双重miRNA引发的万能钥匙-药物递送系统其构建方法和应用
阅读说明：本技术 双重miRNA引发的万能钥匙-药物递送系统其构建方法和应用 (Dual miRNA (micro ribonucleic acid) -triggered universal key-drug delivery system as well as construction method and application thereof ) 是由 叶素娟 马龙飞 李荣华 张纪华 于 2021-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种双重miRNA引发的万能钥匙-药物递送系统其构建方法和应用,包括金纳米笼、荧光性化疗药物和DNA架桥式纳米锁,荧光性化疗药物装载在金纳米笼孔腔内,DNA架桥式纳米锁与金纳米笼表面结合封堵金纳米笼孔腔,所述DNA架桥式纳米锁由SH-修饰的长链DNA S1、SH-修饰的长链DNA S2、具有Mg～(2+)酶结构的组成序列的长链DNA S3和具有Mg～(2+)酶识别序列的长链DNA S4构成,S1和S2通过金硫键与金纳米笼表面结合,S3与S1部分碱基互补连接,S4两端分别与S1和S2自由端碱基互补连接。其利用细胞内源性物质Mg～(2+)依赖性的DNA酶循环剪切反应,执行万能钥匙可以打开多个锁功能,药物在癌细胞中靶向增强释放,实现探针的信号放大诊疗功能。(The invention discloses a universal key-drug delivery system triggered by double miRNAs (micro ribonucleic acids), a construction method and application thereof, wherein the universal key-drug delivery system comprises a gold nano cage, fluorescent chemotherapeutic drugs and a DNA bridging nano lock, the fluorescent chemotherapeutic drugs are loaded in a pore cavity of the gold nano cage, the DNA bridging nano lock is combined with the surface of the gold nano cage to block the pore cavity of the gold nano cage, and the DNA bridging nano lock consists of SH-modified long-chain DNA S1, SH-modified long-chain DNA S2 and Mg 2+ Enzyme structureThe long-chain DNA S3 having the composition sequence of (A) and having Mg 2+ The long-chain DNA S4 of the enzyme recognition sequence is composed of S1 and S2 which are combined with the surface of the gold nano cage through gold-sulfur bonds, S3 is complementarily connected with partial basic groups of S1, and two ends of S4 are complementarily connected with free basic groups of S1 and S2 respectively. It utilizes the endogenous substance Mg of the cell 2+ The dependent DNase circular shearing reaction is adopted, a universal key is executed to open a plurality of lock functions, the medicine is released in a targeted and enhanced manner in cancer cells, and the signal amplification diagnosis and treatment function of the probe is realized.)
