具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

发明人研究发现，目前临床常用的对比剂常为钆喷替酸葡甲胺(gadolinium-DTPA，Gd-DTPA)和钆特酸葡胺(gadolinium-gadolinium(III)1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate，Gd-DOTA)为代表的钆类对比剂，但也在一定程度上存在游离的Gd离子导致的肾纤维化毒性和潜在的神经毒性等问题。另外，随着恶性肿瘤分子靶向治疗时代的到来，这些小分子对比剂因为非常短的循环时间、缺乏靶向性、特异性差等缺陷远远无法满足恶性肿瘤精准诊断和实时疗效监控的要求。

此外，在TNBC治疗过程中，阿霉素(doxorubicin,DOX)是一种广谱抗肿瘤化疗药，其作用机理主要是该药品嵌入DNA而抑制核酸的合成，具有强烈的细胞毒性作用。其抗瘤谱较广，属周期非特异性药物，临床上常用于乳腺癌的治疗。但是其具有严重的副作用，如白细胞和血小板受损、心脏毒性等。

与此同时，因TNBC肿瘤细胞微环境中肿瘤浸润淋巴细胞浸润程度较高，故作为一种新兴治疗手段，免疫治疗显示出巨大的临床发展潜力。通过抑制免疫检查点程序化细胞死亡蛋白-1(programmedcelldeathprotein-1,PD-1)及其配体PD-L1可以激活人体内T细胞自身免疫起到抗癌作用。然而，发明人发现，免疫检查点抑制剂的单药治疗对于TNBC患者的帮助是有限的，客观缓解率(objective response rate,ORR)的范围从PD-1/PD-L1阳性人群中的5％到一线PD-L1阳性人群中的23％不等。

因此本发明提出一种靶向药物纳米体系及其制备方法和应用，以四氧化三铁(Fe₃O₄)为载体，借助[email protected]₃O₄磁性纳米粒子超顺磁性的特征，通过表面电荷吸引的方式将免疫治疗药物和化疗药修饰在纳米粒子表面。

具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：

本发明第一方面，提供一种靶向药物纳米体系，所述靶向药物纳米体系以四氧化三铁为载体，表面修饰免疫治疗药物和化疗药物。

本发明一些实施方式利用Fe₃O₄制备一种新型的靶向药物纳米体系，其特点是：利用免疫治疗药物实现诊治的靶向性、同步实现免疫治疗和化疗药物的联合治疗，并基于MRI实现对疗效的实时可视化监控，从而实现乳腺癌的精准的诊疗，显著提升其诊治水平，具有重要的价值和意义。

在本发明一个或多个实施方式中，所述化疗药选自柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌、紫杉醇中的一种或多种。

在本发明一个或多个实施方式中，所述免疫治疗药物选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体中的一种或多种。

其中，以四氧化三铁(Fe₃O₄)为载体，表面修饰抗PD-L1抗体及化疗药DOX，合成靶向PD-L1的诊疗一体化纳米体系([email protected]₃O₄-DOX，FPD)。

在一些实施方式中，四氧化三铁(Fe₃O₄)为纳米颗粒或纳米球。

本发明第二方面，提供一种靶向药物纳米体系的制备方法，包括：将2,3-二巯基丁二酸(DMSA)修饰后的四氧化三铁与免疫治疗药物和化疗药混合即可。

现有技术公开了一些被动靶向载体药物，需要借助脂质体通过小窝蛋白介导的内吞作用摄取进入肿瘤细胞内，该脂质体最终通过诱发肿瘤细胞发生铁凋亡的形式实现肿瘤治疗的目的。但是无法对肿瘤和药物实时监测。

本发明一些实施方式通过以四氧化三铁为载体，表面修饰免疫治疗药物和化疗药物，可以靶向乳腺癌细胞，通过免疫和化疗联合治疗，促进CD4+细胞在肿瘤部位聚集，互相促进的方式加强疗效。

实验发现如果不对四氧化三铁进行2,3-二巯基丁二酸(DMSA)修饰，则无法在不含脂质体等成分的条件下负载免疫治疗药物和化疗药。

在本发明一个或多个实施方式中，将2,3-二巯基丁二酸溶解在去离子水中，加入四氧化三铁，再加入四氢呋喃，超声，反应，即可得到2,3-二巯基丁二酸修饰后的四氧化三铁；

将2,3-二巯基丁二酸修饰后的四氧化三铁分散在水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐和磺基-N-羟基琥珀酸，再加入免疫治疗药物和化疗药，低温条件下反应过夜，即得。

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐和磺基-N-羟基琥珀酸的作用是避免纳米颗粒过度聚集，使暴露2,3-二巯基丁二酸修饰后的四氧化三铁出更多的表面，有助于免疫治疗药物和化疗药物的修饰。

在本发明一个或多个实施方式中，所述2,3-二巯基丁二酸和四氧化三铁质量比为1.5-4:1，优选为2:1。

如果2,3-二巯基丁二酸用量过高，则DMSA不能与四氧化三铁良好结合，如果2,3-二巯基丁二酸用量过少，则DMSA与四氧化三铁结合不充分，进而影响影响免疫治疗药物和化疗药物的修饰。

四氧化三铁、免疫治疗药物和化疗药物比例为：400g:1g:2L。

本发明第三方面，提供一种靶向药物纳米体系在制备乳腺癌药物中的应用。

本发明第四方面，提供一种T2WI阴性对比剂，包括靶向药物纳米体系。

本发明第五方面，提供一种靶向药物纳米体系在制备T2WI阴性对比剂中的应用。

本发明第六方面，提供一种靶向药物纳米体系在MRI实时监控中的应用。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

实验原料：

FeCl₃·6H₂O：国药集团化学试剂有限公司，上海；油酸钠：麦克林生化科技有限公司，上海；十八烯：阿拉丁控股集团有限公司，北京；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐，磺基-N-羟基琥珀酸：源叶生物科技有限公司，上海；CCK-8试剂盒：贝博公司，上海；4％兔红细胞试剂盒：索莱宝科技有限公司，北京；4T1细胞，MCF-10A细胞：中乔新舟生物科技有限公司，上海；1640培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)：Gibio公司，美国；100X青霉素-链霉素混合液：Solarbio公司，北京；T25培养瓶、6孔板、96孔板、15mL离心管、50mL离心管、冻存管：Corning公司，美国。

