一种利用扩张蛋白预处理黄原胶降低其黏度的应用
阅读说明：本技术 一种利用扩张蛋白预处理黄原胶降低其黏度的应用 (Application of xanthan gum pretreated by expansin to reduce viscosity of xanthan gum ) 是由 李蓉 李宪臻 刘珊君 于 2021-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用扩张蛋白预处理黄原胶降低其黏度的应用方法,属于降低黄原胶黏度的预处理技术领域。本发明通过使用扩张蛋白预处理黄原胶解聚,促使黄原胶黏度下降。采用本发明的方法,克服了传统化学法处理黄原胶时使用大量的强碱溶液,对设备要求高、产品质量差等现有技术中的不足。节约了成本,不造成环境污染,符合环境友好型。同时,这种方法简单易行,利于工业推广应用。(The invention discloses an application method for reducing viscosity of xanthan gum by utilizing expansin to pretreat the xanthan gum, and belongs to the technical field of pretreatment for reducing viscosity of the xanthan gum. The invention promotes the viscosity reduction of the xanthan gum by pretreating the xanthan gum for depolymerization by using the expansin. The method overcomes the defects of the prior art that the traditional chemical method uses a large amount of strong alkali solution when processing the xanthan gum, has high requirements on equipment, poor product quality and the like. Saves cost, does not cause environmental pollution and is environment-friendly. Meanwhile, the method is simple and easy to implement and is beneficial to industrial popularization and application.)
技术领域
本发明属于降低黄原胶黏度的预处理技术领域，具体涉及一种利用扩张蛋白预处理黄原胶降低其黏度的应用方法。
背景技术
黄原胶是一种微生物多糖，是以β-(1,4)葡聚糖为主链，间隔一个葡萄糖基上含有β-D-甘露糖、β-D-葡萄糖醛酸、以及α-D-甘露糖所形成的侧链为基本结构单元的多糖物质。未经过任何处理的黄原胶分子间具有丰富的氢键而形成复杂的二级结构，导致其水溶液具有非常大的黏度。只可通过强碱、离子液体或者高温预处理黄原胶促进其黏度下降，然后用水解酶降解黄原胶生成黄原胶寡糖。产物黄原胶寡糖具有如壳寡糖、海藻寡糖等生物活性寡糖的通性，例如具有清除体外自由基和抑制致病菌生长的潜力。在医药、食品保健品、种植等领域有了更大的应用价值。这使得降低黄原胶黏度就成为一个可提高其水解效率的重要关键步骤。
目前降低黄原胶黏度的主要方法是，用强碱溶剂在高温条件下溶解黄原胶，降低其黏度，后续需要调节黄原胶溶液的pH至中性进行酶解生成黄原胶寡糖。此方法在生产过程需要高温，并在产生中使用强碱溶剂，对生产设备高要求且易造成环境污染。因此，寻找一种绿色、高效预处理黄原胶降低其黏度的方法越来越受重视。
扩张蛋白来自于细菌和植物，是一种非水解性的辅助蛋白，对具有多糖网状结构的底物具有破坏作用，在不水解它们的过程中断裂多糖之间的氢键，打开多糖底物的致密晶体结构。从而可以使水分子或水解酶进入多糖底物，使其形成水溶性形态。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用扩张蛋白预处理黄原胶解聚应用方法；旨在克服了传统化学法水解黄原胶时的化学试剂污染环境、产品质量差等现有技术中的不足，提供了一种经济高效、环保型酶法预处理黄原胶应用。
一种基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述基因编码的扩张蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种上述扩张蛋白的重组表达菌。
一种利用扩张蛋白预处理黄原胶降低其黏度的应用，将扩张蛋白加入黄原胶中进行预处理，即可降低黄原胶黏度。
进一步地，预处理黄原胶时的最适温度为50℃，反应时间为72h。
本发明利用扩张蛋白预处理黄原胶解聚降低其黏度的应用方法相较于已报道的黄原胶的降低黏度的方法，其采用的生物法高效水解黄原胶中的氢键，破坏黄原胶致密的网格结构来预处理黄原胶解聚降低其黏度。采用本发明的方法，克服了传统化学法处理黄原胶时使用大量的强碱溶液，对设备要求高、产品质量差等现有技术中的不足。节约了成本，不造成环境污染，符合环境友好型。同时，这种方法简单易行，利于工业推广应用。
附图说明