技术领域
本发明属于肿瘤诊疗技术领域，尤其涉及一种双重miRNA引发的万能钥匙-药物递送系统其构建方法。
背景技术
近年来，伴随着纳米技术的出现和快速发展，一系列具有特殊物理化学性质的功能化纳米材料被不断开发出来，纳米探针和纳米药物具有巨大的比表面积，能可控修饰多种配体分子，通过配体-受体相互作用高效跨越体内屏障，特异性结合病变细胞，纳米载体可同时装载成像分子和治疗药物，通过实时成像观测药物在体内的分布和代谢，实现成像引导下的精准治疗。同时，作为功能化核酸材料，核酸适体和DNA酶等则因分子量小、免疫原性低、易化学合成与标记等诸多优势而在肿瘤诊断与治疗领域中获得了重要关注，为发展具有在复杂体系中高效靶向能力的“诊疗一体化”多功能探针提供了一种理想的分子识别元件。
孔德明教授构建了DNA适体靶向纳米载药探针，将可嵌插药物的富含CG的DNA链和多重核仁素适体AS1411组装到金纳米粒子表面，通过协同的多重识别核酸蛋白的适配体单位，探针可进入细胞内释放药物发性释放。唐波课题组构建了一种基于环糊精(a-CD)的金/DNA纳米机器的靶向性光动力学治疗平台，肿瘤微环境的低pH值触发a-CDs的释放，通过互补碱基进一步导致DNA自组装配对致使纳米金聚集，光声信号和光热效应也被激活，从而实现肿瘤靶向光声成像和光照疗法。裴浩课题组制备了以金纳米粒子为模板的DNA水凝胶靶向药物递送系统(Drug delivery system,DDS)，利用杂交链式反应形成DNA水凝胶。通过细胞内ATP与适体的特异性结合，引发结构改变和药物释放。其抗癌活性在小鼠体内得到了证实。
尽管如此，由于活体内背景信号影响较大，环境较为复杂，目前发展的DNA诊疗体系在以下几个方面有待提高：
(1)诊疗探针的稳定性易受体内复杂环境因素的影响，例如核酸探针易降解和发生结构变化，易出现假阳性或假阴性结果。
(2)相比单一治疗模式，多模式综合治疗有更为显著的治疗效果，然而多模式治疗的最佳效果取决于同时使用，而不是连续使用多种治疗方法。然而这些治疗方法很难被集成在单一的纳米探针结构中同时实现。
microRNA(miRNA)是一类小的非编码RNA，在调节主要的生物和生理过程中发挥关键作用，包括细胞周期调节，增殖，分化，凋亡，干细胞维持和器官发育。癌症往往伴随着这些微小分子的失调。例如，miRNA21和miRNA155都在乳腺癌细胞中高度表达。而这些含量丰富的miRNA可以应用于引发药物特异性释放。
金纳米笼(AuNCs)具有中空的内层和超薄的多孔壁，比表面积大，孔容大，孔径可调，具有良好的生物相容性和光热特性。如果以AuNCs为药物载体，有效负载抗癌药物，药物负载系统将实现化学药物与光热疗法的癌症综合治疗，增强肿瘤治疗效果。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种双重miRNA作为万能钥匙引发，细胞内源性物质Mg2+酶辅助药物释放的金纳米笼载药系统，用于肿瘤靶向性治疗与光热治疗相结合的癌症治疗，以解决传统化学治疗方法精准性差，效果差，副作用大的问题。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
双重miRNA引发的万能钥匙-药物递送系统，包括金纳米笼、荧光性化疗药物和DNA架桥式纳米锁，荧光性化疗药物装载在金纳米笼孔腔内，DNA架桥式纳米锁与金纳米笼表面结合封堵金纳米笼孔腔，所述DNA架桥式纳米锁由SH-修饰的长链DNA S1、SH-修饰的长链DNA S2、具有Mg2+酶结构的组成序列的长链DNAS3和具有Mg2+酶识别序列的长链DNA S4构成，S1和S2通过金硫键与金纳米笼表面结合，S3与S1部分碱基互补连接，S4两端分别与S1和S2自由端碱基互补连接。