实验仪器：

JEM-2100透射电子显微镜：JEOL公司，日本；Malvern纳米球度及电位分析仪分析：Malvern仪器公司，英国；电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)：Becton Dickinson公司，美国；北京；3.0T核磁共振扫描仪：GE公司，美国；超声波清洗器。扫描线圈采用小动物线圈。

实施例1：FPD([email protected]₃O₄-DOX)的合成

Fe₃O₄纳米球的合成

10.8g FeCl₃·6H₂O和36.5g油酸钠加入到60mL去离子水，80mL乙醇和140mL正己烷的混合溶液中，其混合溶液在70℃条件下加热搅拌4h，目的产物油酸铁通过分液、蒸馏来提纯。得到的油酸铁加入5.7g油酸和200g十八烯中，混合均匀后，加热到320℃，保温半小时，反应结束后，冷却至室温，加入过量乙醇沉淀出Fe₃O₄纳米颗粒，并用乙醇洗涤三次。

洗涤后的Fe₃O₄纳米球通过与2,3-二巯基丁二酸(DMSA)反应，生成水分散的纳米材料。将40mg DMSA溶解在含有Na₂CO₃的去离子水溶液中，加入20mg Fe₃O₄纳米颗粒，再加入1mL四氢呋喃，在超声的条件下反应半小时，然后在摇床上反应1小时，即可得到DMSA修饰的Fe₃O₄纳米球(Fe₃O₄-DMSA)。

将Fe₃O₄-DMSA分散到2mL水中，浓度为1mg/mL，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐和磺基-N-羟基琥珀酸，然后加入100μgDOX+50μL PD-L1抗体，4℃条件下反应过夜，反应后，将得到的产物离心提纯，即可得到FPD，保存于4℃冰箱。

对比例1：FP([email protected]₃O₄)的合成

与实施例1区别在于：将Fe₃O₄-DMSA分散到2mL水中，浓度为1mg/mL，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐和磺基-N-羟基琥珀酸，然后加入50μL PD-L1抗体，4℃条件下反应过夜，反应后，将得到的产物离心提纯，即可得到FP([email protected]₃O₄，Fe₃O₄纳米球表面修饰PD-L1抗体)，保存于4℃冰箱。

其余与实施例1相同。

对比例2：FD(Fe₃O₄-DOX)的合成

与实施例1区别在于：将Fe₃O₄-DMSA分散到2mL水中，浓度为1mg/mL，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐和磺基-N-羟基琥珀酸，然后加入100μg DOX，4℃条件下反应过夜，反应后，将得到的产物离心提纯，即可得到FD(Fe₃O₄-DOX,Fe₃O₄纳米球装载DOX)，保存于4℃冰箱。

其余与实施例1相同。

一、产物检测方法：

1、表征

采用透射电子显微镜和高分辨率透射电子显微镜(TEM,HRTEM,JEM-2100,JEOL，日本)对纳米球的形貌和晶体结构进行表征。在德国Bruker D8高级粉末衍射仪(D8 Advance,Bruker,Germany)上以Cu Kα为X射线源，对Fe₃O₄纳米球的结构信息进行了X射线衍射(XRD)表征。利用红外分光光度计(Nicolet Nexus 670,Thermo Fisher Scientific,Inc)获得傅里叶变换红外(FTIR)光谱，分析纳米材料的表面官能团。通过振动样品磁强计(MicroMagTM模型2900AGM系统)对制备的纳米球进行饱和磁化。用紫外-可见分光光度计(UV-6100，美普达，西安)对合成的水的紫外-可见(UV-vis)光吸收光谱进行分析。利用Zeta电位分析仪(ZetaPALS,Brookhaven Instrument Crop,Holtsville NY,USA)对纳米颗粒悬浮液的表面电荷特性和粒径分布进行了表征。

2、体外T2弛豫率检测

(1)FPD溶液配制：在2mg/mL的FPD溶液里加入不同体积的超纯水，配制成Fe离子浓度为0.025325、0.05065、0.1013、0.2026、0.4052mM的FPD溶液，其中Fe离子的浓度由ICP-MS测定。进行MR扫描之前，用超声振荡器进行震荡15min，确保FPD溶解充分。

(2)T2弛豫率：采用3.0T核磁共振扫描仪(GE Signa HDx)扫描。利用T1快速自旋回波(FSE)序列获取T2加权成像和T2弛豫时间，其参数如下：重复时间(TR)＝4240ms；回波时间(TE)＝108ms。扫描结束后，利用工作站的T₂ mapping功能测量不同溶液浓度的T2值。通过线性拟合T2弛豫时间倒数与Fe离子浓度进而获得横向弛豫率(r₂)。

3、细胞毒性检测

(1)取对数生长期的4T1细胞种于96孔板中，使细胞密度约为6×10³个细胞/孔，每孔加入100uL含10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基，将96孔板置于37℃5％CO₂细胞培养箱中培养24h后，倒置相差显微镜观察细胞贴壁情况及生长状态。

(2)用移液器将96孔板各孔中培养基吸尽，各孔分别加入终浓度为0、25、50、100、200μg/mL的Fe₃O₄溶液，阴性对照组为含10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基，每组设置5个复孔。将96孔板置于37℃5％CO₂细胞培养箱中培养一定时间(6、12、24、48h)。

(3)用移液器将96孔板各孔中溶液吸尽，无菌PBS溶液清洗2遍，各孔加入100uL新鲜培养基，再依次各孔加入10uL CCK-8溶液，避光条件下将96孔板置于37℃5％CO₂细胞培养箱中培养2h。

(4)将96板置于酶标仪中，测定450nm各孔的吸光值，计算细胞活力，将各测试孔的OD值减去空白孔OD值，各重复孔的OD值取平均数。细胞活力％＝(加[email protected]细胞OD-空白OD)/(对照细胞OD-空白OD)×100。

