一种钴掺杂的金属有机框架的纳米颗粒的制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种钴掺杂的金属有机框架的纳米颗粒的制备方法及其应用 (Preparation method and application of cobalt-doped metal organic framework nanoparticles ) 是由 谭振权 宫艺书 宋学志 于 2021-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于材料技术领域,涉及一种钴掺杂的金属有机框架的纳米颗粒的制备及其应用,具有较好的羟基自由基产生能力及良好的载药性能。掺杂的钴金属离子使得反应体系内成核数量增多,大大消耗了相对配体的浓度,聚乙烯吡咯烷酮作为稳定剂,保护并分散纳米颗粒,使得纳米颗粒在较小的尺寸停止生长,从而实现小尺寸的CoZn-MOF-5材料的合成。该纳米粒子材料尺寸较小,分散性较好,并有较高的负载能力,在高谷胱甘肽表达的酸性肿瘤细胞微环境下可以灵敏地被控制释放,同时材料中掺杂的钴离子还可以与肿瘤细胞过表达的过氧化氢反应生成羟基自由基,实现化学动力学疗法与化学疗法的协同,是一种良好的纳米抗癌药物载体。(The invention belongs to the technical field of materials, and relates to preparation and application of cobalt-doped metal organic framework nanoparticles, which have good hydroxyl radical generation capacity and good drug loading performance. The quantity of nuclei in a reaction system is increased due to the doped cobalt metal ions, the concentration of relative ligands is greatly consumed, and the polyvinylpyrrolidone is used as a stabilizer to protect and disperse the nanoparticles, so that the nanoparticles stop growing in a small size, and the synthesis of the small-size CoZn-MOF-5 material is realized. The nano particle material has smaller size, better dispersibility and higher loading capacity, can be sensitively controlled and released in an acidic tumor cell microenvironment expressed by high glutathione, and meanwhile, the cobalt ions doped in the material can also react with hydrogen peroxide over-expressed by the tumor cells to generate hydroxyl free radicals, so that the synergy of the chemokinetic therapy and the chemotherapy is realized, and the nano particle material is a good nano anticancer drug carrier.)
技术领域
本发明属于材料技术领域，涉及一种钴掺杂的金属有机框架的纳米颗粒的制备及其应用，具体为一种尺寸较小并具有化学动力学疗法的钴掺杂的金属有机框架材料(CoZn-MOF-5)的制备。
背景技术
当今社会，恶性肿瘤已经成为一个全球性公共健康问题，关于其诊疗方法的探究长期以来受到各国政府及研究者的关注。化疗作为癌症治疗最普遍有效的手段，仍存在一些局限性，抗癌药物本身一般不具有肿瘤细胞识别性，对人体的一些免疫细胞、中性粒细胞甚至正常组织细胞也有杀伤能力，会对身体的重要器官造成不可修复的损伤，对肝脏等器官具有较大的毒副作用，因此合适的药物载体就显得尤为重要。
金属有机框架(MOF)是近些年兴起的一种多孔材料，由于其孔径多变、尺寸可调，载药量高、生物相容性好等特点被应用于生物医学领域。随着纳米技术的不断发展，人们对纳米药物载体的要求逐渐从最基础的控制释放，到现在融合更多的诊疗效果，近些年来多模式治疗逐渐吸引人们的注意，结合化疗与化学动力学、光动力学、光热等治疗手段的多模式疗法成为研究的热点，化学动力学疗法(CDT)利用芬顿反应(或类芬顿反应)通过将温和氧化剂H2O2转变为攻击性的羟基自由基(·OH)，从而引起细胞凋亡，利用过渡金属作为中心离子的MOF材料，可以在实现较大载药量的同时结合化学动力学疗法，实现化学动力学疗法与化学疗法的协同。