具体地，S1 DNA序列为：
SH-ACCCCTATCACGATTAGCATTAATCAACATCAGTCTGATAAGCTACTGTCTAATGGCCAAT，
S2 DNA序列为：
GCTTAAATACGATTGTTAGTCTATTGGTCGTGATCCTGTTAAATTTGGCCTCAATTGCGCT-SH，
S3 DNA序列为：
ATCAGACTGATGTTGAGATATCCTGGATCAGCGATTAACCAGGTTACACCCATGTCCACGGCATTCGTTAATGCTAATCGTGA，
S4 DNA序列为：
CAATCGTATTTAAGCCGAATGCCGTGGTrAGGATCCAGGATATCATTGGCCATTAGACAG。
双重miRNAs作为万能钥匙介导的1：N扩增的药物递送系统，用于抗癌药物Dox在MCF-7细胞中的靶向释放和对乳腺癌的早期治疗。如原理图所示，这种药物递送系统以金纳米笼为药物载体和光热转换器，金纳米笼表面的DNA链S1-S4组装构成DNA纳米桥锁。当Dox进入金纳米笼后，DNA纳米锁通过共价金硫醇键固定在金笼表面以封堵金笼表面的孔洞，从而形成了药物递送系统AuNCs/[email protected]。当AuNCs/[email protected]通过内吞作用进入癌细胞时，S1链与MCF-7中特有的高度表达的miR-21和miR-155同时碱基互补配对，原本与S1链结合的S3链被置换下来，游离的S3链特异性识别S4链并与之结合，形成依赖Mg2+的DNA酶结构(Mg2+酶)。当细胞内源性物质Mg2+存在时，形成的DNA酶切割S4链上的特定识别位点(一条含rA的DNA链)。然后，S3链与S4链断开后被释放活化，DNA纳米锁被打开，释放出抗癌药物Dox。同时游离的S3链可以再次与未被DNA核酸酶切断的S4链杂交，从而再次打开其他的DNA纳米锁，即触发细胞内源性物质Mg2+依赖性的DNA酶循环剪切反应，导致大量AuNCs包裹的Dox的释放，提高了药物释放效率。我们所设计的药物递送系统AuNCs/[email protected]在疾病诊断治疗领域有望降低药物使用量，减少对人体的伤害。同时利用金笼的光热性能对治疗部位进行近红外照射，实现化学-光热协同治疗，增强治疗效果。
所述荧光性化疗药物为具有荧光性的化疗药物，包括但不限于阿霉素(Dox)、荧光喜树碱、抗肿瘤药物SN-38等。
双重miRNA引发的万能钥匙-药物递送系统的构建方法，具体包括以下步骤：
(1)、将金纳米笼与饱和盐酸阿霉素溶液混匀,随后将S1、S2的DNA混合溶液加入,并置于37℃下震荡过夜，在10000r/min离心20min，并分散于20μL去离子水，所述S1、S2的摩尔比为1:1；
(2)、将含有S3、S4的DNA的溶液与(1)步骤所得溶液混匀，37℃下震荡过夜，即将DNA架桥式纳米锁修饰到了金纳米笼表面，制备出万能钥匙-药物递送系统AuNCs/[email protected]，所述S3、S4的摩尔比为1:1。
所述双重miRNA引发的万能钥匙-药物递送系统在肿瘤诊疗中的应用。
DNA架桥式纳米锁(DNAbridge nanolock)将两种miRNA抑制剂加载并修饰到金纳米笼表面，封闭金纳米笼表面的孔洞。以双miRNA为键对，通过双miRNA作为万能钥匙触发DNA链迁移和自组装，触发细胞内源性物质Mg2+依赖的DNAzyme循环剪切反应可以打开多个锁。执行一把钥匙打开多重纳米锁的万能钥匙功能。
此外，在近红外(NIR)照射下，激活金笼将光能转化为热能杀死肿瘤细胞。从而实现荧光成像引导下的化学-基因-光热治疗。体内实验结果表明，所设计的DDS可作为诊断和治疗的有效药物。