4、溶血实验

(1)将4％兔红细胞配成2％红细胞悬液备用。

(2)将Fe₃O₄、FP、FD、FPD分别配制成不同浓度梯度的纳米材料(200、100、50、25、12.5、6.25μg/mL)。

(3)将配置好的纳米材料放置于37℃水浴锅中30min，同时设置1mL的蒸馏水和生理盐水作为对照。

(4)每管加入1mL红细胞悬液37℃ 1h后3000r/min 5min离心，拍照观察。

二、表征结果分析：

1、纳米球的构建及表征

通过油热法制备的Fe₃O₄纳米球。用透射电镜(TEM)和HRTEM(HRTEM)表征了合成的纳米球的形貌和晶体结构。如图1a所示，所制备的纳米颗粒形状均匀，粒径在20nm左右。所得纳米球的HRTEM图像(图1b)显示，纳米球结晶度良好，晶面间距d＝0.29nm对应于(422)晶面。经DMSA分子修饰后，Fe₃O₄-DMSA具有良好的分散性(图1c)。XRD图谱(图1d)显示，合成的纳米球与标准PDF卡(19-0629)对应，表明纳米球具有良好的结晶度。此结果与HRTEM结果一致。在振动样品磁力计上通过饱和磁化曲线测量合成的Fe₃O₄纳米球的超顺磁性能，确认室温下饱和磁化强度可达53emu/g(图1e)。为了确认DMSA分子对Fe₃O₄纳米颗粒表面的修饰，对FTIR光谱进行了分析，如图1f所示。对于Fe₃O₄样品，位于2916和2847cm^-1处的强峰对应亚甲基的C-H伸缩振动，这是由于纳米Fe₃O₄表面残留有油酸分子造成的。2037cm^-1左右的宽峰对应于C-O伸缩振动。对于Fe₃O₄-DMSA样品，在1569和1360cm^-1处的尖峰对应着大量的对称和不对称羧酸盐(COO-)拉伸。在3243cm^-1处的宽峰是由O-H伸缩振动引起的。位于1046cm-1处的峰对应于C-O伸缩振动。这些峰的位置表明了DMSA分子的丰富存在。红外光谱结果证实DMSA分子已成功修饰在Fe₃O₄纳米颗粒表面。

2、Fe₃O₄的细胞毒性实验

生物安全性一直是评价纳米材料在体内应用的最关键指标之一，CCK-8实验利用生成甲瓒物的数量与活细胞数量成正比这一特性原理，可用于检测材料的细胞毒性。乳腺正常细胞MCF-10A细胞(图2a)和乳腺癌4T1细胞(图2b)与Fe₃O₄共孵育6、12、24及48h后，如图2所示，在Fe₃O₄浓度为25、50、100、200μg/mL的条件下，与对照组相比(不加入Fe₃O₄)，MCF-10A及4T1细胞的细胞活力接近100％，此结果表明Fe₃O₄在0-200μg/mL浓度范围内对4T1和MCF-10A细胞均没有明显的细胞毒性。

3、FPD的T2弛豫率检测

通过测定FPD的弛豫率，来检测FPD作为对比剂用于磁共振成像的性能。FPD在0.025325、0.05065、0.1013、0.2026、0.4052mM下的T2WI图像及伪彩图，如图3a和3b所示，由此做出的拟合曲线(图3c)可知FPD的弛豫率为146.43mM^-1s^-1，说明FPD可以作为T2WI阴性对比剂。

4、FPD的溶血实验

在使用FPD及其他分组的纳米材料进行动物实验之前，溶血实验是必要的。实验结果表明，不同浓度的(6.25-200μg/mL)的纳米球，包括Fe₃O₄，FP，FD，FPD及生理盐水处理的兔红细胞均没有出现明显的溶血和聚集现象(图4)，这一结果表明实施例和对比例制备的纳米材料对红细胞没有毒性，具有较好的生物安全性，可以进行进一步的实验。

Fe₃O₄-NPs也有一些公认的缺陷，包括：①尺寸较难控制。②磁化率低。③合成路线复杂。④需要进一步修饰以增加稳定性。实施例1合成的FPD较为稳定，可以作为良好的纳米合成材料用于乳腺癌的诊疗一体化研究。TEM电镜结果显示，FPD为粒径20nm左右的球形颗粒，首先球形有利于材料在体内的运输，而且20nm在Fe₃O₄作为T 2对比剂成像的最佳粒径范围内，同时能在不被吞噬系统吞噬的前提下在体内有足够的蓄积时间，从而更好的被被肿瘤细胞摄取。

另外，由于本材料作为T2成像对比剂，在成像效果上可能不如T1成像直接和清晰。因此，需要在进一步的实验中，借助动物肿瘤负荷模型探索最佳的成像时间和剂量。

三、[email protected]₃O₄-DOX纳米球的体外成像及疗效方法

1、实验试剂与耗材

小鼠4T1细胞，中乔新舟生物科技有限公司，上海；1640培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)：Gibio公司，美国；普鲁士蓝试剂盒、100X青霉素-链霉素混合液：索莱宝公司，北京；33342/PI双染试剂盒：索莱宝公司，北京；DCFH-DA活性氧ROS荧光探针：百奥莱博科技有限公司，北京；二甲基亚砜、RIPA裂解液、Trizol、吐温：索莱宝公司，北京；浓硝酸、浓盐酸、吡啶、乙醇、甲醇：国药集团，北京；玻底培养皿：Corning公司，美国。

2、实验动物

动物实验通过山东大学齐鲁医院动物伦理委员会及动物保护委员会批准。

5-6周龄雌性Balb/c小鼠购于北京华阜康实验动物有限公司，北京。

SPF级辐照饲料：北京华阜康实验动物有限公司，北京。

细胞培养及一般处理(见上文“细胞毒性检测过程”中细胞的培养方法)

细胞PD-L1的免疫荧光实验

为了评估PD-L1靶点的可行性，对4T1细胞进行免疫荧光染色。免疫荧光实验如下所述。本实施例或对比例使用的抗体如下：抗PD-L1抗体(1:2000；MCE)与Alexa Fluor 488抗体。然后用稀释1∶500的DAPI孵育4T1细胞；Thermo Fisher Scientific)，标记核20分钟。照片用荧光显微镜和共焦显微镜拍摄。

