灭菌20min，待温度降到30℃左右后，接入3mL(约106cfu/mL)SP1种子液，搅拌混匀，置于培养箱中发酵培养，停止发酵后取样测定固体发酵物的含菌量及产物的抗菌活性。
结果见图2，在含有麸皮、玉米粉的两组培养基中，检测到产生的活菌数分别为2.0×108cfu/g、1.55×108cfu/g，可见麸皮与玉米粉比较适合菌株SP1的固体发酵。由于使用麸皮固体发酵的效果优于玉米粉，均优于稻壳。
实施例9发酵饲料原料中氮源的选择
以实施例2的方法为基础上变换氮源进行实验。具体是：取12g麸皮作为碳源，分别以3g酵母粉、3g黄豆粉、3g豆粕作为氮源，再加入一定质量的K2HPO4·2H2O和MgSO4·7H2O，搅拌混合均匀后，将各组分别加入15mL无菌水，然后120℃高温灭菌20min，待温度降到30℃左右后，接入3mL(约106cfu/mL)SP1种子液，搅拌混匀，置于培养箱中发酵培养，停止发酵后取样测定固体发酵物的含菌量及产物的抗菌活性。
结果见图3，在含酵母粉的麸皮中SP1菌不生长。含黄豆粉和豆粕的麸皮检测到产生的活菌数分别为2.53×108cfu/g、3.67×108cfu/g，因此选用豆粕优于黄豆粉，本多粘类芽孢杆菌SP1不能利用酵母粉。
实施例10发酵饲料原料中碳源与氮源比例的优化
配制麸皮与豆粕质量比分别为1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1的6个组，再分别加入一定质量的K2HPO4·2H2O和MgSO4·7H2O，混合均匀后，再加入15mL无菌水，然后120℃高温灭菌20min，待温度降到30℃左右后，接入3mL(约106cfu/mL)SP1种子液，搅拌混匀，置于培养箱中发酵培养，停止发酵后取样测定固体发酵物的含菌量。控制料水比为1：1的基础上，麸皮与豆粕质量比分别为1∶2，即麸皮5g、豆粨10g；麸皮与豆粕质量比分别为1∶1，即麸皮7.5g、豆粨7.5g；麸皮与豆粕质量比分别为2∶1，即麸皮10g、豆粨5g；麸皮与豆粕质量比分别为4∶1，即麸皮12g、豆粨3g；麸皮与豆粕质量比分别为6∶1，即麸皮12.9g、豆粨2.1g；麸皮与豆粕质量比分别为8：1，即麸皮13.3g、豆粨1.7g。
结果见图4，最佳质量比为麸皮12g、豆粕3g，即麸皮：豆粕质量比为4∶1。
实施例11发酵饲料原料中K2HPO4含量选择
称取5份麸皮(12g)和豆粕(3g)原料，分别加入2％、0.2％、0.02％、0.002％、0％(w/w)K2HPO4·2H2O，混合均匀后，再加入15mL无菌水，然后120℃高温灭菌20min，待温度降到30℃左右后，接入3mL(约106cfu/mL)SP1种子液，搅拌混匀，置于培养箱中发酵培养，停止发酵后取样测定固体发酵物的含菌量。
结果见图5，最佳添加K2HPO4水合物浓度为0.2％。
实施例12发酵饲料原料中MgSO4含量选择
称取5份麸皮(12g)和豆粕(3g)原料，加入30mg K2HPO4·2H2O，再分别加入1％、0.1％、0.01％、0.001％、0％(w/w)的MgSO4·7H2O，混合均匀后，再加入15mL无菌水，然后120℃高温灭菌20min，待温度降到30℃左右后，接入3mL(约106cfu/mL)SP1种子液，搅拌混匀，置于培养箱中发酵培养，停止发酵后取样测定固体发酵物的含菌量及产物的抗菌活性。
结果见图6，最佳MgSO4水合物添加浓度为0.01％，即1.5mg。
实施例13发酵饲料原料中MnSO4的筛选