采用荧光成像技术，合成有良好的载药和光热性能的纳米金属材料为载体，以DNA链为靶向配体进行可控自组装，制备新型的万能钥匙-药物递送系统(Master key-drugdelivery system,MK-DDS)，通过荧光光谱信号采集，观察药物载体在体内的靶向递送效果和特征分子的实时、原位成像分析；利用细胞内源性miRNA作为万能钥匙，循环打开封锁药物的DNA纳米锁，持续释放药物分子，结合近红外光源照射，产生光热效应，因此实现肿瘤细胞内特征分子的精确检测和双光谱成像指导的化学-光热综合增强靶向治疗。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)制备了一种新型金纳米笼载药系统(MK-DDS)，利用肿瘤细胞中过表达的双重miRNA为激活钥匙，可实现肿瘤组织中的精准释放，降低正常细胞的毒副作用。
(2)利用细胞内源性物质Mg2+依赖性的DNA酶循环剪切反应，执行万能钥匙可以打开多个锁功能，药物在癌细胞中靶向增强释放，实现探针的信号放大诊疗功能。
(3)将双重治疗模式协同于同一个纳米探针结构上，探针制备方法简单，可实现荧光成像指导的化学-光热协同综合治疗。
附图说明
图1为本发明涉及的万能钥匙-药物递送系统用于肿瘤诊疗的原理示意图。
图2为实施例1所述的银纳米立方(a和b)及金纳米笼(c和d)的透射电镜图以及紫外吸收光谱图。
图3为实施例1所述的金纳米笼药物递送系统的制备过程示意图。
图4实施例1中DNA架桥纳米锁的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征图。
图5实施例1中涉及的DOX、DNA、AuNCs和AuNCs/[email protected]的紫外表征图。
图6实施例1中AuNCs/[email protected]体外释放Dox的荧光监测图(a)和Dox累积释放图(b)。
图7为实施例1所述的AuNCs/[email protected]进入MCF-7/HepG2细胞后的荧光图像。
图8为实施例1中用培养液(a)、AuNCs/[email protected](b)、AuNCs+NIR(c)、AuNCs/[email protected]+NIR(d)处理的细胞凋亡图。
图9为实施例1所述的AuNCs/[email protected]的体内癌症治疗效果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
实施例1
1、设计DNA架桥式纳米锁探针及其涉及的DNA序列，具体序列信息见下表。
2、磷酸盐缓冲液(PBS)的配置
准确称取0.3581g Na2HPO4·2H2O和0.1560g NaH2PO4·2H2O，分别溶解后定容，制得盐溶液浓度皆为0.01M。pH计校准后，将二钠盐溶液倒入烧杯并插入电极，加入二氢钠盐溶液，少量多次搅拌混匀，pH计稳定至7.40，即得PBS缓冲液，置于棕色广口瓶，4℃下贮存。
3、金纳米笼载药系统AuNCs/[email protected]的构建
3.1金纳米笼(AuNCs)的制备
(1)使用电子天平准确称量0.03g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，溶于1.5mL溶剂，得20mg/mL的PVP溶液。准确称量0.0311g三氟乙酸银(CF3COOAg)，溶于0.5mL溶剂，得282mM的CF3COOAg溶液。准确称量0.0480g硝酸银(AgNO3)，溶于1.0mL溶剂，得282mM的AgNO3溶液。准确称量0.0084g硫氢化钠(NaSH)或0.0720g硫化钠(Na2S)，溶于5mL溶剂，得30mM的NaSH/Na2S溶液，后取出100μL溶于900μL溶剂，得3mM的NaSH溶液。准确移取25μL浓盐酸(HCl，质量分数为37％)，溶于5mL溶剂，得60mM的HCl溶液，后取出50μL溶于950μL溶剂，得3mM的HCl溶液。
将圆底烧瓶固定于集热式磁力搅拌器中，调节磁力搅拌油浴锅的转速为300r/min，温度为150℃。温度稳定后，移取5mL乙二醇于圆底烧瓶中，盖子斜盖，搅拌下预热1h。之后向圆底烧瓶中加入60μL的NaSH溶液，4min后加入0.5mL的HCl溶液、1.25mL的PVP溶液，2min后快速加入0.4mL的CF3COOAg溶液，反应20min，迅速取出置于冰水中快速降温。