第一天：

(1)取处于对数生长期的4T1细胞，种于事先放好爬片的6孔板中，每孔约5×10⁵个细胞，待其过夜贴壁。

(2)PBS洗3次，每次3min。

(3)4％的多聚甲醛固定。

(4)PBS洗3次，每次3min。

(5)0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min。

(6)PBS浸洗玻片3次，每次3min。

(7)正常山羊血清室温封闭30min。

(8)滴加一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。

第二天：

(9)PBST浸洗爬片3次，每次3min。

(10)加荧光二抗。

(11)加DAPI避光孵育5min。

(12)封片液封片，荧光显微镜下采集图像。

3、细胞摄取Fe的ICP-MS实验

(1)取处于对数生长期的4T1细胞，种于2个细胞板中(6孔)，保证细胞密度孵育过夜后正好铺满(约为6×10⁵个细胞/孔)，每孔加入2mL按比例配制好的1640完全培养基(含10％FBS和1％青霉素-链霉素)，将细胞板放入37℃5％CO₂的细胞孵箱中培养过夜，用倒置显微镜观察细胞贴壁生长的状况。

(2)用移液器吸走6孔板中原有的培养基，然后用无菌PBS清洗2遍后，实验组加入FP，阴性对照组加入Fe₃O₄，每孔按浓度10μg/mL加入材料，另设一P组，加入浓度为20μg/mL的FP。每孔用1640完全培养基定容至1mL，每组设置3个复孔。将2个6孔板置于37℃5％CO₂细胞培养箱中培养4小时。

(3)用移液器吸走6孔板中原有的溶液，然后用无菌PBS溶液清洗2遍，各孔加入0.5mL含0.02％EDTA的胰蛋白酶消化3min，显微镜下观察细胞变小变圆且成流沙状时，加入1～1.5倍的1640完全培养基终止消化，用血小球计数板对每组各孔内细胞进行分别计数，800rpm离心5分钟后弃去上清液。

(4)提前配制好王水，配制方法：在玻璃棒的不断搅拌下，缓慢的将1体积浓硝酸加到3体积的浓盐酸当中，形成黄色的混合物。每孔细胞内加入1mL王水进行充分消化。3天后，取220μm的细菌滤器，对未被消化掉的细胞残渣进行滤过，然后加入4mL的超纯水进行定容至5mL，利用ICP-MS对Fe浓度进行测定。公式：每细胞内Fe的质量/pg＝(ICP-MS测定Fe的浓度*5mL)/细胞数量。3个复孔分别细胞计数、ICP-MS测定计算每细胞内Fe的质量，计算平均数及标准差。

4、细胞摄取Fe的普鲁士蓝实验

(1)取处于对数生长期的4T1细胞，种于3个细胞板中(6孔)，保证细胞密度孵育过夜后正好铺满(约为6×10⁵个细胞/孔)，每孔加入2mL按比例配制好的1640完全培养基(含10％FBS和1％青霉素-链霉素)，将细胞板放入37℃5％CO₂的细胞孵箱中培养过夜，用倒置显微镜观察细胞贴壁生长的状况。

(2)用移液枪吸走每孔内原有培养基，用无菌PBS清洗两遍，实验组加入FPD，阴性对照组加入等量的Fe₃O₄，设置3个浓度梯度，分别是10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，每孔定容至1mL，将细胞板置于37℃5％CO₂细胞培养箱中培养4h。

(3)用移液器吸走6孔板中原有的溶液，然后用无菌PBS溶液清洗2遍，4％多聚甲醛固定20min。等量Perls A和Perls B混合，配制成Perls stain。用自来水清洗固定好的六孔板2遍，每次3min。再用蒸馏水冲洗2次，每次3min。六孔板每孔内首先加入Perls stain 1mL染色30min，然后蒸馏水充分冲洗10min。再用伊红染色液淡染细胞核30s，自来水冲洗5s。倒置相差显微镜下观察细胞染色情况。

5、细胞摄取的磁共振成像

为了评估FPD在体外的靶向效果，设置了Fe₃O₄、FP和FPD组。加入不同组别的纳米200μL(2mg/mL)，孵育2h。孵育后用细胞刮板收集细胞。PBS洗净，离心(800rpm/500min)，重悬PBS并进行MR成像。

(1)取一瓶处于对数生长期的4T1细胞，用吸管吸走原有培养基，用无菌PBS清洗两遍，加入1mL的EDTA-胰酶消化液，轻晃培养瓶使胰酶消化液得以充分浸润瓶内细胞。同时在显微镜下观察，当细胞回缩变圆呈流沙状时，加入2mL含血清的培养基，并用移液枪轻轻吹打使细胞全部脱落。再将细胞悬液转移至15mL离心管中，转速800rpm/5min。去除上清液，加入1mL培养基吹打成细胞悬液，均匀分装在三个培养瓶中，在倒置显微镜下观察细胞生长状况并进行正常的换液，待其长到约80％时进行下一步实验。

(2)用吸管吸走三个培养瓶内的旧培养基，用无菌PBS清洗2遍，分别加入200μL(2mg/mL)Fe₃O₄、FP和FPD及4mL 1640完全培养基(含10％FBS和1％青霉素-链霉素)，将培养瓶置于37℃5％CO₂的细胞孵箱中培养4h，用倒置显微镜观察细胞贴壁生长的状况。

(3)用吸管吸走旧培养基，无菌PBS清洗两遍，用细胞刮刀将细胞收集到EP管中，加入1mL PBS吹打重悬成细胞悬液，准备进行磁共振成像。

(4)在3.0T磁共振成像设备(TR 4240ms；TE 108ms；切片厚度1mm；片间距，1mm；矩阵，256×256；FOV，8cm×8cm)。

6、细胞摄取Fe的电镜检测

为了观察不同组别纳米材料的细胞摄取及滞留情况，将4T1细胞放于37℃，5％CO₂恒温培养箱中，并在含有Fe₃O₄、FP、FPD的1640完全培养基中培养1，4和24小时。用细胞刮刀收集细胞，通过TEM观察镜下细胞摄取纳米材料的情况。在JEM-1400透射电子显微镜(JEOL，Japen)下观察。不同时间的细胞摄取图是由830.10U3特异成像系统(CCD照相机)(美国加坦)拍摄。