MOF-5因其较大的比表面积、出色的孔体积和较高的热稳定性被视为氢气吸附储存的良好材料，同时这种材料也被广泛应用于储氢、药物输送、膜和催化等方面。MOF-5材料可以在掺杂适量其他离子后，保持结构不发生变化，掺杂的钴作为过渡金属，可以催化类芬顿反应，在细胞内形成羟基自由基诱导细胞凋亡。小尺寸的药物载体在使用时，可以通过实现高通透性和滞留效应(EPR效应)聚集在肿瘤组织处，实现药物的被动靶向，减小毒副作用，提高循环稳定性，但传统方法合成的MOF-5材料尺寸较大，大多在微米级别，这使得MOF-5在作为药物载体以及制备MOF薄膜等领域都受到一定的限制。
发明内容
本发明的目的是实现化学疗法和化学动力学疗法的协同作用，提供了一种钴掺杂的小尺寸的金属有机框架材料的制备方法，作为纳米载药系统负载抗癌药物，具有较高的载药率和细胞杀伤力。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：
一种钴掺杂的金属有机框架的纳米颗粒(即CoZn-MOF-5纳米颗粒)的制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)、在N、N-二甲基甲酰胺和无水乙醇的混合溶液中加入对苯二甲酸和聚乙烯吡咯烷酮，超声、搅拌至固体全部溶解，得到反应溶液；
步骤(2)、向步骤(1)获得的反应溶液中加入硝酸钴和硝酸锌，室温下搅拌均匀后，在120～150℃温度下水热反应12h以上；反应完全后自然冷却到室温，依次使用N、N-二甲基甲酰胺和无水乙醇进行离心洗涤，直至只剩下固体物质，然后置于60～150℃下真空干燥，获得粒径为60～140nm的钴掺杂的金属有机框架的纳米颗粒。
步骤(1)中的聚乙烯吡咯烷酮分子量大于10000，在反应溶液中的浓度不小于1.56mmol/L；
步骤(1)中的对苯二甲酸和总的硝酸盐(硝酸钴和硝酸锌)的摩尔比为0.15:1～0.2:1；
步骤(1)中，N、N-二甲基甲酰胺和无水乙醇的混合溶液中，N、N-二甲基甲酰胺占混合溶液体积的60％～70％；
步骤(1)中的超声时间至少10min，搅拌时间至少10min；
步骤(2)中离心洗涤时间每次不少于10min，离心洗涤的转数为11000～15000rpm；
步骤(2)中硝酸锌和硝酸钴的摩尔比为1.1:0.9～0.9:1.1。
上述方法制备得到的钴掺杂的金属有机框架的纳米颗粒可用于纳米药物载体负载抗癌药物。
本发明的有益效果：
本发明制备的CoZn-MOF-5纳米颗粒制备简便，具有尺寸较小、形状规则、载药率较高等优点。这种方法以N、N-二甲基甲酰胺和无水乙醇作为混合溶液，无需额外的模板即可合成小尺寸的纳米球，高温高压的水热环境，使得MOF的成核速度变快，额外掺杂的钴金属离子使得反应体系内成核数量增多，大大消耗了相对配体的浓度，聚乙烯吡咯烷酮作为稳定剂，保护并分散纳米颗粒，使得纳米颗粒在较小的尺寸停止生长，DMF洗去未反应完全的配体或金属离子，无水乙醇则取代骨架结构上的DMF成为新的客体分子，并在真空干燥下被除去，从而得到CoZn-MOF-5纳米球。
(1)本发明方法获得的纳米颗粒尺寸较小，且仍具有MOF-5的结构特征，较小的尺寸可以促使纳米药物通过EPR效应积聚在肿瘤部位处，实现对肿瘤组织的被动靶向；
(2)MOF材料弱的配位键可以在肿瘤细胞偏酸性、高谷胱甘肽量的微环境下断裂，释放出包裹的药物和金属离子；
(3)Co2+离子在高水平的H2O2下，发生类芬顿反应生成羟基自由基，促使细胞凋亡，实现化学疗法和化学的动力学疗法的协同作用；
(4)同时材料消耗了还原型谷胱甘肽，使得羟基自由基的持续时间更长，效果更强。
附图说明
图1为本发明中制备的产物的扫描电镜图；
图2为本发明中制备的产物的透射电镜图；
图3为本发明中制备的产物的X射线衍射示意图片(*对应于ZnO)；
图4为本发明中制备的产物的阿霉素负载量的示意图；
图5为本发明中制备的产物的负载阿霉素的缓释结果示意图；
图6为本发明中制备的产物的APF荧光强度示意图；
图7为本发明中制备的产物的细胞毒性实验结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，结合附图进一步阐述本发明。但以下所有实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
称取2.4mg的对苯二甲酸和150mg的聚乙烯吡咯烷酮，溶解在6.4mL的体积比为5:3的DMF与无水乙醇的混合溶液中，超声10分钟使固体全部溶解，置于磁力搅拌器上搅拌10分钟，混合均匀后加入11.6mg的六水合硝酸锌和11.35mg的六水合硝酸钴，搅拌至均匀澄清后，转移至13mL的特氟龙反应釜中，置于鼓风烘箱中能够150℃反应12h，缓慢冷却至室温，11000rpm转速离心获得沉淀，DMF洗3次，无水乙醇洗3次，置于60℃真空干燥箱内干燥24h，从而获得CoZn-MOF-5纳米颗粒。