温度降低后，使用丙酮(丙酮体积为反应液的两倍)冲洗反应液并于9000r/min下离心分离。移去上清液，产物用去离子水超声重分散并于10000r/min下离心分离30min，重复三次。将终产物超声分散至4mL超纯水中，最终得到银纳米立方，4℃下密闭避光保存。
(2)准确移取质量分数1％的氯金酸溶液200μL溶于10mL超纯水中。准确称量0.1g的PVP并定容至100mL，得1mg/mL的PVP水溶液。
将圆底烧瓶与球形冷凝管衔接后固定于智能磁力搅拌器上，将搅拌器温度设置为190℃并开启磁力搅拌，取5mL的PVP水溶液加入圆底烧瓶，加热回流至溶液微沸，加入1mL银纳米立方，混合液微沸10分钟后，将氯金酸溶液用注射泵以45mL/h的速率注入反应液中，直至反应液紫外吸收峰位于700-800nm。继续回流30min至溶液颜色稳定，关闭加热并保持磁力搅拌，缓慢冷却至室温。向反应液中加入氯化钠至饱和，9000r/min下离心30min，所得沉淀物用超纯水重分散，随后10000r/min下离心30min，重复三次，得到金纳米笼(AuNCs)。产物超分散于2mL去离子水中，4℃下密闭避光保存。
图2a为银纳米立方的透射电镜图，可以看出银纳米立方大小分布均匀，有明显的立方体棱角便于下一步合成金笼。从图2b可以看出制备的银纳米立方的紫外可见吸收光谱图在355nm处有明显肩峰，420nm处有明显特征吸收峰，最大吸收波长符合λmax＝1.212L(尺寸，nm)+379.1。这说明制备的银纳米立方体大小均一。图2c为通过透射电子显微镜观察制备的金笼的形态，如图所示，制备的金笼中部颜色较浅，说明内部中空，壁上透光说明有孔壁，TEM图表明成功制备了金纳米笼。如图2d所示，金笼的紫外可见吸收光谱在728nm处表现出明显的特征峰。结果表明，已经成功地制备了AuNCs。
3.2万能钥匙-药物递送系统(AuNCs/[email protected])的构建
如图3所示，取200μL制得的金纳米笼，与1mL 10-7M盐酸阿霉素溶液混匀并置于37℃下震荡过夜，随后将20μL 10-6M的S1、S2链DNA混合溶液加入，37℃下震荡过夜。将溶液10000r/min离心20min，并分散于20μL去离子水，将20μL 10-6M含有S3、S4链的溶液与上述步骤所得溶液混匀,37℃下震荡过夜，即将DNA架桥式纳米锁修饰到了金纳米笼表面，制备出万能钥匙-药物递送系统AuNCs/[email protected]。
图4为DNA架桥纳米锁的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征图；用聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA纳米锁的形成进行了表征。泳道a-d分别为S1-S4单链电泳带，泳道e为DNA链S1、S2和S4杂交后的纳米结构的电泳带，泳道f为DNA链S1-S4杂交反应后形成的DNA纳米锁的电泳带。泳道e明显在高碱基处存在明亮新带，说明纳米结构中含有S1、S2和S4，而泳道f在更好碱基处出现明亮条带，这证明封堵材料DNA纳米桥锁的成功制备。
图5为涉及的DOX、DNA、AuNCs和AuNCs/[email protected]的紫外表征图。通过Cary 50UV/vis-NIR分光光度计对AuNCs/[email protected]探针的形成进行了表征，其中，分别对DNA、Dox、AuNCs和AuNCs/[email protected]的紫外可见光谱进行了测量。如图所示，DNA、Dox和AuNCs的紫外光谱显示出DNA(～260nm)、Dox(～480nm)和AuNCs(～728nm)的紫外吸收光谱特征峰。AuNCs/[email protected]的紫外光谱包含了这些特征峰，而且与无任何修饰的AuNCs的紫外光谱相比略有红移，这些都说明了AuNCs/[email protected]探针的成功构建。
4、万能钥匙-药物递送系统的体外药物释放