图1为本发明的扩张蛋白纯化后的纯蛋白SDS-PAGE电泳图；图中，第一泳道：蛋白Marker；第二泳道：空菌pET-28a/BL21全菌体；第三泳道：空菌pET-28a/BL21表达上清；第四泳道：重组菌pET-28a-HcEX/BL21表达上清。
图2为本发明的扩张蛋白预处理黄原胶解聚最适温度。
图3为本发明的扩张蛋白预处理黄原胶解聚最适反应时间。
图4为未处理黄原胶与本发明的扩张蛋白预处理黄原胶解聚的黏度比较。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明的方法做进一步的说明。
下面通过实施例对本发明做进一步描述，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围，实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。如无特殊说明，本发明所使用试剂均市售可得。
实施例1扩张蛋白重组菌构建
按照SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，委托第三方公司进行合成，即所述扩张蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示，编码区长660bp。由扩张蛋白基因编码的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。合成SEQ ID NO.1基因序列连接在质粒pET-28a，得到重组pET-28a-HcEX质粒(吉林省库美生物科技有限公司合成基因)。制备大肠杆菌BL21感受态，将重组pET-28a-HcEX质粒电转入BL21，涂布在含有30μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选，挑多个单菌落于含30μg/ml的卡那霉素的LB液体培养基中30℃、200rpm培养12小时，用T7通用引物进行菌落PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，证明正确构建的重组表达菌，将该重组菌命名pET-28a-HcEX/BL21。
SEQ ID NO.1
GAAAACCGTGTTTCTGCGACTCACACCTCCGCCGCGCTGCATGAGGGTGAAGGTACTTACTACTTCTACAACGGCGGCGGCCATTGCAGCGTTCCGGTGCCGGCGATGTTCACTGCAGCGATGAACCAGACCGACTATAACGGTTCCCAGGCTTGTGGCGGTTGCGTTAAGGTGACCAACCGCAACAACGGCAAGTCCGTGGTGGCGCGCGTTGACGACTCTTGTCCGGGCTGCAACCCGGGTGACGTGGATCTGACCGACGCCGCCTTCGCGCAGATTTCTCCACTGGAGGCGGGTCGCATTCCGATCAGCTGGGATTATGTTCCGTGCGATTATCCGTCTGTGCTGCTGTACTTCATGGAAGGTTCTAGCCAGTGGTGGACCGCCGTGCAAGTACGCGAACAGCGTTATCCGGTAAGCTCTCTGGCGTACCGTGAATCTGGTTCTACCGGCTCCTATCAGGAGATCGCCCGTGAAGACTACAACTACTTTGTTGAACGTTCCGGCATGGGTACCGGCCCGTTTGATTTTCGCATCACCGACATCTATGGTCATGTGCTGGAAGCAGGTAACATCACCCTGCAGTCTGGCGTTCCGATCAACACCCAGCAACAGTTTCCGTCTATGGGTACCTCCGGCGTTATTAACCAGGCAGACAAA
SEQ ID NO.2
实施例2扩张蛋白在重组菌表达
将实施例1中鉴定正确的重组菌划线pET-28a-HcEX/BL21在30μg/ml卡那霉素的LB平板上；挑单菌落于5mL的30μg/ml卡那霉素的LB液体，培养12h，作为种子液；按照1:50比例(体积比)接入30μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养，直至OD600＝1，加入IPTG终浓度为0.6mM，在16℃、200rpm培养20小时。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩张蛋白的表达情况，结果如图1所示，扩张蛋白在IPTG的诱导下有明显的表达。
实施例3扩张蛋白预处理黄原胶解聚条件的研究
对实施例1获得的扩张蛋白pET-28a-HcEX/BL21以黄原胶为底物，进行预处理黄原胶解聚条件的测定，包括最适温度和反应时间
(1)最适温度测定
实验组为使用0.5wt％黄原胶作为底物，扩张蛋白在不同的温度条件下(40℃、50℃、60℃)、200rpm、反应72小时，用NDJ-79A旋转粘度计(上海昌吉地质仪器有限公司)测黄原胶的黏度，0.5wt％黄原胶为对照组，为结果如图2所示在反应温度为50℃时，黄原胶黏度从214mPa.s下降到150mPa.s，黏度下降最为显著，因此扩张蛋白的最适温度为50℃。
(2)最适反应时间测定
在上述最适温度的条件下，同样的体系，在不同时间下(12h、24h、36h、48h、72h)反应，用NDJ-79A旋转粘度计测黄原胶的黏度。结果如图3所示，84h时黄原胶的黏度已无变化，考虑到蛋白的稳定性，因此扩展蛋白作用黄原胶最适反应时间为72h。
实施例4扩张蛋白预处理黄原胶降低黏度