MnSO4的筛选。称取5份麸皮(12g)和豆粕(3g)原料，加入30mg K2HPO4·2H2O，1.5mgMgSO4·7H2O，混合均匀后，再分别加入1％、0.1％、0.01％、0.001％、0％(w/w)的MnSO4，再加入15mL无菌水，然后120℃高温灭菌20min，待温度降到30℃左右后，接入3mL(约106cfu/mL)SP1种子液，搅拌混匀，置于培养箱中发酵培养，停止发酵后取样测定固体发酵物的含菌量。
结果见图7，与其他多粘类芽孢杆菌不同，Mn离子对本多粘类芽孢杆菌SP1的生长有抑制作用，不添加的生长最好。
实施例14发酵饲料原料中料水比选择
称取3份麸皮(12g)和豆粕(3g)原料，加入30mg K2HPO4·2H2O，1.5mg MgSO4·7H2O，按料水比分别为3∶2、1∶1、3∶4、3∶4(g/mL)的比例加入蒸馏水10mL，15mL、20mL、25mL，然后120℃高温灭菌20min，待温度降到30℃左右后，接入3mL(约106cfu/mL)SP1种子液，搅拌混匀，置于培养箱中发酵培养，停止发酵后取样测定固体发酵物的含菌量。
结果见图8，最佳料水比为3g∶4mL，即20mL蒸馏水。
实施例15发酵初始接种量筛选
称取4份麸皮(12g)和豆粕(3g)原料，加入30mg K2HPO4·2H2O、1.5mg MgSO4·7H2O、20mL无菌水，然后120℃高温灭菌20min，待温度降到30℃左右后，分别接入1mL、2mL、3mL、4mL(约106cfu/mL)SP1种子液，搅拌混匀，置于培养箱中发酵培养，停止发酵后取样测定固体发酵物的含菌量。
结果见图9，最佳初始接菌量为3mL。
实施例16发酵时间选择
称取3份麸皮(12g)和豆粕(3g)原料，加入30mg K2HPO4·2H2O、1.5mg MgSO4·7H2O、20mL无菌水，然后120℃高温灭菌20min，待温度降到30℃左右后，接入3mL(约106cfu/mL)SP1种子液，搅拌混匀，置于培养箱中发酵培养24h、48h、72h时取样测定固体发酵物的含菌量。
结果见图10，最佳发酵时长48h。
实施例17抑菌效果验证
1、实验方法和步骤
通过琼脂孔扩散法检测抑菌圈的大小，来判定发酵液和发酵饲料的抑菌效果。
LB培养基包括LB液体培养基和LB固体培养基。
LB液体培养基(1000mL)：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，用蒸馏水定容到1L，pH6.0～7.0，于121℃高压灭菌20min。
LB固体培养基(1000mL)：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，1.5％的琼脂粉，用蒸馏水定容到1L，pH6.0～7.0，于121℃高压灭菌20min。
方法如下：将灭菌后的LB培养基置室温待其冷却至48-50℃时，吸取指示菌金黄色葡萄球菌稀释液100μL，将指示菌稀释液加入到10mL经溶解并冷却至40～50℃LB固体培养基中，立即倒入直径为90mm的培养皿中，迅速振荡摇匀，以使菌体均匀分散，待其冷却凝固后，用直径2.7mm的打孔器打孔3个，备用。每孔分别加入5uL的无菌水、5uL SP1发酵液、5uL发酵饲料提取液，静置30min后，于37℃培养24h，观察并测量抑菌圈大小，并记录数据。
2、测试结果
对金黄色葡萄球菌的抑菌效果如图11，其中CK1为无菌水对照(2.7mm，即点样孔的直径)；CK2为SP1发酵液的抑菌圈(12.78mm)；1为发酵饲料提取液的抑菌圈(18.86mm)。
结果表明，本发明多粘类芽孢杆菌SP1发酵液具有很好的抑菌效果，而采用本发明的方法所制备的发酵饲料的抑菌效果又得到了显著提升。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。