将万能钥匙-药物递送系统样品分为4组，分别以下列条件处理：(1)50μLPBS溶液(25mM)和50μL MgCl2溶液(0.5mM)；(2)20μL miR-21(10-6M)，50μL MgCl2溶液和30μL PBS溶液；(3)20μL miR-155(10-6M)，50μL MgCl2溶液和30μL PBS溶液；(4)20μL miR-21，20μLmiR-155，50μL MgCl2溶液和10μL PBS溶液。反应一段时间后，以10000r/min离心20min，用荧光分光光度计测定上清液，监测Dox释放。
如图6a所示，在单一miRNA存在的情况下，药物释放较少，说明修饰在金笼表面孔洞的DNA纳米锁几乎是封闭的，因为Mg2+依赖的DNA酶的活性结构尚未形成。然而，如图6b所示，由于两种miRNAs的加入，AuNCs/[email protected]释放的药物随时间增加，因为DNA酶结构的形成打开了DNA纳米锁。重要的是，AuNCs/[email protected]探针中Dox的释放量随着时间的推移逐渐增加，药物递送探针的药物释放可能是连续的、长效的，这有助于维持药物在癌细胞中的有效浓度，降低药物成本，提高治疗效率。
5、细胞培养和裂解液的制备
本实验采用MCF-7细胞。将细胞以6×105个细胞/盘的密度接种在25cm2的细胞培养瓶中，以1640培养基(89％)、热灭活的牛血清(10％)和青霉素、链霉素双抗(1％)来配置细胞培养液，在37℃细胞培养箱(由5％二氧化碳和95％空气组成)中以配置的培养液来培育细胞。
三代后的细胞，用PBS清洗表面残余培养液，取0.5mL胰蛋白酶润湿细胞表面，置于37℃培养箱中消化2min，在显微镜下观察细胞变圆且有间隙，此时消化刚好。加入2.0mL培养液，将消化好的细胞用灭菌管吹散，制得细胞悬浊液。将制得的细胞悬浊液离心(1000rmp,5min)，并将细胞用PBS缓冲液清洗，用超声波细胞粉碎机破碎，弃掉上清液，沉淀物(包含细胞碎片、细胞器、蛋白等大分子物质)中加入不同浓度的miR-203溶液，即得不同浓度的细胞裂解液，4℃下保存。
5、万能钥匙-药物递送系统的细胞摄取
MCF-7/HepG2细胞通过胰酶消化，取两滴已消化为单细胞悬液的MCF-7/HepG2细胞于玻璃皿中，加入2.0mL培养液，置于无菌培养箱培养过夜，然后，用PBS清洗细胞，将万能钥匙-药物递送系统使用2mL培养基冲散加入玻璃皿中，孵育10分钟，1小时，2小时，4小时。
6、单个活细胞的荧光显微镜分析
本实验通过激光共聚焦显微镜(Leica，德国)获得荧光图像。选用40倍的目镜，激光器选用514nm，将玻璃培养皿置于荧光显微镜下，调节载物台，在视野中找到细胞，通过调节电压曝光率等找到清晰的细胞荧光图像，进行拍照。Dox的波长接受范围为565nm-605nm。
为了确认AuNCs/[email protected]是否能够有效地将抗癌药物Dox递送到MCF-7细胞中，将AuNCs/[email protected]与MCF-7细胞和HepG2细胞一同孵育不同的时间。如图7所示，HepG2细胞与AuNCs/[email protected]共同孵育4h后，细胞内仅观察到微弱的荧光信号，这是因为HepG2细胞中miR-155的低水平表达导致只有很少的DNA纳米锁被打开。与AuNCs/[email protected]孵育1h后，MCF-7细胞出现微弱荧光，2h后，细胞核与细胞质内均存在荧光，这是由于细胞内吞作用的不同步性引起的。随着AuNCs/[email protected]先后进入细胞，部分释放的Dox已进入细胞核，而其他释放的Dox还存在于细胞质中。孵育4h后，细胞中Dox的荧光增强且完全集中于细胞核位置，这可能是由于细胞内吞停止后，AuNCs/[email protected]完全把Dox释放后，Dox基本全部进入细胞核导致的。这些结果表明，药物递送纳米探针AuNCs/[email protected]可进入MCF-7细胞，并在靶向部位释放抗癌药物。此外，这个药物递送探系统还可以通过调换DNA纳米锁的序列来应用于其他肿瘤细胞。
7、细胞凋亡实验检测纳米探针能够杀死癌细胞的效果