7、FPD的体外疗效检测实验

(1)Hoechst 33342/PI双染实验

①将4T1细胞接种于细胞爬片的24孔板中。

②细胞分为4组：Fe₃O₄组；FP组；FD组；FPD组。按照不同组别分别加入200μL同浓度的纳米材料(2mg/mL)，继续加入按比例配制好的1640完全培养基(含10％FBS)4mL继续培养4h。

③将共孵育后的不同组别的细胞拿出，用吸管吸走旧培养基后，用无菌冷PBS清洗细胞3遍。依照试剂盒说明书步骤，依次加入Hoechst33342和PI染料以后置于4℃冰箱内反应15min，用冷PBS终止反应。

④用倒置荧光显微镜的红色、紫外通道观察细胞凋亡及死亡情况。

(2)活性氧染色实验

本研究使用DCFH-DA荧光探针进行细胞内活性氧的染色。

①制作1～10mM DMSO储备溶液。未使用的DMSO储备溶液应分装到一次性EP瓶中，并在20℃下保存(避光条件下进行)。

②在生理缓冲液(如PBS，HBSS.HEPES)中使染料的工作浓度为1～10uM。

③将处于对数生长期的4T1细胞接种于事先已经放好细胞爬片的6孔板中(5×10⁵个细胞每孔)，并培养过夜待其贴壁。

④将已贴壁并爬好片的4T1细胞与不同组别的纳米材料(Fe₃O₄组；FP组；FD组；FPD组)进行共孵育，然后将染料工作溶液添加到细胞中，并在室温或37℃下孵育细胞50～60min。

⑤除去染料工作溶液；用预热的PBS清洗3遍。

⑥在荧光共聚焦显微镜下拍照观察。

四、[email protected]₃O₄-DOX纳米球的体外成像及疗效研究结果

1、细胞PD-L1的免疫荧光实验

免疫荧光实验是利用荧光标记抗体与目的抗原的特异性结合，通过荧光显微镜对抗原处的荧光进行拍照，可知细胞中目的抗原的定位和表达情况，从而验证靶点的可行性。考虑到FPD的靶向性，使用免疫荧光染色分析PD-L1在乳腺癌4T1细胞中的表达情况。如图5所示，免疫荧光实验的结果表明PD-L1在乳腺癌4T1细胞膜和细胞质中表达(定性资料)，图中标尺长度为5μm，验证了PD-L1作为纳米主动靶向肿瘤细胞的靶点是可行的。

2、细胞摄取实验

通过TEM检测观察4T1细胞摄取纳米材料的途径及作用时间，并通过ICP-MS检测细胞摄取Fe的量，从而进一步的评测不同组别的纳米材料在体内测定摄取过程。

(1)细胞摄取电镜检测实验

如图6所示，TEM图表明各组纳米材料在一定范围内，随着时间增加，摄取量随之增加，如图6a，b所示，4h时各组细胞摄取的纳米球含量明显大于1h时，即具有一定的时间依赖性。在不同组别的纳米材料与细胞培养1h左右后，就可通过TEM电镜观察到纳米材料进入了细胞内，且主要由溶酶体进行吞噬。此外，Fe₃O₄、FP、FD和FPD被细胞摄取的程度也有显著差异，如图所示，FPD组对纳米材料的摄取量明显大于其他组，说明PD-L1的主动靶向作用使得纳米材料能够更精准高效的到达靶点所在位置，较其他组的EPR被动靶向在效率上有很大提升。此外，在24h时，4T1细胞中几乎没有发现纳米材料的聚集(图6c)，表明纳米材料在此时已基本排出细胞外。

(2)细胞摄取的普鲁士蓝实验

为了观察这些纳米颗粒的体外吸收特性，在4T1细胞上进行普鲁士蓝染色实验。如图7a所示，被细胞摄取的Fe以蓝色染色显示，其中FP组(40μg/mL)的摄取量最高(表现为灰色加深)，其次是FP(20μg/mL)、FP(10μg/mL)、Fe₃O₄(40μg/mL)、Fe₃O₄(20μg/mL)和Fe₃O₄(10μg/mL)。为了对细胞摄取材料的情况进行定量分析，随后使用ICP-MS检测细胞对Fe吸收的情况。

(3)细胞摄取量ICP-MS检测实验

通过ICP-MS测定细胞对不同组别的纳米材料的摄取量。在加入纳米球浓度为10，20和40μg/mL后，在4T1细胞中，Fe₃O₄组和FPD组Fe的含量分别为7.12±1.13和13.95±2.88，8.15±2.14和27.95±3.00，8.55±2.05和40.55±8.97(图7b)。结果表明，FPD组摄取Fe的量明显高于Fe₃O₄组(P<0.001)。

(4)细胞摄取的磁共振成像

不同组别纳米球处理后的4T1细胞磁共振成像结果如图8a所示，FP组细胞的T2信号强度明显低于Fe₃O₄组。随FP浓度增高，信号强度随之下降。另外还对T2信号强度的信噪比进行了定量分析(图8b)发现，100μg/mL浓度下，Fe₃O₄组(-10.12±1.21)与FP组间差异(-17.35±2.85)有统计学意义(P<0.05)；200μg/mL浓度下,FP组信号强度(-27.12±3.35)进一步下降。

3、FPD的体外治疗疗效检测

(1)Hoechst33342/PI双染实验

为了探究FPD对肿瘤细胞的体外治疗疗效，将不同组别的纳米材料(Fe₃O₄、FP、FD和FPD)与乳腺癌4T1细胞共孵育6h，然后按照试剂盒说明进行Hoechst33342/PI荧光双染，进而获得4T1细胞的荧光图像。用Hoechst 33342/PI处理后，正常细胞染成均匀的弱蓝色，而凋亡细胞表现为亮蓝色荧光并伴有细胞核的凝聚。与此同时，坏死细胞表现为亮红色荧光。在图9a中，Fe₃O₄组(存活率95％～97％)和FP组(存活率95％～97％)细胞呈弱蓝色荧光状态(灰度图表现为亮度低，检测到的颗粒数量少)，且两组间细胞存活率无明显统计学差异(P>0.05)(图9b)，这也证实了Fe₃O₄本身对细胞活力无明显影响作用，生物安全性较好。而FD组和FPD组表现为亮红亮蓝荧光状态(灰度图表现为亮度高，检测到的颗粒数量多)，且FPD组存活细胞的的比例(存活率30％～50％)明显少于FD组(存活率40％～55％)，两组间有显著的统计学差异(图9b)。Hoechst33342/PI荧光双染的结果表明，FD、FPD对肿瘤细胞有明显的杀伤作用，且靶向组FPD杀伤作用明显高于非靶向组FD，能较大程度杀伤肿瘤细胞。