取15mg实施例1获得的扩张蛋白pET-28a-HcEX/BL21作用20ml 0.5wt％黄原胶，50℃160rpm下反应72h用NDJ-79A旋转粘度计测黄原胶的黏度变化，对照组为20ml0.5wt％黄原胶，50℃200rpm下反应72h用NDJ-79A旋转粘度计测黄原胶的黏度变化。以反应后黄原胶黏度与反应前黄原胶黏度相对比得到相对黏度比，如图4所示，对照组的黄原胶其相对黏度比无变化，而扩张蛋白预处理后的黄原胶黏度降低30％。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连工业大学
<120> 一种利用扩张蛋白预处理黄原胶降低其黏度的应用
<130> 2021
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列（Artifical Sequence）
<400> 1
gaaaaccgtg tttctgcgac tcacacctcc gccgcgctgc atgagggtga aggtacttac 60
tacttctaca acggcggcgg ccattgcagc gttccggtgc cggcgatgtt cactgcagcg 120
atgaaccaga ccgactataa cggttcccag gcttgtggcg gttgcgttaa ggtgaccaac 180
cgcaacaacg gcaagtccgt ggtggcgcgc gttgacgact cttgtccggg ctgcaacccg 240
ggtgacgtgg atctgaccga cgccgccttc gcgcagattt ctccactgga ggcgggtcgc 300
attccgatca gctgggatta tgttccgtgc gattatccgt ctgtgctgct gtacttcatg 360
gaaggttcta gccagtggtg gaccgccgtg caagtacgcg aacagcgtta tccggtaagc 420
tctctggcgt accgtgaatc tggttctacc ggctcctatc aggagatcgc ccgtgaagac 480
tacaactact ttgttgaacg ttccggcatg ggtaccggcc cgtttgattt tcgcatcacc 540
gacatctatg gtcatgtgct ggaagcaggt aacatcaccc tgcagtctgg cgttccgatc 600
aacacccagc aacagtttcc gtctatgggt acctccggcg ttattaacca ggcagacaaa 660
<210> 2
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artifical Sequence）
<400> 2
Glu Asn Arg Val Ser Ala Thr His Thr Ser Ala Ala Leu His Glu Gly
1 5 10 15
Glu Gly Thr Tyr Tyr Phe Tyr Asn Gly Gly Gly His Cys Ser Val Pro
20 25 30
Val Pro Ala Met Phe Thr Ala Ala Met Asn Gln Thr Asp Tyr Asn Gly
35 40 45
Ser Gln Ala Cys Gly Gly Cys Val Lys Val Thr Asn Arg Asn Asn Gly
50 55 60
Lys Ser Val Val Ala Arg Val Asp Asp Ser Cys Pro Gly Cys Asn Pro
65 70 75 80
Gly Asp Val Asp Leu Thr Asp Ala Ala Phe Ala Gln Ile Ser Pro Leu
85 90 95
Glu Ala Gly Arg Ile Pro Ile Ser Trp Asp Tyr Val Pro Cys Asp Tyr
100 105 110
Pro Ser Val Leu Leu Tyr Phe Met Glu Gly Ser Ser Gln Trp Trp Thr
115 120 125
Ala Val Gln Val Arg Glu Gln Arg Tyr Pro Val Ser Ser Leu Ala Tyr
130 135 140
Arg Glu Ser Gly Ser Thr Gly Ser Tyr Gln Glu Ile Ala Arg Glu Asp
145 150 155 160
Tyr Asn Tyr Phe Val Glu Arg Ser Gly Met Gly Thr Gly Pro Phe Asp
165 170 175
Phe Arg Ile Thr Asp Ile Tyr Gly His Val Leu Glu Ala Gly Asn Ile
180 185 190
Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ile Asn Thr Gln Gln Gln Phe Pro Ser
195 200 205
Met Gly Thr Ser Gly Val Ile Asn Gln Ala Asp Lys
210 215 220
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