图1为本实施例所得产物的扫描电镜图(SEM)，从图中可以看出，制得的纳米颗粒呈均匀球状，尺寸为60～140nm，图2为实施例1产物的透射电镜(TEM)，与SEM结果吻合。图3为实施例1的X射线衍射图(XRD)，6.9°、9.7°、13.8°、15.4°可以观察到明显的衍射峰，分别对应于MOF-5的(200)、(220)、(400)、(420)晶面，证明了MOF-5结构的成功合成，30～40°出现的强衍射峰对应与ZnO，来自被困于骨架结构内多余的锌物质。
实施例2
称取1.94mg的对苯二甲酸和100mg的聚乙烯吡咯烷酮，溶解在6.4mL的体积比为3:2的DMF与无水乙醇的混合溶液中，超声10分钟使固体全部溶解，置于磁力搅拌器上搅拌10分钟，混合均匀后加入12.76mg的六水合硝酸锌和10.22mg的六水合硝酸钴，搅拌20分钟，转移至13mL的特氟龙反应釜中，烘箱120℃反应20h，缓慢冷却至室温，11000rpm转速离心收集产物，DMF洗3次，无水乙醇洗3次，置于100℃真空干燥箱内干燥24h，从而获得CoZn-MOF-5纳米颗粒，且仍可保持较小的尺寸。
实施例3
称取2.59mg的对苯二甲酸和150mg的聚乙烯吡咯烷酮，溶解在6.4mL的体积比为7:3的DMF与无水乙醇的混合溶液中，超声15分钟使固体全部溶解，置于磁力搅拌器上搅拌15分钟，混合均匀后加入10.44mg的六水合硝酸锌和12.48mg的六水合硝酸钴，搅拌15分钟，转移至13mL的特氟龙反应釜中，烘箱130℃反应15h，缓慢冷却至室温，11000rpm转速离心收集产物，DMF洗3次，无水乙醇洗3次，置于150℃真空干燥箱内干燥20h，从而获得CoZn-MOF-5纳米颗粒，且仍可保持较小的尺寸。
实施例4
以pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制浓度约为1mg/mL的阿霉素溶液，超声至无明显沉淀，并用紫外可见分光光度计在480nm的波长下测定其准确浓度(C1)，取不同体积(Vx)的上述溶液，分别加入0.5mL(1mg/mL)的CoZn-MOF-5的溶液中，并用PBS补充至2mL，得到浓度分别为42.04μg/mL、84.08μg/mL、126.12μg/mL、170.4μg/mL、213μg/mL、255.6μg/mL的不同浓度的溶液体系，在避光的条件下搅拌24小时，得到的样品在11000rpm的转速下离心3次，每次使用2mL的PBS进行洗涤，得到6mL上清液，用紫外可见分光光度计在480nm的吸光度下测其浓度(C2)，计算得到药物的负载率。实验结果如图4所示，从图中可以看出CoZn-MOF-5的载药率随着阿霉素浓度的增大而增大。计算公式如下：
随着阿霉素浓度的不断增高，CoZn-MOF-5的最大载药率可以达到268％。
实施例5
取相同量的[email protected]，在不同pH值下进行缓释，具体操作如下：取[email protected]分别溶解于4mL的pH＝7.4、pH＝5.0、pH＝5.0且GSH＝10mM的PBS缓冲溶液中，装入3.5kDa MWCO透析袋中，用封口夹夹住透析袋两端，另取烧杯装入20mL对应的PBS溶液，将透析袋内液体浸没在烧杯液面以下，置于磁力搅拌器上搅动，在2h、6h、12h、24h、36h、48h时分别取出2mL烧杯缓冲溶液并补充等体积的PBS，用紫外可见分光光度计测量其阿霉素浓度，实验结果如图5所示，48小时后，pH＝5.0且GSH＝10mM的条件下释放了64.7％，pH＝5.0的条件下释放了36％，而pH＝7.4的条件下仅释放了7％左右，这也就显示了这种材料具有pH刺激响应和GSH刺激响应两种响应模式。同时我们采用APF荧光探针对生成的羟基自由基的量进行了测定，结果如图6所示，羟基自由基的生成量随H2O2的浓度升高而增大，证明材料可以产生类芬顿效应，将温和氧化剂H2O2转变为具有攻击性的·OH。
实施例6
1、在96孔板中逐孔加入100μL的10000Cell/mL的4T1小鼠乳腺癌细胞，置于培养箱中培养12h(37℃，5％CO2)。
2、12小时后，吸出培养基，分别加入1640培养基配制的不同浓度的[email protected]溶液，每种浓度设3个复孔，并设置空白对照孔。
3、将培养板在培养箱中孵育24h。
4、向每孔加入10μL CCK8溶液，将培养板在培养箱内孵育1h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
细胞毒性实验其余对照组，除步骤2中加入溶液不同，其余步骤均相同。实验结果如图7所示，从图中我们可以看出CoZn-MOF-5比未掺杂钴的Zn-MOF-5具有更高的杀伤效果，这种杀伤效果来自于Co的掺入引起的化学动力学疗法的结果。