(2)活性氧染色实验

为了进一步定量评价体外DOX的治疗疗效，使用DCFH-DA探针按照说明进行ROS染色后，用荧光显微镜观察细胞。对相同范围的视野下发射波长为488的荧光信号强度进行定量。结果表明，Fe₃O₄组和FP组镜下未见明显ROS阳性细胞(图9c)，说明两组材料均未对4T1细胞造成明显的损伤。FD组和FPD组纳米材料镜下观察到的ROS荧光信号强度有明显的组间差异(P<0.05)，FPD组ROS信号强度(比高于FD组(图9d，相比于对照组的变化倍数＝3.200±0.5657)，进一步说明了PD-L1的靶向作用提高了材料靶向4T1肿瘤细胞的效率。

五、[email protected]₃O₄-DOX纳米球免疫联合化疗在乳腺癌小鼠模型中的研究方法

1、实验试剂及耗材

10％戊巴比妥、10％多聚甲醛：山东大学齐鲁医院，济南；伊红、苏木素染液：Solarbio公司，北京；4T1细胞：中乔新舟生物科技有限公司，上海；1640培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)：Gibio公司，美国；75％医用酒精：北京贞玉民生药业有限公司，北京；PD-L1抗体(clone 10F.9G2))：Bioxcell公司，美国；抗组织包埋盒、载玻片、盖玻片：江苏世泰有限公司，南通；病理切片刀：FEATHER公司，日本；小鼠尾静脉固定器：玉研科学仪器有限公司，上海；TUNEL试剂盒、DAPI：碧云天生物技术有限公司，上海；IV胶原蛋白酶：力敏实业有限公司，上海；普鲁士蓝染色试剂盒：索莱宝科技有限公司，北京；PCR反转录及扩增试剂盒：全式金生物技术有限公司，北京。

2、细胞培养及一般处理(见上文“细胞毒性检测过程”中细胞的培养方法)

3、4T1结直肠癌小鼠模型的构建及分组治疗

(1)小鼠的饲养

25只SPF级的Balb/c雄性小鼠4～5周龄,体重约20g，购于北京华阜实验动物技术有限公司，饲养于齐鲁医院动物实验室鼠房，饲养条件：温度22℃，相对湿度50％，每天光照及黑暗交替各12h，供应SPF级饲料及饮水，每周更换2次垫料，每3天称重一次。

(2)荷瘤小鼠模型构建

细胞种植：4-5周龄Balb/c雄性小鼠饲养约1周(约20g左右)，待其适应饲养环境后接种细胞。首先用剃毛器将小白鼠右后背毛发剃光。提前将细胞进行消化、离心并用PBS吹打成细胞悬液后收集在15mL离心管中，用1mL注射器将离心管的细胞悬液吹打均匀，并吸取全部细胞悬液，按约1×10⁷/只200uL细胞悬液皮下接种于小白鼠右后背(注意不要进针过深以免注射到肌肉组织内)，注射后注射部位局部出现明显皮丘。

模型鼠的成瘤情况：观察模型鼠肿瘤的生长情况，每3天用电子天平秤量并记录小白鼠的体重；用游标卡尺测量并记录肿瘤的长、短径，并计算肿瘤体积(体积＝(长径×短径²)/2)，当肿瘤体积达80mm³时表明模型构建成功(大约5～7天)，可进行后续的动物实验。

(3)模型鼠的分组、编号及治疗方案

每只小鼠按照随机原则分为5组，每组各5只。各组分别:(1)PBS组，(2)Fe₃O₄组，(3)FP组，(4)FD组，(5)FPD组。各组纳米材料及PBS的注入剂量为5ml/kg。对模型鼠进行编号。用5种颜色的油漆记号笔(红、黄、蓝、黑、绿)分别标注5个分组，每组5只小鼠分别在左键、右肩、左后腿右后腿及头部进行标记。

治疗方案：

(1)PBS组：仅尾静脉注射相同剂量的PBS；

(2)Fe₃O₄组：尾静脉注射相同剂量的Fe₃O₄纳米材料；

(3)FP组：尾静脉注射相同剂量的FP纳米材料；

(4)FD组：尾静脉注射相同剂量的FD纳米材料；

(5)FPD组：尾静脉注射相同剂量的FPD纳米材料。

每三天测量一次小鼠体重、小鼠肿瘤体积，给小鼠注射不同组别的纳米材料或等量PBS，对各组小鼠进行磁共振成像，并记录小鼠的生存状况。当肿瘤体积达到2500mm³或者表现出拒食、体重明显减轻、消沉等痛苦表现时，出于人道主义将小鼠颈椎脱臼处死，记录颈椎脱日死亡及小鼠自然死亡的数据，绘制各组生长曲线。

4、FPD在小鼠体内的靶向成像研究

体内磁共振成像对FPD的肿瘤靶向效应进行研究

(1)将FPD组及Fe₃O₄组纳米材料，分别经尾静脉注射入小鼠体内，每只100μl，每组各5只。

(2)麻醉：在扫描前向模型鼠腹腔注射100uL 1％的戊巴比妥钠，待成功麻醉后将小鼠俯卧位置于磁共振成像小动物线圈内，异氟烷维持麻醉。

(3)定位：将小鼠有后背的肿瘤位于线圈中央，打定位线，定位成功后，进床至GE公司3.0T MRI的扫描位开始扫描。

5、FPD的生物安全性

为了研宄上述治疗对生物重要组织脏器有无毒性，在治疗第0、5、10、15天，分别处死3只小鼠，取其心、肝、脾、肾四个主要脏器做HE染色，观察其组织有无受损。

常规HE染色：

(1)烤片过夜后水化，依次在二甲苯脱蜡2次各10min；

(2)然后依次于无水乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，80％乙醇2min，75％乙醇2min，蒸馏水水洗3min；