对MCF-7细胞进行培养并用万能钥匙-药物递送系统进行处理。然后，通过胰蛋白酶化得到单细胞悬液。离心获得细胞，用冷磷酸盐缓冲盐水冲洗。把异硫氰酸荧光素(5μL)和碘化丙啶(5μL)加至每个样本进行染色，样品在室温下黑暗处放置10分钟。采用流式细胞仪(FACSCalibur,BD)分析AuNCs/[email protected]杀死癌细胞的效果。
为了评估AuNCs/[email protected]探针对MCF-7细胞的抑制效果，分别用培养液(空白对照)，AuNCs/[email protected]，AuNCs+NIR，AuNCs/[email protected]+NIR处理MCF-7细胞。如图8所示，分别是用培养液(a)、AuNCs/[email protected]在(b)、AuNCs+NIR(c)、AuNCs/[email protected]+NIR(d)处理的细胞凋亡图。可以看出，用AuNCs/[email protected]，AuNCs+NIR，AuNCs/[email protected]+NIR处理的细胞的凋亡率分别为34.76％、37.58％和71.98％。这些结果表明AuNCs/[email protected]释放的Dox与金笼的光热治疗均能有效地促使癌细胞凋亡，即化学疗法与光热疗法相结合显示出协同作用，能够更好地杀死癌细胞。
8、活体实验检测纳米探针的肿瘤治疗效果
将100μL的4T1细胞悬浮液(大约5×106个4T1细胞)皮下注射到雌性裸鼠的右腋下区域。10天后，将注射成功的小鼠随机分成6组(每组6个)，并分别这样处理：PBS(空白对照)、AuNCs、Dox、AuNCs+NIR、AuNCs/[email protected]、AuNCs/[email protected]+NIR。(每天一次皮下注射10mg/kg Dox当量)。在注射后6小时，近红外光照射肿瘤(0.8W/cm2,808nm,15min)。在近红外照射期间，通过光热相机记录肿瘤的局部温度变化。每次注射后，用游标卡尺测量小鼠的肿瘤直径并测量小鼠体重。再过十天后，把小鼠杀死，把肿瘤切出，通过比较肿瘤的大小来看AuNCs/[email protected]的治疗效果。
图9为不同治疗组下的小鼠体重变化记录(a)；小鼠肿瘤体积变化记录(b)；20天后肿瘤照片(c)；小鼠生存曲线(d)。如图9a所示，不同处理条件下小鼠的体重没有显著差异，说明AuNCs/[email protected]探针具有良好的生物相容性，对小鼠的身体损伤较小。如图9b所示，肿瘤内注射AuNCs对肿瘤体积几乎没有抑制作用，Dox组，AuNCs后近红外照射组对肿瘤体积都有不同程度的抑制作用，然而AuNCs/[email protected]后红外光照射组对于肿瘤的抑制效果是最好的，这说明我们的AuNCs/[email protected]能够使化学-光热协同治疗得到实现，可以更有效地抑制肿瘤。
第20天处死小鼠，把小鼠肿瘤剖出。如图9c所示，a-f组分别指的是PBS组、AuNCs治疗组、Dox治疗组、AuNCs后近红外照射治疗组、AuNCs/[email protected]治疗组、AuNCs/[email protected]后近红外照射治疗组，每组有三个数据。从不同治疗条件下的小鼠肿瘤大小可以明显的看出AuNCs/[email protected]后红外光照射组的小鼠肿瘤体积是最小的，即治疗肿瘤的效果是最好的。这个实验结果与在小鼠体内测量的数据基本一致。
对不同治疗条件下的小鼠寿命进行记录(每组六个小鼠)，并绘制了kaplan-meier生存曲线(图9d)。从图中可以看出，使用游离Dox、AuNCs+NIR和AuNCs/[email protected]治疗后小鼠的寿命有所延长，但是AuNCs/[email protected]+NIR治疗组的小鼠有了更长的寿命，这与肿瘤抑制结果一致。kaplan-meier生存曲线表明AuNCs/[email protected]探针具有更好的肿瘤治疗效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。