(3)浸入苏木素染液10～15min；

(4)1％盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗5min；

(5)伊红染色3-5min,自来水冲洗5min；

(6)80％乙醇5min，95％乙醇2次各5min，无水乙醇2次各5min；

(7)二甲苯透明3次各2min；

(8)中性树胶封片，光学显微镜下观察。

6、FPD的体内毒性实验

(1)组织的TUNEL染色实验

为了更进一步研宄上述治疗在生物体内的效果，将不同治疗方式处理过的小鼠进行脱颈处死，肿瘤组织切片和主要器官用蛋白酶K溶液孵育15min，然后用TUNEL反应混合物共孵育。PBS洗涤三次后，用含有核染料DAPI的封闭液进行封片，用共聚焦激光荧光显微镜观察。

具体步骤：

1.用二甲苯浸洗2次，每次5min；

2.用梯度乙醇(100％、95％、90％、80.70％)各浸洗1次，每次3min；

3.用Proteinase K工作液处理组织15～30min在21～37℃(温度、时间、浓度均需摸索)或者加细胞通透液8min；

4.PBS漂洗2次；

5.制备TUNEL反应混合液，处理组用50uL TdT+450uL荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50uL荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100uLDNase 1，反应在15～25℃x10 min，后面步骤同处理组。

6.玻片干后,加50uL TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50uL荧光素标记的dUTP液)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h；

7.PBS漂洗3次；

8.可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450～500nm,检测波长为515～565nm)；

9.玻片干后加50uL converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min；

10.PBS漂洗3次；

11.在组织处加50～100uL DAB底物，反应15～25℃10min；

12.PBS漂洗3次；

拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。光学显微镜观察。

7、PCR检测组织凋亡

实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。本研究采用PCR的方法，通过检测三个凋亡相关基因Caspase3、Bax、Bcl-2来测定经过不同处理后的小鼠肿瘤及心肝脾肾等主要器官的凋亡情况。

(1)细胞/组织裂解：

将小鼠的组织及心、肝、脾、肾剪碎研磨，然后进行进行裂解。将各组不同组织分别迅速加入到1.5mL离心管中，加入1mL裂解液(Trizol)后利用组织破碎仪进行破碎，然后用移液枪反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，室温静置2min。

(2)12000rpm离心5min，弃去沉淀。

(3)按200uL氯仿/mL Trizo1加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。

(4)4℃12,000g离心15min。

(5)吸取上层水相，至另一离心管中。

(6)按0.5mL异丙醇/mL Trizol加入异丙醇(沉淀RNA)混匀，室温放置5-10min。

(7)4℃12,000g离心10min,弃上清，RNA沉于管底。

(8)按1mL 75％乙醇/mL Trizol加入75％乙醇(沉淀RNA)，温和振荡离心管,悬浮沉淀。

(9)4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。

(10)室温晾干或真空干燥5～10min。

(11)用50uL H2O溶解RNA样品，55～60℃,5～10min。

(12)测OD值定量RNA浓度。

(13)根据Takara反转录试剂盒的步骤进行去除DNA和反转录的实验。

(14)根据Takara PCR试剂盒的步骤进行实时荧光定量PCR的操作，应用AppliedBiosystems 7300/7500Real Time PCR System进行操作，引物序列见表1。

(1 5)反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量应用2-ΔΔCt的方法。

8、组织的PD-L1免疫荧光

为了进一步验证PD-L1作为靶点的可行性，在荷瘤4T1小鼠的肿瘤组织内同样做了PD-L1的免疫荧光实验。

具体步骤：

烤片：37℃1h，防脱片。PBS冲洗3次，每次5min。用卫生纸将上面的胶擦干净。

以下步骤参考第三部分细胞的PD-L1免疫荧光实验。

9、组织吸收纳米材料的普鲁士蓝染色

为了进一步验证体内吸收不同组别纳米材料的差异，对小鼠肿瘤组织同样做了普鲁士蓝染色。

具体实验步骤参考第三部分细胞的普鲁士蓝染色实验。

10、FPD的体内免疫治疗疗效

为了检测FPD体内治疗疗效，对小鼠的肿瘤组织进行了流式实验，通过检测CD3⁺CD8⁺T细胞在不同种治疗方式前后的数量差，从而测定不同治疗方式的疗效差异。

(1)按照流式样品要求制备单细胞悬液：将小鼠的肿瘤组织剪碎，呈尽量小的组织碎块，按不同组别分别放入六孔板内，加入足够覆盖组织碎块的IV型胶原酶，将六孔板放入37°细胞孵箱内待其充分消化(镜下可观察到组织被消化成单细胞悬液)。

(2)用去离子水按1:4稀释结合缓冲液(4mL结合缓冲液+12mL去离子水)。

(3)用4℃预冷的PBS洗细胞两次，用250uL结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×10⁶/mL。

(4)取100μL的细胞悬液于5mL流式管中，加入5μL anti-CD3抗体稀释液和anti-CD8抗体稀释液溶液。

(5)混匀后于室温避光孵育15min。

(6)适量流式染色液重悬，即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。软件分析结果。

六、[email protected]₃O₄-DOX纳米球免疫联合化疗在乳腺癌小鼠模型中的研究结果

1、小鼠体重、生存曲线及肿瘤体积

小鼠的治疗方案路线图如图10所示，将1×10⁷个4T1细胞接种BALB/c小鼠右肩，建立小鼠乳腺癌模型。荷瘤小鼠分为5组，分别给予不同的纳米材料和PBS治疗15天。

治疗后的各组小鼠及肿瘤图片见图11a。各组小鼠给药后每3天用游标卡尺测量肿瘤的长、短径，根据公式体积(mm³)＝0.5×长径×短径×短径，计算肿瘤体积。结果如图11b所示，PBS组、Fe₃O₄组、FP组及FPD组小鼠肿瘤体积随着观察时间的变化，肿瘤体积不断增大。在第15天时，FPD组肿瘤＝体积最小(186.4±38.0mm³)，与其他各组相比有统计学差异(P<0.05)。FD(1708.6±17.6mm³)组、FP(1935.2±80.7mm³)组次之，以Fe₃O₄组(1962.2±186.6mm³)和PBS组(2141.7±108.3mm³)肿瘤体积最大。

为了观察不同治疗组后续疗效，绘制了生存曲线(图11c)。可见FPD组小鼠比其他治疗组的生存率更高，能明显抑制肿瘤生长、延长小鼠生存天数。在第40天时，FPD组和FD组小鼠生存率分别为60％～65％和55％～65％，两组间没有统计学意义；到第60天，FPD组小鼠存活率为35％，其他各组小鼠都为0。另外，还记录各组小鼠的体重，如图11d所示，各组间并未见明显差异。

2、FPD在小鼠体内的靶向成像

为进一步研究FPD纳米材料的体内肿瘤磁共振靶向成像能力，在对4T1小鼠的皮下乳腺癌模型进行静脉注射FPD及Fe₃O₄后24小时内的不同时间点(1、4、8、24h)，获得T2WI扫描图像。如图12a和b所示，MRI显示肿瘤部位的Fe₃O₄和FPD两组均在注射探针后4h时(Fe₃O₄组：-42.1±2.8；FPD组：-65.5±3.3)达到最低值，但在FPD注射后4h可检测到肿瘤区的MRI信号有更明显的降低(P<0.001)，在注射探针24h后两组肿瘤均逐渐恢复到初始状态(Fe₃O₄组：-26.3±2.0；FPD组：-33.5±1.8)。以上结果与前期细胞成像的结果相符，支持FPD能够特异性靶向肿瘤，FPD在肿瘤部位汇聚比Fe₃O₄更多，可以作为良好的活体磁共振成像的探针，提高生物医学成像的精准度。

3、FPD的生物安全性

一般来说，具有高疗效和低毒性的纳米颗粒更适合用于肿瘤治疗。在本实施例和对比例中，小鼠体重被监测为系统毒性指标，在15天的治疗期间动态评估。不同治疗组的小鼠无明显体重减轻或异常行为。为了更进一步研究上述治疗对重要组织脏器有无毒性，在治疗过程中取四个时间点对FPD组小鼠的心、肝、脾、肾等主要器官进行了组织HE染色来检测有无受损，以治疗前小鼠作对照。如图13所示。各治疗组间小鼠的各器官组织切片与正常小鼠的器官组织切片无明显差异，也未发现组织坏死、纤维化等显的组织损伤或毒性作用。

4、FPD通过诱导细胞凋亡发挥疗效

实验使用TUNEL染色来标记凋亡细胞。经过不同治疗方式处理过的小鼠，其肿瘤组织的TUNEL染色结果如图14a所示，每个视野中，PBS组(13.7±5.8)及Fe₃O₄组(27±12.9)均未见明显阳性细胞，FP组(57.6±18.9)仅见少量阳性细胞，FPD组TUNEL染色阳性细胞数(234.1±32.8)最多，FD组(176.6±32.2)次之，如图14b所示。

为进一步检测各组纳米材料对于小鼠主要器官的损伤，对其进行了TUNEL染色。如图15a所示，Fe₃O₄组各主要器官均未见明显损伤，说明Fe₃O₄纳米材料本身对生物组织无明显毒性；FD组主要器官的损伤明显大于FPD组，差异有统计学意义(P<0.05)(图15b)，此结果说明在PD-L1的主动靶向作用下，不仅大大提高了材料到达肿瘤细胞的效率，使其更精准的到达靶点位置，且明显降低了DOX对正常组织器官的损伤，这在研究中也是非常重要的一点。

另外，采用实时荧光定量PCR的方法对肿瘤及主要器官的三个凋亡相关基因(Bax，Bcl-2和Caspase-3)进行了检测，结果与前面TUNEL实验相符，对于肿瘤组织，Fe₃O₄凋亡相关基因表达水平较低，FD组凋亡基因表达水平较于FPD组低(图16)。对于主要器官，如图15a所示，FD组心脏的凋亡情况尤其严重，可见DOX有明显的心脏毒性，但FPD组心脏及其他器官的凋亡情况明显降低，再次说明了FPD的主动靶向大大减少了DOX对主要器官组织的杀伤，从而保护了靶点外的正常组织。

5、FPD通过免疫治疗发挥疗效

(1)肿瘤组织PD-L1的免疫荧光

为了检测肿瘤组织PD-L1的表达情况，进行了组织切片的免疫荧光染色，结果表明了4T1肿瘤组织内PD-L1同样有广泛表达(图17a)，这和前面细胞PD-L1的表达情况一致，再次验证了PD-L1作为靶点的可行性。

(2)肿瘤组织的普鲁士蓝染色

为了进一步检测肿瘤组织对材料的吸收情况，对肿瘤组织切片进行了普鲁士蓝染色(图17b)，Fe₃O₄组(图17b左)与FPD组(图17b右)有明显差异，Fe₃O₄组肿瘤组织内未见明显蓝染，FPD组肿瘤组织内则有大量的材料被吸收。结果表明主动靶向的材料能够更精准的到达肿瘤并对肿瘤有很好的杀伤作用。

(3)肿瘤组织的CD3⁺CD8⁺T细胞检测

为了检测FPD的体内免疫治疗的疗效，对肿瘤组织进行了标记CD3⁺CD8⁺T细胞的流式实验。结果如图18a所示，经过治疗后的FD组(10％～15％)小鼠肿瘤组织内的CD3⁺CD8⁺T细胞，较Fe₃O₄组(9％～12％)有明显的增多，说明化疗对于促进了免疫系统的激活起到了一定作用，定量图说明各组间差异有统计学意义(P<0.05)(图18b)。经过FPD治疗后的小鼠肿瘤组织内的CD3⁺CD8⁺T细胞(19％～28％)增多更为明显，此结果表明，一方面PD-L1主动靶向作用提高了材料的利用率，另一方面PD-L1的免疫治疗与化疗在联合且协同的作用下，更进一步提高了疗效，达到了事半功倍的效果。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。